木薯eIF4E7基因RNAi載體構建及沉默效果分析

張秀春 武亞丹 張春微 王健華 余乃通 劉志昕

摘 要 由木薯褐色條斑病毒（Cassava brown steak virus，CBSV）和烏干達木薯褐色條斑病毒（Uganda Cassava brown steak virus，UCBSV）引起的木薯褐色條斑病毒病（CBSD）嚴重威脅著非洲木薯種植業(yè)的發(fā)展，且目前沒有十分有效的防治方法。病毒侵染植物需要借助植物的翻譯和復制系統(tǒng)來完成基因組的翻譯及自身的復制，其中真核翻譯起始因子4E（eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E）是多種 RNA 病毒侵染植物的必需因子。eIF4E7是木薯編碼的eIF4E基因家族成員之一，本研究構建該靶標基因的RNAi表達載體p1300-Ca4E7。本生煙瞬時表達系統(tǒng)結合半定量RT-PCR的方法證明，該載體能高效沉默過量表達載體pAI-Ca4E7中的eIF4E7基因在本生煙葉片中的表達。研究結果為進一步研究木薯eIF4E7在CBSV及UCBSV侵染中的作用以及利用 RNA技術干擾植物基因的病毒防治新策略奠定基礎。

關鍵詞 木薯；eIF4E7；干擾載體；本生煙瞬時表達；半定量RT-PCR；沉默效果

中圖分類號 S435.33 文獻標識碼 A

Abstract Cassava（Manihot esculenta Grantz）production in large areas of Africa is severely affected by cassava brown streak disease（CBSD）which is caused by two virus species， cassava brown streak virus（CBSV）and Ugandan cassava brown streak virus（UCBSV）. At present， there is no effective strategy for preventing CBSD. To complete the translation and replicaiton of its genome， virus need to employ the translation and replication system of host. During virus infection plants eukaryotic initiation factor 4E（eIF4E）has been implicated a necessary factor for a variety of RNA viruses. Cassava eIF4E7 is one member of Cassava eIF4E family. At present study we develop a interfering construct p1300-Ca4E7 which targetting Cassava eIF4E7 gene and demonstrate the construct can interfere the expression of eIF4E7 gene efficiently by employing the N. Banthemiana transient expression system and the semi-quantitative RT-PCR as well. The result pave a way for further investigating the function of Cassava eIF4E7 during the infecton of CBSV and UCBSV. It also provide theoretical basis for the new strategy of anti-virus by targeting host genes with RNAi technology.

Key words Cassava（Manihot esculenta Crantz）； eIF4E7； interference vecter； N. Banthemiana Transient Expression System； semi-quantitative RT-PCR； interference Efficiency

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.015

木薯褐色條斑病毒病（CBSD）在烏干達等國家發(fā)生嚴重危害，導致減產30%～85%，主要癥狀表現為葉片發(fā)黃、枝條的皮上有褐色壞死、老枝條上出現褐色條紋、塊根褐色壞死。由于該病不僅導致減產，還使塊根不適于食用，已被視為比木薯花葉病毒病危害更大的病害，是熱帶非洲糧食安全的主要威脅之一。CBSD是由屬于Potyviridae科Ipomovirus屬的木薯褐色條斑病毒（Cassava brown steak virus，CBSV）和烏干達木薯褐色條斑病毒（UCBSV）引起的，它們都是單組分正鏈RNA病毒，通過單一開放閱讀框表達產生一種多肽前體，可翻譯切割成10種成熟蛋白，自基因組5′起分別為P3、6K1、CI（helicase）、6K2、VPg、NIa-Pro、RdRp、CP、PIPO和P3[1]。

病毒由于擁有極小的基因組，需要借助植物的翻譯和復制系統(tǒng)來完成基因組的翻譯及自身的復制。植物寄主對病毒的敏感性取決于病毒蛋白與植物“易感基因”編碼蛋白之間的密切相互作用。任何打破病毒與植物編碼蛋白之間的相互作用都會導致寄主敏感性的喪失，從而對病毒感染產生抗性[2]。自然界中存在的隱性抗性基因，就是由于植物翻譯和復制系統(tǒng)中相關蛋白因子的功能喪失或者以病毒不能識別的方式存在，病毒無法在寄主體內完成增殖，致使植株獲得對病毒的抗性。馬鈴薯Y病毒（Potyviruses）的研究結果顯示，大部分隱性抗病基因是轉錄起始因子（eIF4E）基因家族的等位基因。由于少數關鍵位點變異，病毒的基因組連接蛋白（VPg）無法識別并與其相互作用，導致病毒不能復制，從而對病毒產生免疫力。利用基因工程手段敲除或突變寄主eIF4E類因子可以使番茄、甜瓜等作物獲得對CVYV、MNSV等馬鈴薯Y病毒的抗性[3-6]，也進一步證明寄主eIF4E類因子對馬鈴薯Y病毒侵染復制的重要性。

