降脂保肝顆粒藥材共提后人參皂苷類成分變化的初步研究

王仁廣 張蕊多 石 薇 王 暢 邱智東 賈艾玲長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,吉林 長春 130117

降脂保肝顆粒藥材共提后人參皂苷類成分變化的初步研究

王仁廣 張蕊多 石 薇 王 暢 邱智東 賈艾玲*
長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,吉林 長春 130117

目的：利用高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)(HPLC-Q-TOF-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)研究人參復(fù)方制劑降脂保肝顆粒中人參與山楂等藥材共提前后皂苷類成分的變化。方法：采用ZORBAX SB-Aq色譜柱(250mm×4.6 mm，5μm)，流動相以乙腈-水梯度洗脫，負(fù)離子模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，比較不同提取方法及配伍制備的共提液中皂苷類成分的變化趨勢。 結(jié)果：在pH小于3時，人參與山楂等不同配伍共提液中皂苷類成分水解，發(fā)生轉(zhuǎn)化，稀有皂苷的含量明顯增加。結(jié)論：在人參與山楂配伍提取過程中酸性對皂苷成分的影響較大，可為人參皂苷在酸性條件下更準(zhǔn)確的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

人參；山楂；高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜；共提取；人參皂苷

中藥復(fù)方配伍理論及變化規(guī)律是中醫(yī)藥理論研究的熱點。中藥復(fù)方療效的發(fā)揮與其中的活性成分或活性成分群的發(fā)揮作用密切相關(guān)。復(fù)方在發(fā)揮各藥藥理綜合作用的同時，多藥共提過程中不同物質(zhì)充分反應(yīng)，可能發(fā)生增溶及化學(xué)成分的變化，從而產(chǎn)生特殊的藥效活性。藥對，是指藥物間最基本的配伍形式，是組成方劑的基本要素，有時也是最簡單的方劑，其臨床應(yīng)用也一直被廣泛研究[1-5]。降脂保肝顆粒是白求恩醫(yī)科大學(xué)制藥廠聯(lián)合長春中醫(yī)藥大學(xué)與吉林大學(xué)共同研發(fā)的具有治療脂肪肝作用的中藥六類新藥。是由水飛薊、人參、山楂、丹參等四味中藥組成的復(fù)方制劑。人參是我國常用中藥之一，為五加科植物人參 (PanaxginsengC.A.Mey.) 的干燥根和根莖。人參的主要有效成分為人參皂苷類物質(zhì)，其中主要活性成分人參皂苷Rg1、Rb1、Re是《中國藥典》2015版規(guī)定的人參藥材含量測定指標(biāo)[6]。據(jù)文獻(xiàn)報道，人參皂苷低劑量對慢性肝損傷有一定保護(hù)作用，人參皂苷高劑量能明顯減少肝組織膠原的沉積，改善肝纖維化程度，具有抗肝纖維化作用[7-9]。山楂為藥食同源的植物，主要具有調(diào)節(jié)血脂、保肝、降壓、助消化等作用，應(yīng)用十分廣泛[10]。文獻(xiàn)報道，山楂有效成分主要有黃酮類、黃烷及其聚合物類、有機(jī)酸類、三萜類等[11]。其中山楂的黃酮類成分如金絲桃苷、熊果酸具有明顯的降低膽固醇、調(diào)節(jié)血脂的作用[12-13]。人參山楂配伍組方可以增強降脂保健作用。人參與一些中藥共煎后人參皂苷會發(fā)生變化。如人參與黃連共煎時，黃連提供的中堿性條件使人參皂苷類成分水解生成齊墩果酸型苷元[14-16]。本研究用高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-Q-TOF-MS/MS)聯(lián)用考察人參在與山楂共提過程中人參皂苷類成分的變化，為人參-山楂配伍組合的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent1260 高效液相色譜儀；Agilent 6520Q-TOF 質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)；TG328A(S)分析天平(北京斯達(dá)恒通科技有限公司)；TP-150 超聲波清洗機(jī)(天鵬電子新技術(shù)有限公司)；真空干燥箱(上海-恒實驗儀器總廠)。

1.2 材料 人參、山楂、水飛薊、丹參均購自于吉林國安藥業(yè)有限公司，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源與鑒定教研室翁麗麗教授鑒定，分別為五加科植物人參 Panax ginseng 的干燥根；薔薇科植物山楂CrataeguspinnatifidaBge.的干燥成熟果實，；菊科植物水飛薊Silybummarianum(L.)Gaertn.的干燥成熟果實；唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖。人參皂苷Rg1、Rb1、Re對照品(批號分別為110703-201529、110704-201424、110754-201525)。無水乙醇為分析純(北京化工廠)；乙腈、甲酸均為色譜純(美國Thermo Fisher公司)；水為純凈水(娃哈哈公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 液質(zhì)-聯(lián)用(LC-MS)條件

2.1.1 色譜條件 選用ZORBAX SB-Aq色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按表1中的程序進(jìn)行梯度洗脫，進(jìn)樣量10μL，流速1mL /min。

