脊髓β-內(nèi)啡肽參與大麻素2型受體激動(dòng)劑調(diào)節(jié)的癌痛嗎啡耐受

張明月張招娣王國(guó)年，

作者單位：150081 哈爾濱1哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科；2黑龍江醫(yī)學(xué)科學(xué)院疼痛研究所

脊髓β-內(nèi)啡肽參與大麻素2型受體激動(dòng)劑調(diào)節(jié)的癌痛嗎啡耐受

張明月1張招娣2王國(guó)年1，2

作者單位：150081 哈爾濱1哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科；2黑龍江醫(yī)學(xué)科學(xué)院疼痛研究所

目的 探討脊髓β-內(nèi)啡肽是否參與大麻素2型（cannabinoid type 2 receptor，CB2）受體調(diào)節(jié)的癌癥疼痛（以下簡(jiǎn)稱“癌痛”）嗎啡耐受。方法 采用Walker 256乳腺癌細(xì)胞注射到大鼠右后側(cè)腳掌趾部建立癌痛模型。荷瘤大鼠隨機(jī)分為6組，每組6只。按需要分別接受鞘內(nèi)注射CB2受體激動(dòng)劑、拮抗劑、皮下嗎啡注射或聯(lián)合給藥，每天早晚兩次，持續(xù)8 d。每天早上給藥后30min應(yīng)用von Frey纖維絲和熱平板實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠的機(jī)械性疼痛閾值和熱刺激回縮潛伏期。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunoabsorbent assay，ELISA）檢測(cè)脊髓β-內(nèi)啡肽表達(dá)水平。結(jié)果 慢性嗎啡治療可降低荷瘤大鼠機(jī)械性疼痛閾值和熱疼痛閾值。相對(duì)于空白對(duì)照組，慢性嗎啡治療可下調(diào)脊髓β-內(nèi)啡肽表達(dá)水平［（5.24±1.41）ng vs（12.46±3.50）ng，P<0.01］。共同給予非鎮(zhèn)痛劑量的CB2受體激動(dòng)劑8 d可明顯抑制嗎啡所引起的機(jī)械性疼痛［（19.33±3.36）g vs（9.5±1.07）g，P<0.01］和降低熱疼痛閾值［（21.83±2.89）s vs（9.5±2.01）s，P<0.01］，同時(shí)抑制脊髓β-內(nèi)啡肽表達(dá)下調(diào)［（10.11±2.08）ng vs（5.24±1.41）ng，P<0.05］。結(jié)論 鞘內(nèi)注射非鎮(zhèn)痛劑量的CB2受體激動(dòng)劑可能通過抑制嗎啡誘導(dǎo)的脊髓β-內(nèi)啡肽表達(dá)下調(diào)而調(diào)節(jié)癌痛嗎啡耐受。

癌癥疼痛；嗎啡耐受；大麻素2型受體；β-內(nèi)啡肽

疼痛是影響癌癥患者生活質(zhì)量的主要因素，約一半癌癥患者經(jīng)歷中到重度疼痛，其中部分患者在癌癥轉(zhuǎn)移以及疾病發(fā)展過程中要經(jīng)歷劇烈的疼痛［1-2］。嗎啡是治療癌癥疼痛（以下簡(jiǎn)稱“癌痛”）的常用藥物，但阿片耐受妨礙了嗎啡的臨床止痛效能，因此需在疾病的發(fā)展過程中增加藥量控制疼痛。盡管許多研究嘗試闡明嗎啡耐受機(jī)制，但其分子及細(xì)胞機(jī)制仍未十分明確。

大麻素2型受體（cannabinoid type 2 receptor，CB2）屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，表達(dá)于脊髓及背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞［1-4］、中樞及外周神經(jīng)元［2，5-6］。我們前期研究表明，非鎮(zhèn)痛劑量的CB2受體激動(dòng)劑可減輕癌痛大鼠的嗎啡耐受［7］，但是其機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

