丹參不同愈傷組織誘導及遺傳轉化體系優(yōu)化

張林甦 邵芬娟 秦利軍

摘要： 為了獲得滿足不同目的組織培養(yǎng)材料和穩(wěn)定高效的遺傳轉化體系，該研究以丹參葉片和莖段為外植體，采用含不同濃度的植物激素（植物生長物質）的Murashige Skoog（MS）培養(yǎng)基，探索誘導丹參產(chǎn)生不同愈傷的條件；采用正交法考察浸染時間、共培養(yǎng)時間、篩選壓等對農(nóng)桿菌介導的丹參遺傳轉化體系的影響，并根據(jù)出芽率及轉化陽性率優(yōu)化丹參遺傳轉化體系。結果表明：（1）能較快誘導丹參葉片產(chǎn)生愈傷的是MS+0.5 mg·L1 6BA+0.5 mg·L1 2，4D；誘導莖較快產(chǎn)生愈傷的是MS+0.1mg·L1 NAA+0.5 mg·L1 6BA； 1 mg·L1反式玉米素（ZR）可能有利于誘導產(chǎn)生含有丹參酮的愈傷組織；1.0 mg·L1 2，4D較易誘導丹參愈傷組織生根。（2）以卡那霉素為篩選劑時農(nóng)桿菌GV3101介導的丹參遺傳轉化的條件為浸染5 min、共培養(yǎng)1 d、卡那霉素30 mg·L1篩選，經(jīng)PCR鑒定轉基因陽性率為60%；而用10 mg·L1鏈霉素篩選陽性率達70%。該研究結果確定了丹參不同愈傷組織誘導條件，明確了以卡那霉素為篩選劑時農(nóng)桿菌GV3101介導的丹參遺傳轉化的條件，換用10 mg·L1鏈霉素篩選時體系更加穩(wěn)定、更易操作、更易重復。

關鍵詞： 丹參， 愈傷， 誘導， 遺傳轉化

中圖分類號： Q943.1， Q94336

文獻標識碼： A

文章編號： 10003142（2017）01010207

Abstract： With the decoding of its genome， Salvia miltiorrhiza， belonging to labiatae （Lamiaceae） sage （Salvia Linn）， is becoming an important model medicinal plant and is being widely studied. The earliest record of S. miltiorrhiza can be found in more than two thousand years ago in the Sheng Nongs Herbal Classic in which S. miltiorrhiza was listed as one of the top grade drugs. S. miltiorrhiza has a long history in treatment of many cardiovascular and cerebrovascular diseases. The active components of S. miltiorrhiza are divided into two categories： watersoluble phenolic acids and lipidsoluble tanshinones. As an important medicinal mode plant with long history， the biosynthetic pathways of S. miltiorrhiza active contents tanshinones and phenolic acids attract growing research interests. An appropriate tissue culture condition and a simple， stable and efficient genetic transformation system are very important in the research of the plant S. miltiorrhiza. Based on former studies， we investigated culture conditions to induce different S. miltiorrhiza calluses using different phytohormones on Murashige Skoog medium. And through a four factorthree level orthogonal design， we investigated the effects of submerging time， coculture time， screening pressure and concentrate of acetosyringone. The results of callus induction were that： MS+0.5 mg·L1 6BA+0.5 mg·L1 2，4D induce callus faster than other explants， while MS+0.1 mg·L1 NAA+0.5 mg·L1 6BA was suitable in inducing stems； 1 mg·L1 transzeatin could induce brawn callus maybe contain more tanshinone， 1.0 mg·L1 2，4D could induce more roots on callus. And the confirmed agrobacteriummediated genetic transformation parameters for agrobacterium tumefaciens GV3101 harboring nptII gene plasmid were： submerging 5 min， coculture 1 d and screening at 30 mg·L1 kanamycin， the positive ratio of transgenic plant by PCR verification was 60%. When submerging 5 min， coculture 1 d and screening at 10 mg·L1 streptomycin the transgenic plant positive rate was 70%. The later transgenic system seemed more stable and easier to be repeated in this trial， maybe due to the less toxic of streptomycin which indicated that streptomycin maybe another candidates for transgenic screening in S. miltiorrhiza. The determination of different callus inducing condition and the optimizing of genetic transformation system provide useful appliancation in further researches of S. miltiorrhiza.

