布洛芬調(diào)控IKKβ/IκBα/NF-κB信號通路對肝癌細(xì)胞株增殖及凋亡的影響

南振華 潘靈輝 張維康

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科

布洛芬調(diào)控IKKβ/IκBα/NF-κB信號通路對肝癌細(xì)胞株增殖及凋亡的影響

南振華 潘靈輝 張維康

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科

目的 探討布洛芬調(diào)控IKKβ/IκBα/NF-κB信號通路對肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響。方法 選擇人肝癌QGY-7703細(xì)胞為研究對象，采用隨機(jī)數(shù)字表法將QGY-7703細(xì)胞隨機(jī)分為對照組（Qc組）和不同濃度布洛芬組，每組6例：Q1組（布洛芬作用濃度為250μmol/L）、Q2組（布洛芬作用濃度為500μmol/L）、Q3組（布洛芬作用濃度為1 000μmol/L）、Qc組加入等容量的RPM I-l640培養(yǎng)基。各組分別孵育24 h、48 h和72 h時，采用CCK-8法測定不同濃度及不同孵育時間細(xì)胞的增殖抑制情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況；孵育48 h時，采用實(shí)時熒光定量PCR和Western blot檢測各組細(xì)胞中IKKβ和Bcl-2基因mRNA和蛋白的變化以及磷酸化IKKβ（p-IKKβ）、磷酸化IκBα（p-IκBα）、NF-κBp65蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 與Qc組比較，Q1組、Q2組、Q3組細(xì)胞增殖抑制率及細(xì)胞凋亡率均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Q1組、Q2組、Q3組細(xì)胞增殖抑制率及細(xì)胞凋亡率依照布洛芬作用濃度和時間的增加而依次增加，具有濃度和時間依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與Qc組比較，Q1組、Q2組、Q3組細(xì)胞IKKβmRNA和Bcl-2mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Q1組、Q2組、Q3組比較，細(xì)胞IKKβmRNA和Bcl-2 mRNA表達(dá)依照布洛芬作用濃度的增加而依次下調(diào)，具有濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與Qc組比較，Q1組、Q2組、Q3組細(xì)胞IKKβ、Bcl-2、p-IKKβ、p-IκBα和NF-κBp65蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Q1組、Q2組、Q3組比較，細(xì)胞中IKKβ、Bcl-2、p-IKKβ、p-IκBα和NF-κBp65蛋白的表達(dá)依照布洛芬作用濃度的增加而依次降低，具有濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 布洛芬可以抑制人肝癌QGY-7703細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可能與布洛芬調(diào)控細(xì)胞IKKβ/IκBα/NF-κB信號通路有關(guān)。【關(guān)鍵詞】肝腫瘤；布洛芬；肝癌QGY-7703細(xì)胞；增殖；凋亡；信號通路

布洛芬是一種非選擇性抑制環(huán)氧化酶（cyclooxygen a se，COX）的非甾體類抗炎藥物（non-steroids antiinflammatory drugs，NSAIDs），是臨床上常用的鎮(zhèn)痛藥物之一。研究表明，布洛芬能較好地抑制前列腺癌和卵巢癌細(xì)胞增殖［1-2］，然而其對肝癌細(xì)胞的影響鮮有報道，其抑制癌細(xì)胞增殖的機(jī)制尚未明確。本研究旨在探討布洛芬是否通過IKKβ/IκBα/NF-κB通路相關(guān)因子調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖及凋亡。

