芒果露水斑病病原菌分離鑒定及其拮抗菌篩選

井敏敏,田亞琴,王潤菡,邵遠志

(海南大學(xué)食品學(xué)院,海南?？?570228)

芒果露水斑病病原菌分離鑒定及其拮抗菌篩選

井敏敏,田亞琴,王潤菡,邵遠志*

(海南大學(xué)食品學(xué)院,海南海口 570228)

目的:明確芒果“露水斑病”的病原菌,并對病原菌拮抗菌進行篩選,為病害的進一步防治提供理論基礎(chǔ)。方法:采用掃描電鏡觀察病果表皮狀況,通過組織分離法對發(fā)病樣品進行病原菌分離,采用平板對峙法對病原菌拮抗菌進行篩選,最后對病原菌及拮抗菌進行形態(tài)學(xué)以及分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果:明確“露水斑病”是由真菌引起,并鑒定為枝狀芽枝霉(Cladosporiumcladosporioides)。針對病原菌從芒果果園土壤中分離篩選出8株對其具有拮抗效果的菌株,其中細菌JS-8、酵母菌Y-1拮抗效果最為顯著(p<0.05),其抑菌圈直徑分別達15.17 mm、14.93 mm。經(jīng)形態(tài)特征、生理生化特征以及分子生物學(xué)將菌株JS-8、Y-1分別鑒定為唐菖蒲伯克霍爾德菌(Burkholderiagladioli)、漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)。結(jié)論:“露水斑病”主要由枝狀芽枝霉引起,唐菖蒲伯克霍爾德菌、漢遜德巴利酵母可作為該病害潛在生防菌株。

芒果露水斑病,病原菌,拮抗菌,鑒定,篩選

芒果(Mangifera indica.L)原產(chǎn)于印度以及馬來半島,屬于漆樹科芒果屬,具有很高的經(jīng)濟價值和營養(yǎng)價值,被譽為“熱帶果王”。芒果果肉細膩多汁、風味獨特、并且具有抗氧化、延緩衰老、抗癌、防治心腦血管疾病、去痰止咳、健胃止暈等保健功效[1]。我國芒果種植歷史悠久,現(xiàn)栽培地區(qū)主要有廣西、廣東、四川、云南、海南、福建、臺灣等地,成為芒果第二大生產(chǎn)國,但是病蟲害日趨嚴重,使果實商品率下降,嚴重威脅我國芒果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。近年來,海南芒果出現(xiàn)一種新的病害,在芒果表皮形成露水狀病斑,因其形態(tài)得名芒果“露水斑病”,該病多在陰雨天氣爆發(fā),并且在地勢低洼、通風不良、雜草眾多的果園更易發(fā)病,而且常用農(nóng)藥難以將其控制,嚴重影響果實外觀,情況嚴重時可造成整個果實呈現(xiàn)污漬狀,造成芒果商品價值大大降低,對果農(nóng)造成很大的經(jīng)濟損失,直接影響海南芒果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前對于該病害病原菌的分離鑒定、以及防治措施報道較少。目前,芒果生產(chǎn)上主要采用化學(xué)農(nóng)藥防治各類病害,由于化學(xué)農(nóng)藥的濫用,使得高殘留、污染環(huán)境等不利影響日益嚴重[3-4]。并且我國已明令禁止在果蔬、果樹、中草藥材、茶葉上使用的高毒性農(nóng)藥有19種[5],如甲胺磷(methamidophos)、對硫磷(parathion)、克百威(carbofuran)、涕滅威(aldicarb)。隨著國家對化學(xué)農(nóng)藥使用要求日趨嚴格,以及人們追求有機無公害食品和環(huán)境保護的意識日趨強烈,綠色環(huán)保的病蟲害防控措施成為研究的重點,生物防治受到了高度重視[6]。目前,生物防治主要包括:誘導(dǎo)果蔬提高自身抗病性,從植物中提取物抑菌物質(zhì)[7],篩選拮抗微生物來控制病原菌等。本研究從芒果“露水斑病”病果中分離鑒定了芒果“露水斑病”病原菌,并從芒果根系土壤中分離篩選出兩株對芒果“露水斑病”病原菌具有較好拮抗效果的生防菌株,期望為芒果“露水斑病”的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試果實:2015年3月至2015年5月,在海南昌江、三亞、樂東等芒果主要種植區(qū)分別采集典型發(fā)病果實各50個,同時采集健康芒果果實若干做為致病性測定用果;供試土壤:分別于2015年7月5日、7日在海南?？?、昌江芒果園各選取10株不同果樹采集根系離土表5～15 cm的土壤樣品共40份,用密封袋封存,做好標記帶回實驗室,保存于4 ℃冰箱內(nèi),用于拮抗菌的分離。培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH自然;牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 4 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL。