Key words： Salvia miltiorrhiza， callus， induction， genetic transformation

丹參（Salvia miltiorrhiza）為鼠尾草屬（Salvia Linn.）植物，其藥用歷史悠久，最早記載于

瘙爯神農(nóng)本草經(jīng)

瘙爲和

瘙爯吳普本草

瘙爲，現(xiàn)臨床上廣泛應用于心腦血管等多種疾病的治療（趙陽等，2010；李佑生等，2006；戈升榮等，2002）。丹參的有效成分為兩大類代表性次生代謝物質：萜類（丹參酮）和酚酸類（丹酚酸）（鄭國墀和柿澤寬，1989； Ma et al，2012； Ma et al，2015）。同時，由于丹參基因組較小，生長條件簡單、生長周期快，已經(jīng)成為研究藥用植物萜類和酚酸類的模式植物（宋經(jīng)元等，2013）。隨著模式植物如擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、楊樹（Populus）等在分子水平上的研究不斷深入，為人們認識和了解植物的生長發(fā)育及其調控機理提供了大量的參考（Mukherjee et al，2015；Del ToroDe et al，2016； Shi et al，2015；Ding & Nilsson， 2015）。因此，組織快繁再生、遺傳轉化等技術是對植物進行研究的重要基礎。

丹參的組織培養(yǎng)條件寬泛，一定范圍內的植物激素（植物生長物質）配比均能誘導出愈傷并再生植株（王建英和劉滌，1987；胡月紅等，1992；姜廣奮，1994；趙潔等，1999；田宇紅和王喆之等，2003）。郭肖紅等（2007a， b）主要從培養(yǎng)基的氮源、碳源及有機物等方面研究了丹參不定根的培養(yǎng)條件，張蔭麟等（1997）用發(fā)根農(nóng)桿菌和根癌農(nóng)桿菌轉化丹參得到冠癭瘤和毛狀根再生得到丹參植株，但是他們沒有轉入目的基因，沒有涉及抗性篩選的步驟。這些研究對于丹參的組織培養(yǎng)具有重要意義，但是至今還沒有系統(tǒng)性的試驗，尤其是從不同植物激素的影響來探討丹參不同愈傷產(chǎn)生的條件，而這些不同愈傷對于丹參的進一步研究具有重要意義。對于丹參的遺傳轉化體系，最早是王倩（2005）、王麗娟（2005）和Yan & Wang （2007）報道了用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化體系，他們構建了含有目的基因的載體并經(jīng)根癌農(nóng)桿菌轉化丹參葉片獲得陽性植株。Cui et al （2015）也用RNAi載體成功轉化出轉基因丹參。但是由于丹參品種不同、載體不同、農(nóng)桿菌不同等原因，本實驗室在丹參遺傳轉化實驗中發(fā)現(xiàn)采用已有方法其結果隨機性較大，很多時候轉化后的丹參葉片停止生長。因此在參閱已有文獻的基礎上，筆者摸索了丹參葉片和莖段為外植體誘導不同愈傷產(chǎn)生的條件，用正交法系統(tǒng)地對丹參遺傳轉化體系進行了研究，優(yōu)化得到較易重復的遺傳轉化體系，為丹參植物的組織培養(yǎng)研究提供了更多的基礎工具。

1材料與方法

1.1 材料和試劑

丹參苗（993品系）由中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所盧善發(fā)實驗室擴繁保存。帶有NPTII基因激活標簽載體由筆者先期構建，并轉入農(nóng)桿菌GV3101。植物激素6BA、NAA、2，4D及瓊脂粉為Sigma公司產(chǎn)品，硫酸卡那霉素為Amresco公司產(chǎn)品，MS培養(yǎng)基粉末購自phytotech公司，DNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 丹參組織培養(yǎng)

切下丹參993成熟無菌苗帶腋芽的莖段接種于1/2MS培養(yǎng)基（含30%蔗糖，0.85%的瓊脂）繼代，2個月左右長成成熟植株，取較為幼嫩的丹參葉片切成0.5 cm × 0.5 cm的方形，莖段1 cm左右，接種在附加不同濃度植物激素的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，10 d左右更換一次培養(yǎng)基，15～20 d觀察愈傷及不定芽出芽情況。切下不定芽接種于1/2MS培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)。待1～2個月后丹參苗生根較多、苗較壯時移栽在土里繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 丹參遺傳轉化

1.3.1 殺死濃度范圍的確定本實驗激活標簽載體以PBI121為基本載體改造得到，含有NPTII基因，可編碼編碼新霉素磷酸轉移酶，產(chǎn)生卡那霉素抗性，因此選用不同濃度的卡那霉素來確定殺死濃度范圍（killing scale），同1.2的操作，將丹參無菌葉片切成塊后接種在附加不同濃度卡那霉素的MS培養(yǎng)基中（含NAA 0.1 mg·L1+BA 1.0 mg·L1），20 d時觀察出芽及生長情況。

