MTT法與CCK-8法檢測兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞活性的比較研究

楊冬萍 楊曉旭 俞 洋,2* .寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2.回醫(yī)藥現(xiàn)代化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 740004

實(shí)驗(yàn)研究

MTT法與CCK-8法檢測兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞活性的比較研究

楊冬萍1楊曉旭1俞 洋1,2*
1.寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2.回醫(yī)藥現(xiàn)代化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 740004

目的：探討MTT法和CCK-8法對細(xì)胞活性檢測的最佳實(shí)驗(yàn)條件，并比較二者的優(yōu)缺點(diǎn)。方法：取傳至第5代的兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞為研究對象，分別用MTT試劑和CCK-8試劑檢測兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果：MTT法最佳檢測波長為570nm，最佳檢測時(shí)間在加入試劑后4h，細(xì)胞數(shù)量在1.25×103～2×104之間檢測較好；CCK-8法最佳檢測波長在450nm，最佳檢測時(shí)間在加入試劑4～6h，適宜的細(xì)胞檢測范圍為1.25×103～1×104。結(jié)論：MTT法較CCK-8法細(xì)胞檢測范圍更廣，孵育時(shí)間更短，是一種優(yōu)于CCK-8法的細(xì)胞活性檢測方法。

MTT；CCK-8；兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞；細(xì)胞活性

檢測細(xì)胞活性與增殖的方法有很多，如乳酸脫氫酶釋放法、臺盼藍(lán)拒染法、集落形成法、流式細(xì)胞儀法、熒光染色法、MTT比色法等，其中，MTT比色法自1983年Mosmann建立以來，由于其簡便、快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，成為定量檢測細(xì)胞生長和增殖的理想方法[1]。但由于MTT生成的產(chǎn)物Formazan為非水溶性的，需要有機(jī)溶劑(DMSO、異丁醇等)才能溶解，且在吸出培養(yǎng)液時(shí)可能會因操作不當(dāng)，丟失部分Formazan，導(dǎo)致結(jié)果可重復(fù)性差。針對MTT法的不足，研究發(fā)現(xiàn)了很多水溶性的四氮唑藍(lán)類：如XTT法[2]、MTS法[3]、Cell Counting Kit-8(簡稱CCK-8)法[4]等。本文以兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞為研究對象，探討MTT法和CCK-8法對細(xì)胞活性檢測的最佳實(shí)驗(yàn)條件，并對二者的優(yōu)缺點(diǎn)做一比較。

1 儀器與材料

1.1 儀器 E680酶聯(lián)免疫檢測儀(BIO-RAD公司)。

1.2 材料 MTT試劑(南京凱基批號：2016114)；CCK-8試劑(日本同仁化學(xué)，貨號：CK04)；DMSO(Aladdin，CAs Number:67-68-5)；第5代兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。

2 方法

2.1 最佳檢測波長和最佳孵育時(shí)間的確定 取對數(shù)生長期的兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化約3min，計(jì)數(shù)，以每孔細(xì)胞密度5×103個，接種于96孔板內(nèi)，每孔100μL的細(xì)胞懸液，每組設(shè)4個復(fù)孔，96孔板四周用PBS填充，以避免孔內(nèi)液體蒸發(fā)，放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。CCK-8組每孔加入10μL CCK-8試劑，放入培養(yǎng)箱孵育1、2、3、4、6h后，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔不同波長下的OD值；MTT組每孔加入50μL的MTT試劑，放入培養(yǎng)箱孵育1、2、3、4、6h后，吸出上清液，每孔加150μL的DMSO，避光搖床放置10min，用酶標(biāo)儀檢測各孔不同波長下的OD值。酶標(biāo)儀的內(nèi)置檢測波長均為405、450、490、570、590nm。

2.2 細(xì)胞數(shù)量與吸光度的關(guān)系 將對數(shù)生長期的兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，以0.25%胰蛋白酶消化約3min，低速離心，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，使每組細(xì)胞密度從高到低依次稀釋成2×104、1×104、5×103、2.5×103、1.25×103、6.3×102、3.1×102個/孔，接種于96孔板內(nèi)，每個濃度組設(shè)6個復(fù)孔，放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后，分別加入10μL CCK-8試劑和50μL MTT試劑，在酶標(biāo)儀上測量其OD值。