BCM-1000生物凈化工作臺 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司;FYL-YS-280L型恒溫箱 北京福意電器有限公司;NRY-211恒溫培養(yǎng)搖床 上海南榮實驗室設(shè)備有限公司;AL-204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;ZEALWAYGR60DA高壓滅菌器 廈門致微儀器有限公司;Nikon ECLIPSE Ci-s/Ci-L顯微鏡 南京衡橋儀器有限公司;HITACHI S-3000N掃描電子顯微鏡 蘇州瑞測精密儀器有限公司;HCP-2臨界點干燥儀 蘇州瑞測精密儀器有限公司;TG16KR臺式高速冷凍離心機 長沙東旺實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 病斑掃描電鏡的觀察 參照潘洵操[8]的方法,選取新發(fā)病的芒果果實用無菌水沖洗2～3次,在病斑處切取2 mm×2 mm的果皮組織,經(jīng)2.5% pH6.8的戊二醛于4 ℃下固定過夜,固定后的樣品于0.1 mol/L pH6.8磷酸緩沖液中清洗3次,經(jīng)系列乙醇逐級脫水,最后經(jīng)乙酸異戊酯置換。樣品于HCP-2型臨界點干燥儀進行干燥,用導(dǎo)電膠粘貼于樣品臺上,噴金后在HITACHI S-3000N電鏡下觀察拍照,以健康果實果皮為對照。

1.2.2 病原菌分離純化 采用常規(guī)組織分離法[9]。選取新發(fā)病的芒果果實,用75%的酒精進行表面消毒,隨后用無菌水沖洗3次,在無菌條件下切取病健交界處3 mm×3 mm組織塊,置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上,于28 ℃培養(yǎng)3～5 d,挑取菌落邊緣菌絲少量于PDA培養(yǎng)基中劃線純化,重復(fù)上述步驟,直至菌落單一。純化后的菌株保存于PDA斜面上,置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 致病性測定 采用科赫法則驗證[10]。選取健康、大小、成熟度一致的芒果,用75%酒精進行表面消毒,取于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)了3～5 d的病原菌,用無菌打孔器打成6 mm的病原菌圓片,小心地貼于芒果表面,每果接種3～5個,接種PDA培養(yǎng)基為對照,用無菌脫脂棉保濕2 d,置于28 ℃室溫下培養(yǎng),觀察發(fā)病情況,并計算發(fā)病率。

發(fā)病率(%)=接種發(fā)病點數(shù)/接種點數(shù)×100

1.2.4 病原菌鑒定

1.2.4.1 病原菌形態(tài)學(xué)特征觀察 將純化后的病原菌接于PDA培養(yǎng)基上28 ℃下培養(yǎng)3～5 d,觀察菌落特征,并采用插片法在顯微鏡下觀察菌絲、孢子以及孢子梗形態(tài)特征,參照《真菌鑒定手冊》進行初步鑒定[11]。

1.2.4.2 病原菌rDNA-ITS序列分析 病原菌DNA由Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)提取,采用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)與ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并委托上海生工生物工程股份有限公司進行測序。測序結(jié)果與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫進行對比。

1.2.5 拮抗菌分離純化 采用稀釋平板法以及平板劃線法在PDA培養(yǎng)基上對各地區(qū)土壤樣品中菌株進行分離純化,直至獲得單一菌落。

1.2.6 拮抗菌篩選 分離純化后的菌株與病原菌經(jīng)平板對峙[12]培養(yǎng)進行拮抗菌初篩,采用含菌平板抑菌圈測定法[13]對初篩有拮抗效果的菌株進行復(fù)篩,并采用十字交叉法測量抑菌圈直徑[14],每菌株做3次重復(fù)。