1.3.2 遺傳轉化體系確定以正交法設計實驗，4因素（浸染時間、共培養(yǎng)時間、抗生素濃度及乙酰丁香酮濃度）3水平（低、中、高），采用正交表L9（34），工作表如表2。浸染時間低、中、高分別為3、5、10 min，共培養(yǎng)時間低、中、高分別為1、2和3 d，抗生素卡那霉素濃度低、中、高分別為20、30、40 mg·L1，乙酰丁香酮濃度低、中、高分別為100、200、300 μmol·L1。分為9組，每組4皿（約60個外植體）。30 d內統(tǒng)計外植體出芽率。

1.3.3 丹參遺傳轉化按照最終選定的遺傳轉化條件：浸染5 min、共培養(yǎng)1 d、卡那霉素30 mg·L1篩選，按照1.2的操作方法浸染一批丹參葉片，待不定芽長出后切下不定芽接種于1/2MS培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)。1～2個月后待轉基因丹參苗生根較多、苗較壯時移栽在土里繼續(xù)培養(yǎng)待PCR鑒定。

1.4 轉基因植株的PCR鑒定

每棵丹參苗取1片葉片（帶葉柄）液氮研磨，按北京艾德萊公司CTAB植物基因組 DNA提取試劑盒DN14說明書步驟提取DNA，電泳檢查DNA提取質量。提取的DNA 2 μL為模板，用NPTII正向引物（GTATCCATCATGGCTGATGCA AT）、反向引物（GAAGAACTCGTCAAGAAGGCGA）各1 μL， 2×premix rTaq 10 μL，水6 μL，總共20 μL體系進行PCR擴增，PCR擴增程序為94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、 72 ℃ 1 min 30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物10 μL上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測是否有目的條帶。同時以野生型丹參作對照（CK）。

2結果與分析

2.1 各種激素配比情況下丹參愈傷誘導情況

從表1可以看出，丹參的愈傷較容易誘導，除了Y4 培養(yǎng)基誘導出的愈傷是深褐色，其余均為綠色或淺綠色，具有較好的再生能力，D1誘導的愈傷易生根。Y2培養(yǎng)基誘導愈傷最快，10 d左右可觀察到愈傷，Y1培養(yǎng)基誘導莖產(chǎn)生愈傷快于誘導葉。根據(jù)這些結果，對于不同的實驗目的可以選擇不同的誘導條件：Y1適合于以莖作為外植體，Y4可能適合于考查愈傷組織產(chǎn)丹參酮的研究（丹參酮呈紅色，會令愈傷的顏色較深）， D1適合用于對丹參根的研究，而探索丹參遺傳轉化體系，需要較多可再生的芽，因此在后續(xù)實驗中選擇出芽較多的Y3培養(yǎng)基。

2.2 殺死濃度范圍

通過觀察丹參葉片在含不同濃度的卡那霉素培養(yǎng)基上的生長狀況考察丹參對卡那霉素敏感的敏感性。發(fā)現(xiàn)高濃度卡那霉素抑制外植體生長，70 mg·L1卡那霉素10 d內使葉片褐化，不加卡那霉素的葉片一直可保持鮮活綠色。葉片生長狀況及出芽率（表2）隨卡那濃度降低而好轉。未經(jīng)農(nóng)桿菌浸染的丹參葉片可耐受50 mg·L1的卡那霉素。

2.3 丹參遺傳轉化體系確定

農(nóng)桿菌的浸染對丹參葉片的生長會有影響，因此將浸染后的卡那霉素篩選濃度梯度設為40、30、20 mg·L1。將浸染時間、共培養(yǎng)時間、卡那霉素濃度和乙酰丁香酮濃度按正交表L9（34）設計實驗，考察丹參葉片出芽率，統(tǒng)計結果見表3。

由表3可知，影響丹參遺傳轉化出芽率的主要因素是浸染時間、共培養(yǎng)時間和選擇壓。乙酰丁香酮的濃度對雙子葉植物的轉化影響不明顯（因后續(xù)重復實驗中去除乙酰丁香酮對出芽率無大的影響）。浸染時間短（3 min）外源基因整合到丹參基因組的幾率理論上會下降，但是1～3 d的共培養(yǎng)可以減輕這個問題。浸染時間長（10 min）對丹參葉片的損傷較大，有些葉片浸染后呈現(xiàn)褐色，后面的生長狀態(tài)受影響，出芽不多。浸染5 min左右較為適宜，第4組和第6組均能達到45%左右的出芽率，但是第6組共培養(yǎng)時間較長，農(nóng)桿菌的生長旺盛，染菌的幾率加大。因此綜合考慮，確定遺傳轉化條件為浸染5 min，共培養(yǎng)1 d，卡那霉素30 mg·L1。轉基因過程及植株生長狀況見圖1。