表1 高效液相色譜洗脫梯度條件

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(electronic spray ion, ESI)；負(fù)離子檢測模式；噴霧器壓力為207 kPa；干燥氣(N2)流速：10L/min；干燥氣溫度：350℃；毛細(xì)管電壓：3500V；碎裂電壓：175 V；錐孔電壓：65V；質(zhì)量檢測范圍：300～1400m/z。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 降脂保肝顆粒 稱取降脂保肝顆粒適量，研細(xì)，取粉末1g，精密加入10mL石油醚(60～90℃)，超聲處理(功率250W，頻率40kHz)30min，濾過，棄去濾液，藥渣揮干溶劑，精密加入10mL甲醇，超聲處理30min，濾過，取續(xù)濾液，過0.22μm微孔濾膜，即得。

2.2.2 人參單煎液 稱取人參藥材10g，水煎1h，藥液過濾之后加醇使之含醇量達(dá)到75%，過濾，過0.22μm微孔濾膜，即得。

2.2.3 人參-山楂合煎液 稱取人參藥材10g與山楂藥材20g合并水煎1h，藥液過濾之后加醇使之含醇量達(dá)到75%，過濾，過0.22μm微孔濾膜，即得。

2.2.4 人參-山楂與醇提后的丹參-水飛薊藥渣合煎液 稱取人參10g,山楂20g，與醇提后的丹參藥渣15g,水飛薊藥渣10g合并水煎1h，藥液過濾之后加醇使之含醇量達(dá)到75%，過濾，過0.22μm微孔濾膜，即得。

2.2.5 人參-山楂超聲醇提液 稱取人參10g,山楂20g，用75%乙醇超聲提取(功率250W，頻率40kHz)，藥液過濾，過0.22μm微孔濾膜，即得。

2.2.6 人參-山楂與醇提后的丹參-水飛薊藥渣超聲醇提液 取人參藥材10g,山楂20g,醇提后的丹參藥渣15g,水飛薊藥渣10g，用75%乙醇超聲提取(功率250W，頻率40kHz)，藥液過濾，過0.22μm微孔濾膜，即得。

2.3 結(jié)果分析

表2 樣品pH值

樣品序號123456pH4.25.12.73.84.44.4

3 討論

研究降脂保肝顆粒工藝時，根據(jù)藥物成分的性質(zhì)等要求選擇水飛薊、丹參以乙醇提取，藥渣與人參、山楂合并水煎煮。由于人參是君藥，故前期考慮將人參皂苷作為制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制指標(biāo)，但由于山楂中含有酸性物質(zhì)，在煎煮過程中可能會對人參皂苷類成分的檢測產(chǎn)生影響，故通過實驗展開研究。

由圖1～6和表2可知，圖1降脂保肝顆粒樣品液質(zhì)聯(lián)用色譜中無Rg1、Re峰出現(xiàn)，其他樣品中，pH值對人參皂苷Rg1與Re的峰面積影響較大；圖2中，人參單煎可以檢出Rg1與Re；圖3即人參山楂合煎樣品的pH小于3，Rg1與Re的峰面積大幅度減少，但其中48～50min位置出現(xiàn)了一些稀有皂苷色譜峰，說明人參皂苷進(jìn)行了轉(zhuǎn)化；圖4中，加入的醇提后的藥渣共煎起到了一種緩沖體系作用，使藥液酸性強度減小，Rg1與Re轉(zhuǎn)化程度相對較小。圖5和圖6采用的超聲處理方法，pH均為4.4，Rg1與Re轉(zhuǎn)化程度較小。

人參與不同中藥配伍，煎煮液的pH 值會隨著配伍中藥的不同而改變，從而影響人參皂苷的溶出和種類的變化。當(dāng)pH小于3時，人參皂苷會進(jìn)行轉(zhuǎn)化。理論上在酸性條件下加熱，人參二醇型皂苷、人參三醇型皂苷、齊墩果酸型皂苷會發(fā)生轉(zhuǎn)化，生成人參二醇、人參三醇、齊墩果酸[17-19]。由實驗結(jié)果顯示出，藥液中Rg1、Re含量很低，幾乎全部轉(zhuǎn)化，但仍可在液質(zhì)聯(lián)用中檢測出。分析皂苷成分可能是在加入醇提液后濃縮、干燥過程中發(fā)生了變化。藥液在濃縮過程中受熱時間過長，加之酸性的影響，皂苷可能會轉(zhuǎn)化。但若嘗試在濃縮前調(diào)節(jié)藥液pH值，則會影響酸性有效成分的保留。因此，通過實驗研究得出，降脂保肝顆粒在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究時不建議將測定人參中的人參皂苷等指標(biāo)性成分列入標(biāo)準(zhǔn)。人參、山楂兩味中藥廣泛用于多種中藥復(fù)方中，具有協(xié)同作用。研究為人參與山楂配伍進(jìn)一步研究提供了一定的實驗依據(jù)，可以為中藥復(fù)方制劑分析、中藥組方原理研究及臨床治療藥物檢測提供一些理論參考。

[1]張榮，劉睿，黃天來，等. HPLC法研究當(dāng)歸-紅花單煎及共煎液中有效成分含量的變化[J]. 中藥新藥與臨床藥理，2009，20(5)：448-452.

