HPLC法測(cè)定清熱顆粒中蘆丁的含量

張麗云 張建云.廣西柳州市中醫(yī)院，廣西 柳州 54500；.廣西金嗓子藥業(yè)股份有限公司，廣西 來(lái)賓 54600

HPLC法測(cè)定清熱顆粒中蘆丁的含量

張麗云1張建云2
1.廣西柳州市中醫(yī)院，廣西 柳州 545001；2.廣西金嗓子藥業(yè)股份有限公司，廣西 來(lái)賓 546200

目的：研究清熱顆粒中蘆丁含量和測(cè)定方法。方法：采用 HPLC 法分別對(duì)6個(gè)批次的樣品中蘆丁含量進(jìn)行測(cè)定。色譜法條件為ZORBAX SB-C18柱(200mm×4.6mm,5μm)，以甲醇-0.5%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,檢測(cè)波長(zhǎng)為 358nm，柱溫為 30℃。結(jié)果：蘆丁進(jìn)樣量在0.206～2.06μg范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系,平均回收率為99.86%，r=0.9994，RSD為1.17%(n=6)。結(jié)論：HPLC法簡(jiǎn)便、可靠、準(zhǔn)確，可用于清熱顆粒的質(zhì)量控制。

清熱顆粒; 蘆丁; 含量測(cè)定

清熱顆粒為廣西柳州市中醫(yī)院院內(nèi)制劑(批準(zhǔn)文號(hào)為桂藥制字Z02060094)，由桑葉、野菊花、紫花地丁、九里明、蒲公英、崗梅根六味藥組方，具有清熱解毒、抗菌消炎、清肝明目、疏風(fēng)散熱的功效，用于感冒發(fā)熱、目赤頭痛、上呼吸道感染，咽喉腫痛及各種疥瘡，臨床療效顯著。桑葉為?？浦参锷orusalbaL.的干燥葉，具有疏散風(fēng)熱、清肺潤(rùn)燥、清肝明目的功效，用于風(fēng)熱感冒、肺熱燥咳、頭暈頭痛、目赤昏花[1]。其含有黃酮類、生物堿類、苯丙素類、有機(jī)酸類、甾體及三萜類等多種化合物[2]。桑葉為方中君藥，蘆丁是其主要化學(xué)成分。為了更好的控制制劑的質(zhì)量，保證其療效，研究用高效液相色譜法測(cè)定清熱顆粒中蘆丁的含量。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；XS205Du分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；HH-S恒溫水浴鍋(江蘇金壇醫(yī)療儀器廠)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 材料 蘆丁對(duì)照品(批號(hào)：100080-201408，含量90.2%，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；清熱顆粒(批號(hào)：20160725、20160801、20160912、20161025、20161125、20161201，本院自制)；甲醇(色譜純，賽默飛世爾科技有限公司)；磷酸(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)。

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱定蘆丁對(duì)照品25.75mg于25mL容量瓶中，加甲醇溶解制成1.03 mg/mL的溶液，搖勻，精密量取1mL，移至10mL的容量瓶中，加甲醇溶解制成濃度為0.103mg/mL的對(duì)照品溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的配制 取10袋清熱顆粒內(nèi)容物，研細(xì)，混勻取約2g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加甲醇50mL，加熱回流30min，濾過(guò)，濾渣再用甲醇50mL，同法提取2次，合并濾液。減壓回收溶劑，殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.45μm濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性對(duì)照品溶液的制備 以相同的處方比例取除桑葉外的藥材，按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18柱(200mm×4.6mm,5μm)；流動(dòng)相：以甲醇為流動(dòng)相A，以0.5%的磷酸溶液為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫；流速：1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：358nm；柱溫：30℃。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系 取0.103mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣 2、5、7.5、10、12.5、20μL測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得蘆丁回歸方程:Y=2.0E+9X-1.3E+5，r=0.9994。結(jié)果蘆丁在0.206～2.06μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 梯度洗脫條件

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取0.103mg/mL 的蘆丁對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣 6次，每次20μL，以蘆丁峰面積為指標(biāo)計(jì)算精密度，得RSD=1.17%，表明精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取樣品2g，按“2.1.2”項(xiàng)下提取得供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10h進(jìn)樣。以蘆丁的峰面積為指標(biāo)計(jì)算穩(wěn)定性，RSD=1.08%，表明供試品溶液中蘆丁在 10h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取樣品 2g，按“2.1.2”項(xiàng)下提取得供試品溶液，分別進(jìn)樣6針，每針20μL，以蘆丁的峰面積為指標(biāo)計(jì)算重復(fù)性，RSD=0.92%，表明重復(fù)性良好。