1 材料和方法

1.1 藥品、試劑及儀器

人肝癌QGY-7703細(xì)胞由廣西腫瘤防治研究所實(shí)驗(yàn)室提供；99%純度的布洛芬（大連美侖生物技術(shù)有限公司），實(shí)驗(yàn)中用DMSO溶解（DMSO終體積分?jǐn)?shù)小于1‰），－20℃避光冷藏備用；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、DMSO（Gibco公司，美國）；CCK-8細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑盒（同仁公司，日本）；T ri zol（Invitrogen公司，美國）；PCR引物、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-Time PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；細(xì)胞凋亡試劑盒（BD公司，美國）；細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；顯色試劑盒（中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；鼠抗人磷酸化IKKβ（p-IKKβ）單克隆抗體、鼠抗人磷酸化IκBα（p-IκBα）單克隆抗體、鼠抗人NF-κBp65多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體、山羊抗鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（博世德生物技術(shù)有限公司）；CKX41型倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；Western blot圖像分析軟件（Bio-Rad公司，美國）；Prism7300實(shí)時定量PCR（ABI公司，美國）；VICTOR3酶標(biāo)儀（PerkenElmer公司，美國）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

選擇人肝癌QGY-7703細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37°C、5%CO2、100%濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱，細(xì)胞貼壁80%時以0.25%胰酶消化傳代，2～3 d傳一代。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，在培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將細(xì)胞隨機(jī)分為對照組（Qc組）和不同濃度布洛芬組，每組6例：Q1組（布洛芬作用濃度為250μmol/L）、Q2組（布洛芬作用濃度為500μmol/L）、Q3組（布洛芬作用濃度為1000μmol/L）、Qc組加入等容量的RPM I-1640培養(yǎng)基。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制情況

調(diào)整細(xì)胞濃度至2×104個/mL，將懸液以100μL/孔接種于96孔板中。培養(yǎng)24 h后棄上清液，加入含布洛芬且終濃度分別為250μmol/L、500μmol/L、1 000μmol/L的新培養(yǎng)液100μL，同時設(shè)不用藥孔，每組設(shè)6個復(fù)孔。分別培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h后，每孔加入CCK-8溶液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，取出培養(yǎng)板，酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度（OD值），每孔測量3次，取其平均值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：增殖抑制率＝（1－給藥組OD值/對照組OD值）×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況

調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105個/mL，分別將懸液以2mL/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后棄上清液，并在相應(yīng)組加入不同濃度布洛芬或培養(yǎng)液，每孔設(shè)6個復(fù)孔。分別培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h后，再以0.25%的胰酶消化收集細(xì)胞，調(diào)整待測細(xì)胞密度為1×106個/mL。每個樣本各取1mL細(xì)胞離心后加入冷PBS使細(xì)胞懸浮，再次離心后將細(xì)胞重懸于100μL的結(jié)合緩沖液中，依次加入5μL AnnexinV和5μL PI，輕輕混勻，避光下室溫15 min。加入400μL結(jié)合緩沖液，立即上機(jī)檢測，采用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。

1.5 實(shí)時熒光定量PCR檢測細(xì)胞IKKβmRNA和Bcl-2 mRNA表達(dá)情況

調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×105個/mL，分別將懸液以4mL/瓶接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)24 h后棄上清液，并在相應(yīng)組加入不同濃度布洛芬或培養(yǎng)液，每組做6個重復(fù)。培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，用Trizol法提取RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄為cDNA。4倍濃度梯度稀釋模板cDNA并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定基因的擴(kuò)增效率，確定cDNA上樣濃度，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為下一步PCR模板。PCR擴(kuò)增所用的寡核苷酸引物序列見表1。按照實(shí)時熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作，根據(jù)反應(yīng)條件在每個循環(huán)延伸末端收集熒光信號，繪制擴(kuò)增曲線。40個循環(huán)后設(shè)置反應(yīng)步驟，由55℃升溫到95℃過程中，每0.5℃采集熒光信號，繪制融解曲線，采用2-△△Ct法計(jì)算相對表達(dá)量。

