不同產(chǎn)地徐紫薯6號(hào)花青素成分差異分析

穆晶晶,朱成雷,徐靜雯,韓瑋璐,陳才法,*,鄭元林,陳 萍(.江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇徐州 6; .江蘇徐州甘薯研究中心/江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,江蘇徐州 3)

甘薯(Ipomoeabatatalam.)其部分品種的塊根內(nèi)部呈紫紅色或紫黑色,俗稱紫肉甘薯或紫心甘薯。紫甘薯營(yíng)養(yǎng)成分豐富,其塊根和莖葉部分均含有花青素成分,但塊根中的花青素含量明顯高于莖葉[1]。作為紫甘薯重要的次生代謝產(chǎn)物之一,花青素具有清除自由基、抗腫瘤、抗炎[2]、減少基因毒性[3]等重要的藥用價(jià)值[4-5]。紫薯因產(chǎn)量高、花青素含量豐富，已經(jīng)成為花青素的重要來(lái)源之一。

花青素在不同pH環(huán)境下顯色有較大差異,因此其檢測(cè)方式有很多種,已經(jīng)報(bào)道的檢測(cè)花青素組分的方法有分光光度計(jì)法[6-7]、高效液相色譜法(HPLC)[8-11]等。通過(guò)高效液相色譜配合UV檢測(cè)的方式可快速、高靈敏度地分析植物花青素的組成成分。

花青素作為廣泛存在于多種植物中的天然色素,其含量在不同植物中差異明顯?；ㄇ嗨刈鳛樘烊划a(chǎn)物的最終形態(tài),受到基因、環(huán)境等多種因素的調(diào)控[12-14]。而近期研究表明,產(chǎn)地之間的差異對(duì)天然產(chǎn)物的積累有很大的影響。青海、新疆、內(nèi)蒙古三個(gè)產(chǎn)地之間的黑果枸杞的原花青素和花青素含量均有較大差異[15]。意大利藏紅花在四個(gè)不同的種植區(qū)域所含有的物質(zhì)存在差異[16]。枸杞組分特征與產(chǎn)地溯源之間存在一定的相關(guān)性[17]。因此,作物的天然特征產(chǎn)物的含量與其產(chǎn)地之間是有一定相關(guān)性的。

由于人類的活動(dòng)及本身地質(zhì)區(qū)別,不同種植試點(diǎn)區(qū)的土壤存在著一定差異。據(jù)報(bào)道,徐州地區(qū)土壤成分主要有Hg-Cd重金屬污染,以及Pb中度污染[18]且pH呈中性到堿性[19]。睢寧縣則存在不同的情況,睢寧縣土壤的pH呈7.52～8.93偏堿性,存在Pb、Cd復(fù)合污染,且存在As分別與Pb及Cd呈現(xiàn)復(fù)合污染的現(xiàn)象[20]。同時(shí)有報(bào)道,睢寧縣土壤存在Pb微量超標(biāo)的現(xiàn)象[21]。鹽城地區(qū)屬于沿海地區(qū),主要屬于土壤鹽漬化,pH在8.98～9.15左右,土壤總鹽含量約在5～7 g/kg的范圍[22]。本文選取的徐紫薯6號(hào)是由徐州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院2014年培育的新品種,主要種植在江蘇境內(nèi)不同的甘薯種植區(qū)。本研究在選用科學(xué)的種植和管理模式下的徐州農(nóng)科院試驗(yàn)田、睢寧農(nóng)科站試驗(yàn)田、鹽城林科院試驗(yàn)站試驗(yàn)田的三個(gè)種植試點(diǎn)區(qū)取樣,檢測(cè)徐紫薯6號(hào)花青素的地域差異。本文通過(guò)檢測(cè)徐紫薯6號(hào)花青素的組分的構(gòu)成與產(chǎn)地土壤之間的關(guān)系,以期建立徐紫薯6號(hào)的產(chǎn)地溯源指標(biāo)的便捷、準(zhǔn)確的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

不同產(chǎn)地徐紫薯6號(hào) 江蘇徐州甘薯研究中心提供,取2015年份,徐州農(nóng)科院試驗(yàn)田(34°28′N(xiāo) 117°30′E,命名為XZ15)、睢寧農(nóng)科站試驗(yàn)田(33°97′N(xiāo) 117°98′E,SN15)、鹽城林科院試驗(yàn)站(33°00′N(xiāo) 120°82′E,YC15)不同產(chǎn)地的多個(gè)薯塊樣品各一份,按產(chǎn)地分別制成干粉4 ℃保存?zhèn)溆?另取2016年份徐州農(nóng)科院試驗(yàn)田種植區(qū)的2個(gè)薯塊,命名為XZ16-1、XZ16-2同樣方式處理;磷酸 分析純,博河精細(xì)化學(xué)品有限公司;鹽酸 分析純,蘇懿化學(xué)試劑有限公司;無(wú)水乙醇 分析純,大茂化學(xué)試劑廠;甲醇、乙腈 色譜純,漢邦科技有限公司;混合花青素 E10-115、INS 163,青島鵬遠(yuǎn)康華天然產(chǎn)物有限公司。