1.2.7 拮抗菌的鑒定 將細菌JS-8、酵母菌Y-1委托上海生工生物工程股份有限公司分別進行16S rDNA、rDNA-ITS序列測序分析,測序結(jié)果與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫進行同源性比對。并結(jié)合菌落形態(tài)特征、生理生化特性對拮抗菌株進行鑒定[15-16]。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理與分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics17.0軟件進行統(tǒng)計,并采用ANOVA進行Duncan多重差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病斑掃描電鏡觀察

從健康果皮以及病斑處果皮掃描電鏡結(jié)果看,健康芒果表皮細胞正常,大小、形狀不一的皮孔清晰可見,且果皮表面無異物(圖1A);發(fā)病芒果果皮表面生長大量菌絲,定殖于皮孔以及表皮傷口裂紋處,且發(fā)病越嚴重的果皮表面菌絲越濃密,由此可推斷芒果“露水斑病”由真菌引起,并且從(圖1B)中可以看出有菌絲延伸入皮孔,推測病原菌菌絲可能由皮孔及傷口侵入芒果表皮;病斑表皮局部可見真菌分生孢子梗(圖1C)及分生孢子(圖1D)。

圖1 健康與病果果皮的掃描電鏡觀察Fig.1 Observation of healthy and diseased fruit peel by SEM注：圖A為健康芒果表皮;圖B箭頭處表示病原菌入侵途徑; 圖C箭頭處表示病原菌分生孢子梗; 圖D箭頭處表示病原菌分生孢子。

2.2 病原菌致病性檢測及其鑒定結(jié)果

2.2.1 致病性檢測 本實驗從病果的病健交界處分離純化出10株不同真菌,采用科赫法則進行致病性驗證,發(fā)現(xiàn)接種J1號真菌的芒果5 d后果皮表面出現(xiàn)黑斑,與田間“露水斑”病癥類似,并且發(fā)病率達86.6%,而對照組發(fā)病率為0,并且取病斑處果皮組織按照1.2.2所述方法進行組織分離,分離出病原菌與J1號菌菌落形態(tài)一致,屬于同一種菌株,于是確定J1號菌為芒果“露水斑病”病原菌。

2.2.2 病原菌的形態(tài)特征 病原菌J1在PDA培養(yǎng)基上菌落近圓形(圖2E、F),生長速度緩慢,菌絲墨綠色,有隔膜,多分枝(圖2G);分生孢子梗多側(cè)生,直立或彎曲,頂端分枝或不分枝,具有隔膜,(20.56～83.91)μm×(2.99～5.02)μm。分生孢子鏈生,呈檸檬形、橢圓形或圓柱形,淡褐色,光滑,且具1～2個臍點,大小為(3.62～10.05)μm×(2.16～4.42)μm(圖2H)。根據(jù)病原菌形態(tài)特征,參考《真菌鑒定手冊》將病原菌初步鑒定為芽枝霉屬。

圖2 病原菌菌落形態(tài)以及菌體形態(tài)Fig.2 Photographs of colonies and cells of the C. cladosporioides注：圖E、F分別為PDA培養(yǎng)基上菌落正反面特征圖; 圖G為菌絲形態(tài)(×40);圖H為分生孢子形態(tài)(×40)。

2.2.3 病原菌rDNA-ITS序列分析 將病原菌基因組DNA進行PCR擴增,擴增結(jié)果如圖3所示,擴增片段為500～600 bp,經(jīng)測序獲得534 bp的核苷酸序列,通過在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast同源性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株與Cladosporiumcladosporioides(KJ596320.1)的ITS序列同源性為100%。綜合形態(tài)學(xué)特征鑒定該病原菌為枝狀芽枝霉。

圖3 病原菌ITS區(qū)PCR擴增電泳圖Fig.3 PCR amplification of ITS sequence of the pathogen注：M為DNA Ladder Mix maker;1為J1的ITS擴增產(chǎn)物。

2.3 拮抗菌的分離及篩選結(jié)果

共分離純化出56株菌,通過平板對峙,得到14株對芒果“露水斑病”病原菌具有拮抗效果的菌株,占總分離菌株的25%,經(jīng)復(fù)篩后,從14株拮抗菌中篩選出8株拮抗效果好的菌株,其抑菌圈直徑見表1。其中菌株JS-8、Y-1對枝狀芽枝霉的拮抗效果明顯,抑菌圈直徑分別達15.17、14.93 mm。(圖4)。