嗎啡主要作用于Mu-阿片受體（m u opioid receptor，MOR），受體內(nèi)化被認(rèn)為是阿片受體脫敏的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)，受體內(nèi)化后重新整合于細(xì)胞膜是使受體重新敏感的關(guān)鍵［8-9］。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)嗎啡不具有促進(jìn)MOR內(nèi)化作用，可使受體持續(xù)接受刺激而發(fā)生適應(yīng)性改變，從而導(dǎo)致受體敏感性降低發(fā)生脫敏而產(chǎn)生嗎啡耐受［10］。傷害性刺激導(dǎo)致的內(nèi)源性阿片肽的釋放能誘導(dǎo)中樞及外周MOR的內(nèi)化［11-12］，從而減輕嗎啡耐受。已有研究報(bào)道CB2受體激動(dòng)劑AM1241可誘導(dǎo)β-內(nèi)啡肽釋放［13］，同時(shí)，電針刺激可通過激動(dòng)CB2受體而上調(diào)β-內(nèi)啡肽表達(dá)［14］。因此，我們推測(cè)CB2受體激動(dòng)劑可減輕癌痛嗎啡耐受，而此作用可能與上調(diào)β-內(nèi)啡肽表達(dá)，從而促進(jìn)MOR內(nèi)化有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用非鎮(zhèn)痛劑量的CB2受體激動(dòng)劑AM1241及選擇性的CB2受體拮抗劑AM630，評(píng)價(jià)CB2受體激動(dòng)劑對(duì)癌痛嗎啡耐受大鼠脊髓β-內(nèi)啡肽表達(dá)的影響，以探討其是否參與CB2受體激動(dòng)劑調(diào)節(jié)的癌痛嗎啡耐受。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性Wistar大鼠，SPF級(jí)，體重160～180 g，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，共36只，每組4只飼養(yǎng)于籠內(nèi)，自由進(jìn)食水，光照與熄燈各12 h，溫度維持在（21±1）℃，保持環(huán)境安靜及最小外界刺激。動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境1周，操作均由固定人員在8∶00～14∶00進(jìn)行。動(dòng)物的處理符合美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（n ational i nstitutes of h ealth，NIH）及哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物管理規(guī)定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用準(zhǔn)則。

1.2 癌痛模型的建立

Walker 256乳腺癌細(xì)胞以1×107個(gè)大鼠腹膜內(nèi)注射，5 d后抽取腹水，離心后去上清液，細(xì)胞團(tuán)用磷酸鹽緩沖鹽水（phosphate-buffered saline，PBS，pH7.4）稀釋，使細(xì)胞懸液達(dá)106/100μL。青霉素（120 000單位/ 10 mL細(xì)胞懸液）加入細(xì)胞懸液中避免微生物污染。100μLWalker 256乳腺癌細(xì)胞懸液注入雄性大鼠右側(cè)腳掌趾部［15］。

1.3 動(dòng)物行為學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 機(jī)械性疼痛閾值 機(jī)械性疼痛閾值通過標(biāo)準(zhǔn)化von Frey纖維絲（s toelting，w ood d ale，IL）測(cè)痛方法測(cè)量。將大鼠分別放入底面為金屬絲網(wǎng)編織的透明塑料容器中（15 cm3×20 cm3×12 cm3），室溫（21±1）℃適應(yīng)15min。von Frey纖維絲刺激大鼠右側(cè)腳掌中部（起始強(qiáng)度4.0 g，強(qiáng)度范圍1.0～60 g），使纖維彎曲成S形，持續(xù)6～8 s，如出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)（突然抬起、舔舐或移開所刺激的后足）則降低一個(gè)刺激強(qiáng)度；如為陰性反應(yīng)，則增加一個(gè)刺激強(qiáng)度，直至出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。測(cè)定3次縮足陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度值，以平均值代表機(jī)械性疼痛閾值［16］。1.3.2 熱疼痛閾值 熱平板實(shí)驗(yàn)測(cè)量大鼠后爪熱縮足潛伏期。大鼠分別放在52℃熱平板上，記錄大鼠從接觸平板到舔舐后爪或蹦起的時(shí)間間隔。為防止組織損傷，設(shè)定熱板加熱最長(zhǎng)時(shí)間為30 s，若30 s后大鼠仍末出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，則記錄為30 s。重復(fù)測(cè)量3次出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)的時(shí)間間隔，每次測(cè)量間隔5～10 min，取3次測(cè)量的平均值代表熱疼痛閾值。