Waters e2695高效液相色譜儀,配有自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、e2489 UV/Vis檢測(cè)器 美國(guó)Waters公司;WB-400小型高速粉碎機(jī) 北京維博創(chuàng)機(jī)械設(shè)備有限公司;KQ-500B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;H-1型微型混合器 上海青浦滬西儀器廠;GM-0.33A隔膜真空泵 天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;TGL-16G高速冷凍離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 混合花青素溶液的制備 精密稱取混合花青素5.00 mg(精確至0.01 mg)并準(zhǔn)確加入1 mL 1.5%磷酸,配制成5 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用1.5%的磷酸溶液梯度稀釋濃度為5、10、50、100、500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液用于檢測(cè)。

1.2.2 樣品采集與前處理 清洗甘薯表面塵土,保持甘薯薯皮、薯塊完整。將甘薯樣品分別切絲,放置在自然通風(fēng)處晾干(室溫:20 ℃,時(shí)間:1～2 d)。小型高速粉碎機(jī)粉碎,制成粉于4 ℃冷藏保存。

1.2.3 樣品制備 精密稱取紫甘薯粉末200 mg并置于5 mL 離心管內(nèi),加入2 mL 提取溶劑(65%乙醇,用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.1)。置于超聲波清洗器(超聲功率:500 W,超聲頻率:40 kHz)中超聲2 min后,10000 r/min離心10 min,提取上清液。重復(fù)上述步驟一次,合并上清液。精準(zhǔn)吸取上清液750 μL,再加入1.5%磷酸750 μL,得到供試樣本。

1.2.4 色譜條件 根據(jù)文獻(xiàn)[23]并對(duì)其液相條件進(jìn)行優(yōu)化后得到本實(shí)驗(yàn)的色譜條件為:Agela innoval C18柱(4.6×150 mm,5 μm 100 ?),流速:1 mL/min,進(jìn)樣量10 μL,柱溫35 ℃。檢測(cè)波長(zhǎng):520 nm,流動(dòng)相為:A相 1.5%磷酸,流動(dòng)相B:1%磷酸+35%乙腈預(yù)混合。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Empower 3.0軟件對(duì)液相數(shù)據(jù)進(jìn)行收集和處理。利用SPSS 22.0軟件和GraphPad 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的優(yōu)化

待測(cè)的花青素組成復(fù)雜,且各組分之間相似度較高,因此,本文考察了待測(cè)的紫甘薯花青素在不同流動(dòng)相條件下的分離情況。

因花青素在酸性條件下較為穩(wěn)定,本實(shí)驗(yàn)考察了冰醋酸、磷酸以及磷酸乙腈按比例預(yù)混合等條件下花青素各組分的分離情況。結(jié)果表明,當(dāng)1.5%磷酸與35%乙腈預(yù)混合后作為流動(dòng)相B,1.5%磷酸作為流動(dòng)相A時(shí),徐紫薯6號(hào)花青素組分分離效果良好且穩(wěn)定,以XZ15樣本為例,本色譜條件共分離出13種花青素組分并編號(hào)為1～13號(hào)峰(圖1)。

圖1 XZ15花青素HPLC指紋圖譜Fig.1 The HPLC fingerprint chromatogram of anthocyanidins of XZ15

表2 樣品中3種花青素組分的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs of 3 anthocyanin compositions in samples(n=6)

2.2 線性關(guān)系、回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

以混合花青素總質(zhì)量濃度X(μg/mL)和色譜總峰面積Y為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,混合花青素在5～500 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系,(Y=8090.9x+10325,R2=0.9999)。以XZ15為例與混合花青素比較發(fā)現(xiàn),徐紫薯6號(hào)的主要成分Peak 8、Peak 10、Peak 11、Peak 13均有相對(duì)應(yīng)成分(圖2)?；旌匣ㄇ嗨刂袑?duì)應(yīng)的Peak 10、Peak 11由于分離度R<1,因此不進(jìn)行回收率檢驗(yàn)。在混合花青素5～500 μg/mL范圍內(nèi),Peak 8、Peak 9、Peak13所對(duì)應(yīng)的峰呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,分離度R>1,因此進(jìn)行回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算。以徐紫薯6號(hào)紫甘薯提取液為基質(zhì),分別添加5、50、500 μg/mL 3個(gè)不同濃度水平的混合花青素、每個(gè)濃度水平進(jìn)行6次平行測(cè)定,并計(jì)算回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖2 混合花青素與徐紫薯6號(hào)花青素HPLC圖譜Fig.2 The HPLC chromatogram of mix anthocyanin and Xuzishu NO.6