圖4 拮抗菌在PDA平板上對枝狀芽枝霉的抑制效果Fig.4 Effects of antagonistic bacterium on C.cladosporioides in PDA medium

表1 拮抗菌株對病原菌的抑菌復(fù)篩結(jié)果

注：不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.4 拮抗菌的鑒定結(jié)果

拮抗菌JS-8為革蘭氏陰性桿菌、無芽孢,呈灰白色、邊緣光滑、濕潤、不透明、突起菌落,不產(chǎn)色素。拮抗菌Y-1為酵母菌,菌落白色、不透明、軟而平滑且粘稠,具有酵母發(fā)酵香氣,細胞呈球形或卵圓形,單個或成雙,出芽生殖。

分別對菌株JS-8、Y-1進行了部分生理生化實驗,主要對拮抗菌JS-8進行了接觸酶實驗、氧化酶實驗、檸檬酸鹽實驗、硝酸鹽還原實驗、丙二酸鹽利用實驗、甲基紅實驗、V-P實驗、吲哚實驗以及糖發(fā)酵實驗;對拮抗菌Y-1進行了糖發(fā)酵實驗、碳源同化實驗以及氮源同化實驗,其結(jié)果見表2。

表2 拮抗菌JS-8和Y-1的生理生化特征

注：+表示90%以上菌株陽性;-表示90%以上菌株表示陰性。

以JS-8、Y-1菌株的總DNA為模板,分別采用16S rDNA通用引物、rDNA-ITS通用引物進行PCR擴增,擴增結(jié)果如圖5,PCR擴增片段約為1400、600 bp,經(jīng)測序得知菌株JS-8的16S rDNA序列長1368 bp,Y-1的ITS序列長613 bp。分別將所得測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有序列進行Blast同源性分析,結(jié)果顯示菌株JS-8與Burkholderiagladioli菌株16S rDNA同源性為99%,菌株Y-1與Debaryomyceshansenii菌株rDNA-ITS序列同源性為99%。并結(jié)合菌落形態(tài)學(xué)觀察以及生理生化特征,分別將JS-8、Y-1鑒定為唐菖蒲伯克霍爾德菌、漢遜德巴利酵母。

圖5 拮抗菌JS-8、Y-1電泳圖譜Fig.5 PCR amplification of JS-8 and Y-1注：M為DNA Ladder Mix maker;1為Y-1;2為JS-8。

3 討論與結(jié)論

芒果“露水斑病”是海南省芒果產(chǎn)區(qū)危害最嚴重的病害,其發(fā)病迅速,多在雨季爆發(fā),并且一旦發(fā)病難以控制,該病害主要影響芒果外觀、形成污斑,嚴重降低商品價值,對整個海南芒果發(fā)展產(chǎn)業(yè)已造成一定影響,目前對該病害的報道還很少,同時對該病害還沒有有效的防治措施。本研究從海南省各芒果產(chǎn)區(qū)采集了發(fā)病樣本,利用掃描電鏡對比了健康果實與發(fā)病果實果皮之間的差異,發(fā)現(xiàn)發(fā)病果皮表面生長大量真菌菌絲,而健康果實未出現(xiàn)菌絲,從而確定該病害是一種真菌病害。并采用組織分離法對其病原菌進行分離,經(jīng)過科赫法則驗證,通過形態(tài)學(xué)以及分子生物學(xué)鑒定,確定J1號真菌為枝狀芽枝霉(Cladosporiumcladosporioides)。