2.4 轉基因植物的鑒定

提取兩組轉基因苗的DNA，第1組：浸染5 min，共培養(yǎng)1 d，用30 mg·L1卡那霉素篩選，第2組：浸染5 min，共培養(yǎng)1 d，用10 mg·L1鏈霉素篩選，每組10株，DNA經(jīng)電泳檢測質量（圖2：A，C），然后分別用NPTII基因的正反向引物做PCR擴增做轉基因鑒定，電泳結果見圖2。第1組10棵植株中有6棵呈陽性（第3，第4，第5，第7，第8，第9號植株），野生型CK沒有條帶（圖2：B），轉基因陽性率達60%。第2組陽性率達到70%（圖2：D）。這說明本研究丹參遺傳轉化方法可行，用鏈霉素篩選陽性率高于用卡那霉素篩選。

3討論與結論

丹參作為重要的藥用植物在心腦血管及神經(jīng)退行性疾病等方面具有治療作用（趙陽等，2010； Zhang et al，2015），其中的有效成分丹參酮主要存在于根。 因此丹參的組織培養(yǎng)中對于丹參根及丹參酮的關注較多。本研究通過系統(tǒng)考察不同的激素配比得到不同的愈傷組織，發(fā)現(xiàn)在MS培養(yǎng)基中僅用反式玉米素ZR可誘導出褐色愈傷，此色素見光易分解，這與丹參酮的特點一致，因此可考慮將反式玉米素用于誘導丹參酮的研究。丹參的毛狀根可以用來研究丹參的次生代謝物（Zhang et al，2015； Shi et al，2016），但是這個過程需要發(fā)根農(nóng)桿菌、或攜帶相關基因的發(fā)根農(nóng)桿菌的刺激或基因整合，與植物正常條件下的生長狀態(tài)不同，不定根可以作為研究丹參根生長發(fā)育的工具，我們發(fā)現(xiàn)1.0 mg·L1的2，4D可以促進丹參愈傷生根。因此對于不同的研究目的，我們可以采用不同的愈傷誘導條件。

丹參作為藥用模式植物（Tian， 2011），在分子層面的研究離不開快捷穩(wěn)定的遺傳轉化體系。王喆之課題組在利用陜西本地的丹參葉片作外植體，在遺傳轉化方面做了大量工作（王倩，2005；王麗娟，2005；Yan & Wang，2007），Cui et al（2015）用山東白花丹參葉片作外植體也取得成功。 但是由于丹參品種繁多且種間差異大、外植體培養(yǎng)條件及狀態(tài)不同等原因，我們用已經(jīng)完成基因組測序的紫花丹參993品系無菌苗按照已報道的方法在本研究室只有最開始的一批轉化成功，成為制約進一步實驗的瓶頸?？敲顾刈鳛楹Y選抗性基因NPTII的常用抗生素，主要是通過與30S核糖體結合，影響mRNA密碼的讀取，從而導致蛋白翻譯受阻。雖然我們的實驗表明了丹參葉片對卡那霉素敏感，但是用它做篩選劑重現(xiàn)性差，常常發(fā)現(xiàn)葉片停止生長。鏈霉素同屬于氨基糖苷類，具有相同的作用機制，但是在這類抗生素中毒性較小。在本實驗中也證實用工作濃度（10 mg·L1）的鏈霉素篩選可以獲得較高的轉基因陽性率，同時實驗重現(xiàn)性較好。因此認為，鏈霉素似可以作為卡那霉素篩選劑的替代品，當然這還需要在其他物種中嘗試驗證。莖也是丹參遺傳轉化的好材料，但是在實際操作中，浸染農(nóng)桿菌后農(nóng)桿菌進入到其內部，在后期農(nóng)桿菌較難除凈，因此我們選擇葉片作為遺傳轉化外植體。另外，我們摸索出的浸染時間和共培養(yǎng)時間大大縮短（浸染5 min，共培養(yǎng)1 d與報道的浸染20 min、共培養(yǎng)3 d相比）（Yan & Wang， 2007），這也簡化了實驗操作，減少了后期因農(nóng)桿菌污染的風險。這些方法的優(yōu)化改進為深入研究丹參植物提供了很好的技術保障。

致謝感謝中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所盧善發(fā)老師的指導及提供場地和經(jīng)費支持。

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