表1 各基因的上下游引物序列（片段大小19～22 bp）

1.6 Western blot法檢測細(xì)胞IKKβ、p-IKKβ、p-IκBα、NF-κBp65和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況

調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×105個/mL，分別將懸液以4 mL/瓶接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)24 h后棄上清液，并在相應(yīng)組加入不同濃度布洛芬或培養(yǎng)液，每組做6個重復(fù)。培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，提取總蛋白及核蛋白，用BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒測定并調(diào)節(jié)蛋白濃度，－70℃冰箱保存?zhèn)溆?。以?actin作為內(nèi)參照，各組取等量蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)到PVDF膜上。PVDF膜放入封閉緩沖液（含5%脫脂奶粉TBS），室溫封閉 1 h，分別加入IKKβ、p-IKKβ、p-IκBα、NF-κBp65和Bcl-2一抗，4℃過夜，用辣根過氧化酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫孵育2 h?；瘜W(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像分析儀進(jìn)行圖像分析，以β-actin作為內(nèi)參照，用目的蛋白吸光度值/內(nèi)參照吸光度值的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖抑制和凋亡情況

與Qc組比較，Q1組、Q2組、Q3組細(xì)胞增殖抑制率及細(xì)胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Q1組、Q2組、Q3組比較，細(xì)胞增殖抑制率及細(xì)胞凋亡率依照布洛芬作用濃度增加和時間延長而依次增加，具有濃度和時間依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 不同濃度不同作用時間布洛芬孵育肝癌QGY-7703細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率的比較［（±s）%］

表2 不同濃度不同作用時間布洛芬孵育肝癌QGY-7703細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率的比較［（±s）%］

與Qc組比較，aP＜0.05；與Q1組比較，bP＜0.05；與Q2組比較，cP＜0.05；與24 h比較，dP＜0.05；與48 h比較，eP＜0.05

組別 n增殖抑制率Qc組 6 Q1組 6 Q2組 6 Q3組 6凋亡率24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 0 0 0 4.4±0.9 4.5±0.9 4.9±0.9 14.2±1.2a22.4±1.8ad34.9±2.4ade8.2±1.2a13.2±1.3ad23.5±1.4ade23.8±1.6ab33.2±1.5abd54.3±2.8abde18.6±1.4ab28.6±1.9abd37.9±2.9abde35.4±2.1abc47.6±3.4abcd72.1±3.6abcde26.2±1.5abc36.1±2.2abcd58.2±3.9abcde

2.2 布洛芬對肝癌QGY-7703細(xì)胞信號通路因子基因和蛋白表達(dá)的影響

與Qc組比較，Q1組、Q2組、Q3組細(xì)胞IKKβmRNA和Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Q1組、Q2組、Q3組比較，細(xì)胞IKKβmRNA和Bcl-2mRNA表達(dá)依照布洛芬作用濃度的增加而依次下降，具有濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與Qc組比較，Q1組、Q2組、Q3組細(xì)胞IKKβ、Bcl-2、p-IKKβ、p-IκBα和NF-κBp65蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Q1組、Q2組、Q3組比較，細(xì)胞IKKβ、Bcl-2、p-IKKβ、p-IκBα和NF-κBp65蛋白的表達(dá)依照布洛芬作用濃度的增加而依次下調(diào)，具有濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3、圖1。

表3 布洛芬對肝癌QGY-7703細(xì)胞信號通路因子基因和蛋白表達(dá)的影響（±s）

表3 布洛芬對肝癌QGY-7703細(xì)胞信號通路因子基因和蛋白表達(dá)的影響（±s）

與Qc組比較，aP＜0.05；與Q1組比較，bP＜0.05；與Q2組比較，cP＜0.05

組別 n mRNA表達(dá)Qc組 6 Q1組 6 Q2組 6 Q3組 6蛋白表達(dá)IKKβ Bcl-2 IKKβ p-IKKβ p-IκBα NF-κBp65 Bcl-2 1.00±0.03 1.00±0.03 0.49±0.05 0.45±0.06 0.44±0.04 0.49±0.08 0.68±0.09 0.81±0.08a0.82±0.09a0.36±0.04a0.30±0.05a0.29±0.02a0.36±0.07a0.53±0.04a0.61±0.05ab0.70±0.04ab0.27±0.02ab0.16±0.02ab0.19±0.04ab0.27±0.03ab0.41±0.06ab0.43±0.06abc0.52±0.06abc0.19±0.03abc0.10±0.03abc0.06±0.01abc0.14±0.02abc0.31±0.05abc