3 結(jié)果

3.1 最佳檢測波長的確定 如圖1、2所示，在檢測兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞活性時(shí)，MTT法和CCK-8法在不同的檢測波長條件下，OD值均變化明顯。其中MTT法在570nm波長處時(shí)，吸光峰值最高且最敏感；CCK-8法在波長450nm處時(shí)，吸光峰值最精準(zhǔn)。因此，實(shí)驗(yàn)中MTT法的最佳檢測波長應(yīng)選570nm處，CCK-8法的最佳檢測波長選擇450nm處。

3.2 最佳檢測時(shí)間的確定 如圖1、2所示，MTT法在1～4h孵育時(shí)間內(nèi)，表現(xiàn)為隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，OD值越來越高，呈上升趨勢，在4h時(shí)間點(diǎn)OD值達(dá)到最大，4～6h時(shí)段有下降趨勢；CCK-8法顯示：在1～6h不同孵育時(shí)間段內(nèi)，其OD值與培養(yǎng)時(shí)間表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系。因此，在檢測兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞活性時(shí)，MTT法的最佳檢測時(shí)間應(yīng)選擇在加入試劑孵育后的4h，CCK-8法的最佳檢測時(shí)間在加入試劑孵育后4～6h時(shí)間段都是可以的。

3.3 細(xì)胞數(shù)量與吸光度OD值的關(guān)系 由圖3可知，當(dāng)兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞數(shù)在3.1×102～2×104時(shí)，MTT法和CCK-8法均表現(xiàn)為隨著細(xì)胞數(shù)量的增多，OD值呈上升趨勢。其中MTT法細(xì)胞數(shù)在1.25×103～2×104之間時(shí)表現(xiàn)為良好的線性關(guān)系，CCK-8法適宜的細(xì)胞檢測范圍是1.25×103～1×104。

4 討論

MTT法原理是利用活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶，將MTT[3-(4,5Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，簡稱噻唑藍(lán)]還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)，而死細(xì)胞此酶消失，MTT不被還原。由于Formazan的生成量與活細(xì)胞數(shù)量及代謝活性有關(guān)，測定一定波長下光密度值(OD)的大小，可定量地反映活細(xì)胞數(shù)量及其活性的改變。研究表明，在一定的細(xì)胞濃度范圍內(nèi)，光密度值的大小與活細(xì)胞的數(shù)量成正比[5]。CCK-8法的實(shí)驗(yàn)原理與常規(guī)MTT法略有差異，CCK-8試劑中含有WST-8(水溶性四唑鹽)，其在電子載體(1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸二甲酯)存在的情況下，可被活細(xì)胞線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原成水溶性的橙黃色結(jié)晶，無需使用裂解液，也不需要吸棄培養(yǎng)液，可直接進(jìn)行比色。

實(shí)驗(yàn)探討了MTT法和CCK-8法檢測兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞活性的最佳實(shí)驗(yàn)條件，結(jié)果表明：MTT法最佳檢測波長為570nm處，最佳孵育時(shí)間為4h，結(jié)果與前人研究[6]相似，且不受細(xì)胞株的影響，合適的細(xì)胞檢測數(shù)量為1.25×103～2×104；CCK-8法最佳檢測波長為450nm處，最佳孵育時(shí)間為4～6h，適宜的細(xì)胞檢測范圍在1.25×103～1×104之間，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量少于1.25×103或高于1×104時(shí)，檢測結(jié)果均較差。說明MTT法和CCK-8法在檢測兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞活性時(shí)，MTT法較CCK-8法細(xì)胞檢測范圍更廣，孵育時(shí)間更短，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為穩(wěn)定。