1.4 動(dòng)物分組及處理

Walker 256乳腺癌細(xì)胞種植5 d后，將荷瘤大鼠按計(jì)算機(jī)產(chǎn)生的隨機(jī)數(shù)字編號(hào)隨機(jī)分為6組，每組6只。CB2受體激動(dòng)劑AM1241與拮抗劑AM630分別溶于50%二甲基亞砜中進(jìn)行鞘內(nèi)注射?？瞻讓?duì)照組鞘內(nèi)注射藥物溶劑（20μL 50%二甲基亞砜）和皮下注射生理鹽水，嗎啡組鞘內(nèi)注射藥物溶劑（20μL 50%二甲基亞砜）和10 mg/（kg·mL）-1嗎啡；AM1241處理組鞘內(nèi)注射0.07μg AM1241，同時(shí)皮下注射嗎啡；AM630處理組鞘內(nèi)注射10μg AM630，同時(shí)鞘內(nèi)注射AM1241和皮下注射嗎啡；AM1241對(duì)照組鞘內(nèi)注射0.07μgAM1241；AM630對(duì)照組鞘內(nèi)注射10μgAM630。接種腫瘤細(xì)胞5 d后給予藥物治療，藥物治療第一天記為d1，每天8∶00和20∶00各治療1次，連續(xù)給予8 d（d1～8）；AM630先于AM1241 30 min注射，AM1241先于嗎啡30 min注射。分別在第一天給藥前及每天上午嗎啡注射后30min進(jìn)行行為學(xué)指標(biāo)檢測(cè)。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)脊髓β-內(nèi)啡肽的表達(dá)

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunoabsorbentassay，ELISA）檢測(cè)脊髓腰3-腰5節(jié)段β-內(nèi)啡肽的表達(dá)水平。組織經(jīng)PBS（0.02mol/L，pH 7.0～7.2）沖洗后剪碎放入2 mL EP管中，加入100μL PBS，均漿器將組織研碎，再加入100～160μL PBS混勻。將組織勻漿液放入液氮20 s，然后放入37℃水浴箱20 s，再放入液氮中，如此反復(fù)3次，充分裂解細(xì)胞。然后置于4℃1 500 r/min離心15min，取上清液待檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。行為學(xué)指標(biāo)數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量雙因素方差分析，多重比較采用Bonferroni檢驗(yàn)；其余結(jié)果采用單因素方差分析，多重比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AM1241對(duì)嗎啡治療癌痛大鼠機(jī)械性刺激痛閾的影響

注射嗎啡可明顯增加癌痛大鼠后爪的機(jī)械性疼痛閾值。AM1241處理組的嗎啡效能在第1天和第2天與嗎啡組無(wú)明顯差別，但第3天開始AM1241處理組的嗎啡效能明顯高于嗎啡組［（48.67±10.14）g vs（38.28±4.66）g，P＜0.05］。盡管AM1241處理組嗎啡效能在隨后的幾天進(jìn)行性下降，但至第8天仍明顯高于嗎啡組［（19.33±3.36）g vs（9.5±1.07）g，P＜0.001，圖1A］。通過計(jì)算機(jī)械性疼痛閾值與時(shí)間圍成的曲線下面積（area under the curve，AUC），發(fā)現(xiàn)AM630預(yù)先治療可廢除AM1241對(duì)嗎啡治療癌痛效能的調(diào)節(jié)作用（圖1B）。單獨(dú)給予AM1241或AM630對(duì)癌誘發(fā)的機(jī)械性疼痛閾值無(wú)明顯影響（圖1B）。

2.2 AM1241對(duì)嗎啡治療癌痛大鼠后爪熱刺激回縮潛伏期的影響

嗎啡組可明顯增加癌痛大鼠后爪的熱刺激回縮潛伏期，但是其效能呈進(jìn)行性下降，第7天時(shí)，嗎啡組熱刺激回縮潛伏期與空白對(duì)照組已無(wú)明顯差別［（12.64± 2.83）s vs（8.85±1.83）s，圖2A）］，表明癌痛大鼠出現(xiàn)嗎啡耐受。AM1241處理組的嗎啡效能在第1天至第5天與嗎啡組無(wú)明顯差別。從第6天開始，AM1241處理組嗎啡止痛效能明顯高于嗎啡組［（27.23±1.94）s vs（15.47±3.79）s，P＜0.001）］。第8天時(shí)，相對(duì)于嗎啡組，AM1241處理組嗎啡注射后仍產(chǎn)生明顯的止痛效能［（21.83±2.89）s vs（9.5±2.01）s，P＜0.001）］。通過計(jì)算AUC，得出AM630預(yù)先治療可廢除AM1241對(duì)嗎啡抗熱痛覺過敏作用（圖2B）。單獨(dú)給予AM1241或AM630對(duì)癌誘發(fā)的熱痛覺過敏無(wú)明顯影響（圖2B）。