[2]曾惠芳，蘇子仁，史俏蓉，等. 虎杖單煎、復(fù)方共煎過程中的物理化學(xué)變化初探[J]. 中國藥房，1999，10(3)：112-113.

[3]趙奎君，李卓明，陳小鶯，等. 從當(dāng)歸補血湯的研究探討和分析中藥復(fù)方共煎的合理性[J]. 世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2009，11(2)：294-297.

[4]蘇子仁，陳建南.中藥制劑工藝過程的物理化學(xué)變化研究[J]. 中國中藥, 1998, 24(11):671.

[5]王曼華，孫化萍，梁建衛(wèi). 經(jīng)方“藥對”配伍理論研究概況[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報， 2008， 10(1): 59-60.

[6]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(一部) [S]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：8-9.

[7]黎陽，張鐵軍，劉素香，等. 人參化學(xué)成分和藥理研究進(jìn)展[J]. 中草藥，2009，40(1)：164-165.

[8]馮彥. 人參藥理作用及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 中醫(yī)臨床研究，2013，5(6)：121-122.

[9]張彩，史磊. 人參化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J]. 食品與藥品，2016，18(4)：301-303.

[10]樓陸軍，羅潔霞，高云. 山楂的化學(xué)成分和藥理作用研究概述[J]. 中國藥業(yè)，2014，23(3)：92-93.

[11]吳士杰，李秋津，肖學(xué)鳳，等. 山楂化學(xué)成分及藥理作用的研究[J]. 藥物評價研究，2010，33(4)：316-317.

[12]陳佳，宋少江.山楂的研究進(jìn)展[J].中藥研究與信息，2005,7(7)：21-22.

[13]于蓓蓓，閆雪生，孫丹丹. 山楂藥理作用及其機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中南藥學(xué)，2015，13(7)：746-748.

[14]張千娥. 山楂大棗黃芪方治療慢性肝炎的臨床效果觀察[J]. 中藥材，2014，37(10)：1902-1903.

[15]王春蘭，劉婷，陳真麗. 山楂人參顆粒劑的制備及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J]. 中醫(yī)藥信息，2014，31(6)：56.

[16]單晨嘯，文紅梅，于生，等. UFLC /Q-TOF-MS 結(jié)合主成分分析法考察人參與黃連共煎前后人參皂苷類成分的變化[J]. 中國實驗方劑學(xué)，2015，21(1)：24-25.

[17]ZHANG X，WANG L N，SONG F R， et al. Study on the variation of chemical constituents during combination of ginseng with trogopteroum feces and semen raphani by high performance liquid chromatography mass spectrometry[J]. Chinese J Anal Chem，2007，35(4)：559-563.

[18]ZHANG Chunzhi，LI Dai，YU Hongshan，et al.Purification and characterization of picied-β-glucosi-dase from Aspergillus niger[J]. Process Biochem，2007，42(1)：83-88.

[19]QIAN Siri，YU Hongshan，ZHANG Chunzhi，et al. Purification and characterization of dioscin-alpha-L-rhamnosidase from pig live[J]. Chem PharmBull,2005，53(8)：934-937.

Preliminary Study on the Changes of Ginsenosides Before and After Co-extraction of Ginseng and Hawthorn in Jiangzhi Baogan Granules

WANG Renguang ZHANG Ruiduo SHI Wei WANG Chang QIU Zhidong JIA Ailing*

Pharmacy College,Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117,China

Objective To study the change of saponins before and after co-extraction of ginseng and hawthorn in ginseng compound preparation Jiangzhi Baogan Granules by high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (HPLC-Q-TOF-MS / MS). Methods Chromatographic separation was performed on a Zorbax SB-Aq column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) with a gradient elution of acetonitrile-water, and the mass spectrometry data were collected in the negative ion mode to compare the variation of saponins prepared in different extraction methods and compatibility. Results When the pH was less than 3, saponins in different compatibility of ginseng and hawthorn made a hydrolysis performance, along with the conversion,and the amount of rare saponins had increased significantly. Conclusion The effect of acidity on the saponin components in the process of co-extraction of Ginseng combined with Hawthorn and their compatibility is significant, which can provide a theoretical basis for the more accurate application of Ginsenosides in acidic conditions.

Ginseng;Hawthorn;High Performance Liquid Chromatography-quadrupole Time-of-flight Mass Spectrometry; Co-extraction;Ginsenoside

吉林省科技廳醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項資金項目(20130727003YY)。

王仁廣(1993-)，男，漢族，碩士研究生在讀，研究方向為中藥制劑。E-mail: 727736000 @qq.com

賈艾玲(1986-)，女，朝鮮族，講師，碩士，研究方向為中藥制劑。E-mail: 171265932 @qq.com

R284

A

1007-8517(2017)06-0025-04

2017-01-12 編輯：穆麗華)