2.3 方法有效性考察

分離度(又稱分辨率)是表示在色譜分離中,相鄰組分之間的分離程度,用R表示,常作為總分離效果的重要指標(biāo)[24]。分離度的計(jì)算方法為相鄰峰的保留時(shí)間差與平均半峰值之比[25]。通常情況下,R=1時(shí),兩個(gè)組分基本分離,分離度約為98%,當(dāng)R=1.5時(shí),分離度達(dá)到99.7%。理論塔板系數(shù)用于評(píng)價(jià)色譜柱的分離效能,可作為對(duì)花青素組分分離程度的輔助數(shù)據(jù)[26]。以六個(gè)樣本的指紋特征圖的基礎(chǔ)上進(jìn)行1.2.4項(xiàng)HPLC分離方法的有效性考察(見(jiàn)表3)。

1.2.4項(xiàng)HPLC分析方法中,分離度R>1,USP理論塔板系數(shù)值10000以上(表3)。表明,該方法對(duì)于徐紫薯6號(hào)花青素具有良好的分離效果。

表3 徐紫6號(hào)花青素的USP分離度及USP理論塔板系數(shù)Table 3 The USP resolution and USP theoretical plate number of Xuzishu NO.6

2.4 徐紫薯6號(hào)花青素的年份及薯塊個(gè)體差異

為了驗(yàn)證不同收獲年份以及同一收獲年份內(nèi)不同薯塊個(gè)體對(duì)徐紫薯6號(hào)花青素的影響,選取XZ15、XZ16-1、XZ16-2三份樣本各200 mg,并按照1.2.3項(xiàng)樣品處理方法進(jìn)行處理,得到3份供試樣本,并按照1.2.4項(xiàng)方法進(jìn)行HPLC分析得到每份樣品的花青素HPLC圖譜(圖3A)。由圖3B可知,同為16年收獲的XZ16-1、XZ16-2兩份樣本花青素組成及含量相似,主要成分為Peak 8并且全部都含有13種相同的花青素組分。XZ15由于保存時(shí)間較長(zhǎng),花青素總量稍低于XZ16-1、XZ16-2樣本但其主要成分仍為Peak 8,且含有全部13種花青素組成。因此得知,徐紫薯6號(hào)花青素的成分組成以及含量受到個(gè)體差異和收獲年份的影響較小。

圖3 不同收獲年份徐紫薯6號(hào)花青素組成Fig.3 Anthocyanin components of Xuzishu NO.6 between harvest years注:A:不同年份徐紫薯6號(hào)花青素各組分HPLC圖譜(徐州地區(qū));B:不同年份徐紫薯6號(hào)花青素各組分含量(徐州地區(qū))。

2.5 徐紫薯6號(hào)花青素產(chǎn)地差異

作為紫甘薯的重要次生代謝產(chǎn)物之一,花青素的組成較為復(fù)雜且受到種植環(huán)境因素影響明顯。為了驗(yàn)證種植地對(duì)花青素組成的影響,利用1.2.4項(xiàng)方法對(duì)XZ15、SN15、YC15樣本進(jìn)行檢測(cè)。

圖4、圖5表明,三地收獲的徐紫薯6號(hào)在花青素組成成分,含量比例上有較大的差異。XZ15花青素總含量最高,并且含有13個(gè)組分,主要成分為Peak 8,其含量約在總含量的30%以上。SN15雖然含有全部13個(gè)組分,但其無(wú)論是花青素總含量還是各組分含量均低于另外兩產(chǎn)地。

YC15僅含有8個(gè)組分,且3號(hào)組分在其它兩地均占13%以上,而其僅為2.28%。然而YC15主要成分8號(hào)峰含量達(dá)100897(Au/min),占總含量的64.30%,同時(shí),Peak 9含量也遠(yuǎn)高于其他兩地。本實(shí)驗(yàn)中,鹽城林業(yè)站試驗(yàn)田位于沿海灘涂地帶,其距海邊的直線距離僅為5 km左右,屬于典型的粉砂淤泥質(zhì)海岸[27]。鹽城海岸線作為江蘇的主要海岸線,合理利用灘涂地區(qū)是江蘇農(nóng)業(yè)新增長(zhǎng)點(diǎn)的主要方向。徐紫薯6號(hào)的親本之一徐薯18是高耐鹽品種[28],有報(bào)道指出[29],徐紫薯6號(hào)也具有較強(qiáng)的耐鹽特性。徐紫薯6號(hào)作為灘涂地區(qū)適宜作物之一,其在鹽堿地種植后,花青素組分的丟失以及總含量的下降是目前面臨的問(wèn)題之一。