圖1 AM 1241對(duì)嗎啡治療癌痛大鼠機(jī)械性刺激痛閾的影響

圖2 AM 1241對(duì)嗎啡治療癌痛大鼠后爪熱刺激回縮潛伏期的影響

2.3 AM1241對(duì)嗎啡治療癌痛大鼠脊髓β-內(nèi)啡肽表達(dá)的影響

ELISA檢測(cè)腫瘤種植同側(cè)脊髓β-內(nèi)啡肽表達(dá)水平。相對(duì)于空白對(duì)照組，持續(xù)8 d的嗎啡治療（嗎啡組）可明顯降低脊髓β-內(nèi)啡肽表達(dá)水平［（12.46±3.50）n g vs（5.24±1.41）n g，P＜0.001］。而AM1241預(yù)先治療（AM1241處理組）可明顯抑制慢性嗎啡治療所引起的脊髓β-內(nèi)啡肽表達(dá)下調(diào)［（10.11±2.08）n g vs（5.24± 1.41）n g，P＜0.005］。AM630先于AM1241 30min注射可廢除AM1241對(duì)脊髓β-內(nèi)啡肽表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。見圖3。

圖3 AM 1241對(duì)嗎啡治療癌痛大鼠脊髓β-內(nèi)啡肽表達(dá)的影響

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)量癌痛大鼠后爪機(jī)械性疼痛閾值和熱刺激回縮潛伏期證實(shí)鞘內(nèi)注射非鎮(zhèn)痛劑量的CB2受體激動(dòng)劑AM1241能夠增強(qiáng)嗎啡鎮(zhèn)痛并抑制嗎啡耐受，這一結(jié)果與我們前期的研究結(jié)果一致［7］，進(jìn)一步證實(shí)了CB2受體激動(dòng)劑在癌痛嗎啡耐受中的作用。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，CB2受體激動(dòng)劑可抑制嗎啡所引起的脊髓β-內(nèi)啡肽表達(dá)下調(diào)，而CB2受體拮抗劑AM630可廢除AM1241對(duì)脊髓β-內(nèi)啡肽的調(diào)節(jié)作用。這一結(jié)果提示CB2受體參與癌痛嗎啡耐受可能與抑制β-內(nèi)啡肽的下調(diào)有關(guān)。