圖1 布洛芬對肝癌QGY-7703細(xì)胞IKKβ、p-IKKβ、Bcl-2、p-IκBα和NF-κBp65蛋白表達(dá)的影響

3 討論

近年來N S AID對癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的研究越來越受重視。有研究證明，長期服用布洛芬的患者患前列腺癌、結(jié)直腸癌和其他癌癥的風(fēng)險大大降低，同時布洛芬除可通過依賴COX-2途徑外，還可通過非依賴COX-2途徑抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［3-4］。NF-κB為重要的信號傳導(dǎo)因子，可以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與相應(yīng)的靶序列結(jié)合，介導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)編碼生長因子、細(xì)胞黏附分子以及影響凋亡基因的表達(dá)［5-6］。研究表明IKKβ可通過調(diào)節(jié)NF-κB活化調(diào)控促炎靶基因的轉(zhuǎn)錄，釋放炎癥產(chǎn)物參與肝炎、肝纖維化及肝癌的病理生理過程［7-8］。已經(jīng)證實(shí)NF-κB在多數(shù)肝癌細(xì)胞中有較高的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞中NF-κB通路可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡［9-10］。此外，有研究顯示布洛芬可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞和淋巴瘤細(xì)胞中NF-κB通路的活性，進(jìn)而影響下游靶基因的表達(dá)［11-12］。

本研究結(jié)果顯示，布洛芬可以抑制肝癌QGY-7703細(xì)胞增殖，同時也能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且具有濃度和時間依賴性。布洛芬能夠下調(diào)肝癌QGY-7703細(xì)胞NF-κBp65的表達(dá)，其抑制因子IκBα的磷酸化也受到抑制。上游信號分子IKKβ的檢測表明，布洛芬可以抑制IKKβ及其磷酸化，進(jìn)而抑制NF-κB信號通路，表明布洛芬在肝癌QGY-7703細(xì)胞中可通過蛋白激酶水平的作用抑制IKKβ/IκBα/NF-κB信號通路活化。同時，不同濃度布洛芬組Bcl-2基因mRNA和蛋白表達(dá)均下調(diào)，現(xiàn)已知抗凋亡基因Bcl-2是IKKβ/IκBα/NF-κB信號通路重要的靶基因之一，而且抑制細(xì)胞NF-κB活性后誘導(dǎo)的凋亡與Bcl-2表達(dá)下調(diào)相關(guān)。因此本研究結(jié)果表明布洛芬抑制肝癌QGY-7703細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡的作用機(jī)制可能與IKKβ/IκBα/NF-κB信號通路密切相關(guān)，且可負(fù)性調(diào)控下游靶基因Bcl-2mRNA和蛋白的表達(dá)。

［1］ Andrews J，Djakiew D，Krygier S，et al.Superior effectiveness of ibuprofen compared with other NSAIDs for reducing the survivalof human prostate cancer cells［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2002，50（4）：277-284.

［2］ Andrews P，Zhao X，Allen J，etal.A comparison of the effectiveness of selected non-steroidal anti-inflammatory drugsand their derivatives against cancer cells in vitro［J］.Cancer C hemother P harmacol，2008，61（2）：203-214.

［3］ Pikarsky E，Porat RM，Stein I，et al.NF-kapaB functions as atumor promoter in inflammation associated cancer［J］.Nature，2004，431（7007）：461-466.

［4］ Scheuren N，Bang H，Münster T，et al.Modulation of transcription factor NF-κB by enantiomers of the nonsteroidal drug ibuprofen［J］.British JP harmacol，1998，123（4）：645-652.

［5］ Greenspan EJ，Madigan JP，Boardman LA，et al.Ibuprofen inhibits activation of nuclearβ-catenin in human colon adenomas and induces the phosphorylation of GSK-3β［J］.Cancer Prev Re s，2011，4（1）：161-171.