圖4 三產(chǎn)地徐紫薯6號(hào)花青素指紋圖譜Fig.4 HPLC fingerprint of anthocyanidins in Xuzishu NO. 6 from 3 district

圖5 三種植試點(diǎn)區(qū)徐紫薯6號(hào)花青素組成Fig.5 Anthocyanin components of Xuzishu NO.6 from 3 origins

2.6 徐紫薯6號(hào)花青素主要組分

由圖2可知,徐紫薯6號(hào)與混合花青素含有共有成分,即Peak 8、Peak 10、Peak 11、Peak 13。五種成分按文獻(xiàn)[30]的方法進(jìn)行初步判斷,花青素的?；吞腔赏ㄟ^(guò)其在440 nm處的吸光值以及其最大吸光值等數(shù)據(jù)進(jìn)行初步判斷(表4)。

表4 4種花青素單體吸光值及成分鑒定Table 4 Absorbance and identification of 4 individual anthocyanins

由表4可知,4種花青素組分A440/Avis值均處于15%～24%的范圍,證明這4種花青素單體均為雙糖結(jié)構(gòu),而只有Peak 8和Peak13的Aacyl/Avis值處于98%～128%的范圍,證明這兩種花青素單體為雙?；Y(jié)構(gòu)。而其它3種的?；Y(jié)構(gòu)并不確定。由文獻(xiàn)[31]可知,徐紫薯6號(hào)的主要成分為矢車(chē)菊素-3-咖啡酰-p-羥基苯甲酰-槐糖苷-5-葡萄糖苷即Peak 8。同時(shí),文獻(xiàn)[32-33]和其吸光值也證明了其結(jié)構(gòu)為此。結(jié)合得出,Peak 10為芍藥素-3-雙咖啡酰-槐糖苷-5-葡萄糖苷、Peak 11為芍藥素-3-咖啡酰-對(duì)羥基苯甲酸-槐糖苷-5-葡萄糖苷、Peak 13為芍藥素-3-咖啡酰-阿魏酰-槐糖苷-5-葡萄糖苷。

2.7 徐紫薯6號(hào)花青素指紋特征的聚類分析

為驗(yàn)證徐紫薯6號(hào)花青素指紋特征受到年份、個(gè)體以及不同種植地等因素的影響情況圖6,取XZ15、XZ16-1XZ16-2、SN15、YC15五個(gè)樣本的組分構(gòu)成以及相應(yīng)峰面積作為變量進(jìn)行聚類分析[34]。在分析過(guò)程中,由于樣本數(shù)量級(jí)、計(jì)量等方面影響使得各指標(biāo)之間不具有綜合性,因此需要對(duì)個(gè)指標(biāo)數(shù)目進(jìn)行處理后分析[35]。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,峰面積作為主要變量之一,其數(shù)值從700～100897范圍不等,因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選擇對(duì)其無(wú)量綱化后在進(jìn)行聚類分析。

圖6 徐紫薯6號(hào)花青素含量樹(shù)狀圖 Fig.6 Dendrogram of anthocyanin content in Xuzishu No.6

聚類分析結(jié)果表明,XZ15、XZ16-1、XZ16-2三份樣本相似度很高,在5次迭代內(nèi)合為一類。而SN15樣本由于各組分含量較低但組分構(gòu)成仍為13種,因此在10次迭代內(nèi)合為一類。YC15樣本則由于組分少,組分占比不同等原因?yàn)閱为?dú)一類。因此,通過(guò)聚類分析的方法對(duì)各份樣本綜合分析發(fā)現(xiàn),徐紫薯6號(hào)花青素的指紋特征與其收獲年份、個(gè)體差異等影響較小,其差異主要受到種植地區(qū)的影響。

3 結(jié)論

本文建立了測(cè)定徐紫薯6號(hào)花青素的高效液相色譜法,該方法利用常規(guī)C18分離柱,采用磷酸乙腈預(yù)混合流動(dòng)相洗脫,即可得到分離程度良好的13種花青素。本研究發(fā)現(xiàn),徐紫薯6號(hào)甘薯花青素主要成分為矢車(chē)菊素-3-咖啡酰-p-羥基苯甲酰-槐糖苷-5-葡萄糖苷,同時(shí),其花青素總含量和組分構(gòu)成受到種植地域影響明顯。本方法靈敏度高,重現(xiàn)性好,操作簡(jiǎn)單快速,可以滿足以徐紫薯6號(hào)花青素組分構(gòu)成檢測(cè)要求,并且可以根據(jù)其組分差異作為產(chǎn)地溯源的指標(biāo)之一。本文對(duì)4種主要花青素組分進(jìn)行了組分初步鑒定,其余受到影響明顯的組分如Peak 3、Peak 9等還需要進(jìn)一步的成分鑒定。