研究報(bào)道，長(zhǎng)期應(yīng)用嗎啡引起阿片受體的適應(yīng)性改變參與嗎啡耐受的形成［17-18］。適應(yīng)性改變發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同水平，從受體及細(xì)胞的改變到不同神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)功能的改變［19-20］。這種發(fā)生在受體水平的改變導(dǎo)致信號(hào)的有效性逐步減弱，導(dǎo)致對(duì)阿片類藥物的敏感性降低，即脫敏感。在受體重新敏感的過程中，受體內(nèi)化整理后重新表達(dá)于膜表面是一個(gè)重要的步驟。而嗎啡不具有使MOR受體內(nèi)化的作用，這一觀點(diǎn)已在轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)中證實(shí)。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，用對(duì)嗎啡刺激可產(chǎn)生快速內(nèi)化作用的突變體MOR代替野生型MOR，發(fā)現(xiàn)嗎啡治療5 d后，嗎啡效能在野生型小鼠基本喪失，即產(chǎn)生嗎啡耐受［10］。說明MOR受體的內(nèi)化、整合、再敏感的過程可能參與嗎啡耐受的形成。因此，促進(jìn)MOR的內(nèi)化可減輕嗎啡耐受。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，內(nèi)源性阿片肽如β-內(nèi)啡肽的釋放可誘導(dǎo)中樞及外周MOR的內(nèi)化［11-12］。而CB2受體激動(dòng)劑AM1241可誘導(dǎo)人類角質(zhì)細(xì)胞β-內(nèi)啡肽釋放，并能刺激大鼠皮膚組織釋放β-內(nèi)啡肽［13］。同時(shí)，在炎癥疼痛模型中，電針刺激可通過激動(dòng)CB2受體而上調(diào)β-內(nèi)啡肽表達(dá)［14］。本研究檢測(cè)了癌痛大鼠持續(xù)8 d嗎啡治療后其脊髓β-內(nèi)啡肽表達(dá)情況，ELISA結(jié)果顯示，嗎啡治療后脊髓β-內(nèi)啡肽表達(dá)下調(diào)，提示其可能參與了嗎啡耐受的形成。此外，還發(fā)現(xiàn)CB2受體激動(dòng)劑AM1241預(yù)先給藥后可抑制嗎啡導(dǎo)致的脊髓β-內(nèi)啡肽表達(dá)下調(diào)，因此推測(cè)，CB2受體激動(dòng)劑可能通過上調(diào)β-內(nèi)啡肽的表達(dá)，從而促進(jìn)MOR內(nèi)化而達(dá)到減輕嗎啡耐受的目的。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CB2受體激動(dòng)劑參與癌痛嗎啡耐受可能通過增加脊髓β-內(nèi)啡肽表達(dá)實(shí)現(xiàn)。但是，其細(xì)胞及神經(jīng)生理學(xué)機(jī)制尚不明確，這是下一步研究的方向。盡管一些國(guó)家已允許大麻素制劑用于癌癥引起的神經(jīng)性疼痛［21］，但是大麻素用于治療慢性疼痛的研究大部分仍處于臨床前階段［22］，因此，大麻素藥物仍具有廣闊的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可為應(yīng)用CB2受體激動(dòng)劑加強(qiáng)嗎啡止痛從而治療嚴(yán)重疼痛，減少嗎啡使用劑量及副作用提供新的藥理學(xué)途徑。

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［2016-12-08收稿］［2017-02-10修回］［編輯 羅惠予］

·麻醉鎮(zhèn)痛與腫瘤專欄·

基礎(chǔ)研究

Involvement ofβ-endorphin in cannabinoid type 2 receptor agonist-mediated morphine tolerance in cancer pain

Zhang Mingyue1，Zhang Zhaodi2，Wang Guonian1，2（1Department of Anesthesiology，Affiliated Hospital of Harbin Medical University；2Institute of Pain，Heilongjiang Provincial Academy of Medical Sciences，Harbin 150081，P.R.China）

Wang Guonian.E-mail：wangguonian609cn＠aliyun.com

Objective The purpose of this research was to testwhether the CB2 receptor is involved in morphine tolerance by upregulatingβ-endorphin in spinal cord in cancer pain.M ethods Walker 256 cells were implanted into the plantar region of the rat right hind paw.Tumor-bearing animals received intrathecal injections of a CB2 receptor agonist or antagonist with or without subcutaneous injections ofmorphine twice daily for 8 days.Mechanical paw withdrawal threshold and thermal paw withdrawal latency were assessed daily using the von Frey test and hot plate test.Expression ofβ-endorphin in the spinal cord was detected by ELISA after the last day of drug administration.Results Repeated morphine treatments reduced the mechanical withdrawal threshold and thermal latency，aswell as down-regulatedβ-endorphin in the spinal cord[（5.24±1.41）ng vs（12.46±3.50）ng，P<0.001].Repeated co-administration of AM1241 with morphine for 8 days significantly inhibited the development of mechanical withdrawal threshold [（19.33±3.36）g vs（9.5±1.07）g，P<0.001]and thermal latency[（21.83±2.89）s vs（9.5±2.01）s，P<0.001）]，and reversed the down-regulation ofβ-endorphin expression in tumor-bearing rats[（10.11±2.08）ng vs（5.24±1.41）ng，P<0.05].Conclusions Intrathecal injection of the CB2 receptor agonist alleviated morphine tolerance in tumor-bearing rats by up-regulatingβ-endorphin expression in spinal cord.

Cancer pain；Morphine tolerance；Cannabinoid type 2 receptor；β-endorphin

R730.5

A

1674-5671（2017）01-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.01.05

中俄醫(yī)學(xué)研究中心轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目（CR201418）

王國(guó)年。E-mail：wangguonian609cn＠aliyun.com