2.3.5 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各20μL進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果供試品溶液中在與對(duì)照品溶液相同位置上具有同一保留時(shí)間的色譜峰，而陰性對(duì)照品溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

2.3.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品約1g，共6份，每份分別精密加入濃度為0.103mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液各0.6mL，按2015版《中華人民共和國(guó)藥典》方法操作[1]。以蘆丁峰面積為指標(biāo)計(jì)算加樣回收率。加樣回收率平均100.97%,RSD=0.79%，表明加樣回收率良好。

表2 蘆丁加樣回收率結(jié)果

2.4 樣品測(cè)定 精密稱取6個(gè)批號(hào)的樣品各適量，按供試品制備方法制備樣品溶液，在色譜條件下測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算蘆丁的含量。結(jié)果批號(hào)為20160725、20160801、20160912、20161025、20161125、20161201的樣品中蘆丁的含量分別為0.130mg/袋，0.152mg/袋，0.175mg/袋，0.128mg/袋，0.142mg/袋，0.126mg/袋，平均為0.142mg/袋。

3 討論

將蘆丁對(duì)照品的甲醇溶液在200nm～600nm 的范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，蘆丁在215nm、258nm、358nm 處出現(xiàn) 3 個(gè)吸收峰，考慮到在短波長(zhǎng)位置，處方中其它的組分干擾太大，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[1,3-4]，選擇358nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

研究還對(duì)含量測(cè)定中流動(dòng)相的條件進(jìn)行了考察，曾采用甲醇-水(40∶60)，甲醇-1%冰醋酸溶液(35∶65)及 甲醇-0.5%磷酸溶液(35∶65)作為測(cè)定條件，但峰出現(xiàn)拖尾。選用流動(dòng)相為甲醇-0.5%磷酸溶液進(jìn)行梯度洗脫[1]，分離效果好，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于3000，且陰性無(wú)干擾，故選擇本系統(tǒng)為流動(dòng)相。

在提取溶劑的選擇上，采用甲醇、乙醇、水作為提取溶劑，通過(guò)比較單一溶劑和混合溶劑，最后選定甲醇溶液作為最佳提取溶劑。考察了加熱回流提取時(shí)間的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加熱回流處理20、30、40min 差別不大，為了提取完全同時(shí)又節(jié)約時(shí)間，故選擇加熱回流提取30min為宜。

綜上，采用HPLC法測(cè)定清熱顆粒中蘆丁的含量，該方法簡(jiǎn)便、可靠、準(zhǔn)確，可用于清熱顆粒的質(zhì)量控制。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M]. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015:297.

[2]王曉靜，王元書，邱進(jìn)，等.桑葉化學(xué)成分研究 [J].食品與藥品，2007 (1) ：9.

[3]曾森，劉虹，張德芹，等.對(duì)市售桑葉藥材中蘆丁的含量調(diào)查[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，16(4)：77-78.

[4]郭玉，唐國(guó)濤，陳淑嫻，等．槐花米中蘆丁提取方法的比較研究[J].中成藥，2007，29(11):1675-1677.

Determination of Rutin Content in Qingre Granules by High Performance Liquid Chromatographic

ZHANG Liyun1ZHANG Jianyun2

1.Liuzhou City Hospital, Liuzhou 545001, China；2.Guangxi Golden Melody Pharmaceutical Company Limited, Laibin 546200, China

Objective To establish the method for determining rutin content in Qingre granules. Methods The rutin content was determined respectively by HPLC method in 6 batches of samples. With a ZORBAX SB-C18 column (200mm × 4.6mm,5μm),methanol-0.5% Phosphoric acid solution was used as the mobile phase for gradient elution.The detective wavelength was 358 nm and the column temperature was 30℃.Results The calibration curves of rutin showed that the linearity was completely acceptable between 0.206～2.06μg,The average recovery of rutin was 99.86%(r=0.9994),withRSDof 1.17% (n=6). Conclusion The HPLC method was simple, reliable, accurate and can be used for quality control of Qingre granules.

Qingre granules; Rutin; Content Determination

張麗云(1972-)，女，漢族，主管藥師，研究方向?yàn)獒t(yī)院藥學(xué)。E-mail：2672451016@qq.com

R284

A

1007-8517(2017)06-0029-02

2017-01-24 編輯：穆麗華)