［6］ Ghosh S，Karin M.Missing pieces in the NF-kappaB puzzle［J］.Cell，2002，109 Suppl：S81-96.

［7］ Scheidereit C.IκB kinase complexes：gateways to NF-κB activation and transcription［J］.Oncogene，2006，25（51）：6685-6705.

［8］ Guan YS，He Q，Wang MQ，et al.Nuclear factor kappa B and

hepatitis viruses［J］.ExpertOpin Ther Targets，2008，12（3）：265-280.［9］ Maher JJ，Leon P，Ryan JC.Beyond insulin resistance：Innate

immunity in nonalcoholic steatohepatitis［J］.Hepatology，2008，48（2）：670-678.

［10］He G，Karin M.NF-κB and STAT3-key players in liver inflammation and cancer［J］.Cell R es，2011，21（1）：159-168.

［11］Liu A，Huang L，F(xiàn)an H，et al.Baicalein pretreatment protects against liver ischemia/reperfusion injury via inhibition of NF-κB pathway in mice［J］.Int I mmunopharmacol，2015，24（1）：72-79.

［12］Gu X，Yao M，Wang SY，et al.Inhibitory effects of intervention of the TNFa/NF-kappaB signaling pathway activation on hepatoma cell proliferation［J］.Chinese JH epatol，2014，22（5）：434-439.

［2016-12-12收稿］［2017-02-02修回］［編輯 江德吉］

Effect of ibuprofen on apoptosis and proliferation of hepatic cells via the IKKβ/IκBα/NF-κB signaling pathway

Nan Zhenhua，Pan Linghui，Zhang Weikang（Department of Anesthesiology，Affiliated Tumor Hospital of GuangxiMedical University，Nanning 530021，P.R.China）

Pan Linghui.E-mail：plinghui@hotmail.com

Objective To investigate the effect of ibuprofen on apoptosis and proliferation of hepatic cells via the IKKβ/IκBα/NF-κB signaling pathway.M ethods Human liver cancer QGY-7703 cells in logarithmic growth phase were seeded into culture plates or bottles.The cells were randomly divided into 4 groups using random number table（n=6 each）：control group（Qc group）and 3 experimental groups given different ibuprofen concentrations（Q1，Q2，Q3groups）.The Q1，Q2and Q3groupswere exposed to ibuprofen at respective final concentrations of 250，500 and 1000μmol/L，while the control group was exposed to normovolemic RPM-l640 nutrient solution.Cell proliferation at 24，48 and 72 h later wasmeasured using the CCK-8 assay，and apoptosis rate wasmeasuredusing flow cytometry.After 48 h incubation，levels of IKKβand Bcl-2 mRNA and protein，as well as levels of p-IKKβ，p-IκBα and NF-κBp65 protein，weremeasured using real-time PCR or Western blotting.Results Proliferation rates and apoptotic rates were significantly higher in the Q1，Q2and Q3groups than in the Qc group.These effects depended on ibuprofen dose and incubation time. Levels of IKKβand Bcl-2 mRNA were significantly lower in Q1，Q2and Q3groups than in the Qc group，and this effect varied with ibuprofen concentration.Similarly，protein levels of IKKβ，Bcl-2，p-IKKβ，p-IκBαand NF-κBp65 were significantly lower in the Q1，Q2and Q3groups than in the Qc group.All these levels negatively correlated with ibuprofen concentration（P＜0.05）.Conclusions Ibuprofen can inhibit proliferation and induce apoptosis in human liver cancer QGY-7703 cells，and itmay exert these effects by regulating IKKβ/IκBα/NF-κB signaling.

Liver neoplasms；Ibuprofen；Liver cancer QGY-7703 cells；Proliferation；Apoptosis；Signaling pathway

R735.7

A

1674-5671（2017）01-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.01.06

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目（2013BC26260）

潘靈輝。E-m ail：plinghui＠hotmail.com