目前芒果病害的防控大多采用化學(xué)殺菌劑,但隨著病原菌產(chǎn)生抗藥性,以及農(nóng)藥殘留對環(huán)境與人體造成危害,人們逐漸意識到生物防治的重要性[17-18],現(xiàn)有報道的細菌、酵母菌以及小型絲狀真菌對真菌病原菌具有拮抗作用[19-20]。目前報道較多的拮抗細菌主要是芽孢桿菌屬以及假單胞菌屬;具有生防能力的酵母菌已有40余種,主要是假絲酵母屬、畢赤酵母屬、隱球酵母屬、紅酵母屬以及梅奇酵母屬;小型絲狀真菌主要是木霉屬[21-22]。并且已有生物拮抗制劑得到商業(yè)化應(yīng)用,如殺菌劑Serenade(Agro Quess Inc.,USA)、殺菌劑Rhio-plus(KFZB Biotechnick,Germany)、生物拮抗菌產(chǎn)品Biosave(Eco Science Corporation,USA)以及生物拮抗菌產(chǎn)品Blight Ban A506(Nu Farm,Inc.,USA)[23],由此可見生防菌株有一定的應(yīng)用前景。目前對芒果病害拮抗菌研究主要集中于炭疽病、蒂腐病,對于芒果其他病害生防菌的報道較少,報道的拮抗菌主要是芽孢桿菌、季也蒙畢赤酵母、假絲酵母[24-26],而針對芒果“露水斑病”病原菌的拮抗菌還未有報道。本研究從芒果果園土壤樣品中分離出8株對芒果“露水斑病”病原菌具有拮抗效果的菌株,其中菌株JS-8、Y-1拮抗效果明顯,并分別鑒定為唐菖蒲伯克霍爾德菌、漢遜德巴利酵母。之前國內(nèi)外已有報道利用漢遜德巴利酵母作為生防菌株的研究,如Chalutz等[27]從檸檬果實上分離出漢遜德巴利酵母,并發(fā)現(xiàn)其對柑橘青、綠霉病以及酸腐病具有較好的控制效果;Droby等[28]從葡萄果實上分離出的漢遜德巴利酵母對柑橘綠霉病具有抑制作用;何秀娟等[29]報道漢遜德巴利酵母能有效防治芒果炭疽病以及蒂腐病。黃蓉等[30]發(fā)現(xiàn)漢遜德巴利酵母產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對草莓灰霉病的發(fā)病有顯著地抑制作用。此外漢遜德巴利酵母還可防治蘋果青霉病、桃酸腐病[31-32]。對于唐菖蒲伯克霍爾德菌作為生防菌的報道還很少,胡曉峰等[33]報道唐菖蒲伯克霍爾德菌對大麗輪枝菌、辣椒疫霉、立枯絲核菌以及煙草疫霉煙草變種具有一定的拮抗作用。但對于唐菖蒲伯克霍爾德菌、漢遜德巴利酵母兩種拮抗菌對芒果“露水斑病”病原菌的抑制作用是首次報道。因此,拮抗菌JS-8以及Y-1可以作為防治“露水斑病”的潛在生防菌株,并為該病的防治提供理論基礎(chǔ)。

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Isolation and identification of pathogen causing mango dew blotch disease and screening of its antagonistic microorganisms

JING Min-min,TIAN Ya-qin,WANG Run-han,SHAO Yuan-zhi*

(College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China)

Objective:The project aims to clarify the pathogen of the mango dew blotch disease,screen its antagonistic microorganisms in order to lay theoretical basis for the further prevention of the disease. Methods:Scanning electron microscope was used to observe the condition of the peel of diseased fruit. Conventional tissue separation method was applied to separate disease tissue. And the antagonistic microorganisms were screened by the flat-stand method. The pathogen and antagonistic microorganisms were identified in morphological and molecular biological methods. Results:It was found that mango dew blotch disease was caused by fungus.And the pathogen was identified as Cladosporium cladosporioides. Eight antagonistic strains againstCladosporiumcladosporioideswere isolated and screened from the soil in mango garden. The strain JS-8 and Y-1 showed the highest and most stable antagonistic effect(p<0.05). Results showed that the inhibition zone diameters were 15.17 mm and 14.93 mm. Based on morphological,physiological and biochemical characteristics,and molecular biological methods,JS-8 and Y-1 were identified asBurkholderiagladioli,Debaryomyceshansenii. Conclusions:Mango dew blotch disease was mainly caused byCladosporiumcladosporioides.BurkholderiagladioliandDebaryomyceshanseniican be used for potential biocontrol strains of Mango dew blotch disease.

mango dew blotch disease;pathogen;antagonistic microorganisms;identification;screening

2016-09-28

井敏敏(1990-),女，碩士研究生,研究方向:熱帶果蔬貯藏加工學(xué),E-mail:jingminmin2016@163.com。

*通訊作者:邵遠志(1969-),男,本科，教授,研究方向:果蔬病害防控與果蔬采后保鮮,E-mail:s.yz123789@163.com。

農(nóng)業(yè)部南亞熱作項目(14RZNJ-59);海南省重點研發(fā)計劃項目(ZDYF2016043)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)05-0163-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.022