近年來，Cell Counting kit-8試劑由于其生成產(chǎn)物具有高度水溶性，無需裂解液裂解沉淀，同時(shí)也不需要吸出培養(yǎng)液，對貼壁和懸浮細(xì)胞均適用，且檢測后的細(xì)胞可重復(fù)利用[7]，具有操作簡便、快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，普遍受到人們的青睞。但缺點(diǎn)是CCK-8試劑價(jià)格較為昂貴，且試劑顏色為淡紅色，與含有酚紅的培養(yǎng)液顏色極其相似，加入試劑之后不會立即顯色，因此很容易造成漏加或者多加，并且CCK-8試劑加入量很少，如果不小心沾到壁上，很可能會導(dǎo)致結(jié)果的可重復(fù)性不是很好。相比較而言，MTT試劑價(jià)格低廉，試劑顏色為黃色，加入即刻顯色，不容易產(chǎn)生漏加現(xiàn)象，缺點(diǎn)是步驟繁瑣，由于其生成產(chǎn)物為水不溶性的，需要有機(jī)溶劑(如DMSO、異丁醇等)才能溶解，DMSO不僅具有一定的細(xì)胞毒性[8]，且對人體也有一定的危害。此外，MTT法在溶解Formazan之前，需要先吸棄培養(yǎng)液，因此此法不太適用于懸浮細(xì)胞，這也造成了一定的局限性，而且在溶解產(chǎn)物Formazan這一步驟中，還有可能會因Formazan溶解不了或溶解不充分，造成一定的結(jié)果偏差。針對傳統(tǒng)MTT法的不足之處，研究人員又進(jìn)一步提出了改良的MTT法，可在不吸出培養(yǎng)液的情況下，通過添加一些有機(jī)溶劑如酸化SDS[9]、SDS-DMF酸性溶解液[10]等，可使Formazan直接溶解，并取得了不錯的效果。

自MTT法建立以來，不斷被改良，憑借其經(jīng)濟(jì)、數(shù)據(jù)穩(wěn)定、無放射性污染等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛用于細(xì)胞毒性試驗(yàn)[11]、生物活性因子的活性檢測[12]、腫瘤細(xì)胞藥敏檢測[13]、抗腫瘤藥物大規(guī)模篩選[14]等。而且目前針對細(xì)胞毒性的檢測，《美國藥典》中已采用MTT法進(jìn)行定量測定[15]。綜合比較發(fā)現(xiàn)，MTT法較CCK-8法應(yīng)用前景更為廣闊，且相信隨著MTT法的不斷改進(jìn)和完善，勢必會在實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域占據(jù)重要地位。

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Comparative Study on the Optimal Experiment Conditions between MTT Assay and CCK-8 Assay in Rabbit Retinal Pigment Epithelial Cell

YANG Dongping1YANG Xiaoxu1YU Yang1,2*

1.Traditional Chinese Medical College of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China；2.Key Laboratory of Ministry of Education to the Modernization of Hui Medicine Department, Yinchuan 740004，China

Objective To investigate optimal experiment conditions between MTT assay and CCK-8 assay in rabbit retinal pigment epithelial cells, and compare the advantages and disadvantages of the two methods.Methods Rabbit retinal pigment epithelial cells of the fifth generation were studied. The activity of rabbit retinal pigment epithelial cells were detected respectively with MTT reagent and CCK-8 reagent. Results For MTT assay, the best wavelength was 570nm, the best test was 4h after adding reagent, the number of rabbit retinal pigment epithelial cells within the range of 1.25×104～2×105; For CCK-8 assay, the best wavelength was 450nm, the best test was 4～6h after adding reagent, the suitable cell detection range is 1.25×104～1×105. Conclusion MTT assay is better than CCK-8 assay in the aspects of detection range and incubation time, and MTT is superior to CCK-8 in proliferation assay.

MTT ; CCK-8; Rabbit Retinal Pigment Epithelial Cells; Cell Activity

國家自然科學(xué)基金(項(xiàng)目編號：81360557)。

楊冬萍(1990-)，女，回族，碩士研究生在讀，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥對眼底病的防治。E-mail: 948319488@qq.com

俞洋(1973-)，男，回族，教授，博士，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥對眼底病的防治。E-mail: yaon999@126.com

R-332

A

1007-8517(2017)06-0031-04

2017-01-17 編輯：梁志慶)