前期研究發(fā)現，木薯eIF4E7與CBSV及UCBSV的VPg蛋白均發(fā)生互作，說明它們很可能在CBSV及UCBSV侵染中起關鍵作用。RNA沉默又稱RNA干擾（RNAi），是指在真核生物中，雙鏈RNA專一的RNaseIII家族核酸內切酶——Dicer或Dicer-like（簡稱DCL）剪切雙鏈RNA或部分雙鏈發(fā)夾結構產生20 nt左右的siRNA（small interference RNA），然后形成RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，簡稱RISCs），利用RNA序列匹配，專一地識別靶標基因，在轉錄水平或轉錄后水平抑制靶標基因表達的現象[7]。本研究構建靶標木薯eIF4E7基因的RNAi表達載體p1300-Ca4E7，并利用本生煙瞬時表達系統(tǒng)結合半定量RT-PCR證明該載體能有效地干擾木薯eIF4E7基因，為研究木薯eIF4E7在CBSV及UCBSV侵染中的作用及通過RNAi技術培育抗多個 CBSV及UCBSV病毒株的木薯品系（或品種）奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒與菌株 RNAi克隆載體p18TRNAi和經改造后的植物表達載體pCAMBIA1300分別由中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所于曉玲副研究員和阮孟斌副研究員提供。質粒pGBKT7-eIF4E7、pAI-ALSV、大腸桿菌DH5α菌株和農桿菌LBA4404由本實驗室保存。

1.1.2 植物材料 本生煙（Nicotiana Banthemiana）由本實驗室培養(yǎng)，以26～28 ℃光照培養(yǎng)，每日光照培養(yǎng)12 h，光照強度為1 500 lx。待植株長至5～6葉期時注射農桿菌。

1.1.3 酶與試劑 各種限制性內切酶、Prime STARR Max DNA Polymerase、T4 DNA Ligase、PCR Mix均購自TaKaRa公司，Gibson AssemblyR Master Mix購自NEW ENGLAND BioLabs公司，TRIzolR Reagent、FastQuant RT Kit（with gDNase）購自TIANGEN生物技術公司，研究中所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 干擾片段的選擇 登錄網站sirna.wi.mit.edu，根據軟件說明書對木薯eIF4E7基因（013732m，https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）進行分析，選取eIF4E7基因第340～656 bp為干擾片段，該區(qū)域包含軟件分析的最有可能產生小RNA的前2個序列。

1.2.2 正反義干擾片段的擴增、連接、轉化及重組子的PCR鑒定 根據從eIF4E7基因中所選取的干擾片段設計引物，引物設計如表1所示。為采用Gibson Assembly技術構建載體，引物前端添加擬連接載體序列（黑體加粗）。G-Ca4E7-364FE和G-Ca4E7-656RC用于擴增反義插入片段Ca4E7R，G-Ca4E7-340FB和G-Ca4E7-656RX用于擴增正義片段Ca4E7F。以pGBKT7-eIF4E7為模板，PCR擴增體系為：5 ng/μ DNA模板1 μL，PrimeSTARR Max Buffer 5 μL（10×），dNTP Mix 4 μL（2.5 μmol/L），上游和下游引物各1 μL，PrimeSTARR HS DNA Polymerase 0.5 μL，補ddH2O至總體積50 μL。擴增條件為：98 ℃ 30 s；98 ℃ 8 s， 55 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.3 利用Gibson Assembly技術構建RNAi克隆載體 利用Gibson Assembly技術將擴增片段Ca4E7R與經EcoRⅠ和ClaⅠ雙酶切回收的p18TRNAi大片段連接，具體操作按NEW ENGLAND BioLabs公司Gibson AssemblyR Master Mix試劑盒說明書進行。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆進行菌液PCR鑒定，鑒定引物為Ca4E7-364FE和G-Ca4E7-656RC；對PCR檢測呈陽性的克隆提取質粒，用EcoRⅠ和BamHⅠ進行酶切鑒定后再進行測序鑒定，將鑒定正確的克隆載體命名為pRNAiCa4E7R。pRNAiCa4E7R經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后回收大片段，采用Gibson Assembly技術將大片段與用引物G-Ca4E7-340FB和G-Ca4E7-656RX進行PCR擴增獲得的產物Ca4E7F連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，挑取質粒進行PCR鑒定，鑒定引物為G-Ca4E7-340FB和G-Ca4E7-656RX；用EcoRⅠ和BamHⅠ對PCR檢測呈陽性的克隆進行酶切鑒定，最后進行測序鑒定。將鑒定正確、含發(fā)夾結構的克隆載體命名為pRNAiCa4E7。PCR擴增體系均為：稀釋質粒1 μL，PCR Mix 15 μL（2×），上游和下游引物各0.6 μL，補ddH2O至總體積30 μL。PCR擴增條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃，30 s 56 ℃，30 s 72 ℃，1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.4 RNAi載體p1300-Ca4E7構建及農桿菌轉化

將表達載體pCAMBIA1300與pRNAiCa4E7經BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，分別回收大小片段進行連接，具體參照T4 DNA Ligase試劑說明書進行。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆進行菌液PCR，鑒定引物為G-Ca4E7-340FB和G-Ca4E7-656RX，反應條件同1.2.3；將經PCR檢測呈陽性的克隆提取質粒，用EcoRⅠ和BamHⅠ進行雙酶切鑒定。采用熱擊法將p1300-Ca4E7轉化農桿菌LBA4404，經PCR鑒定正確后用于本生煙瞬時表達。

1.2.5 過量表達載體pAI-Ca4E7的構建及農桿菌轉化 以pGBKT7-eIF4E7為模板，G-Ca4E7-1FX和G-Ca4E7-687RX為引物擴增eIF4E7基因，采用Gibson Assembly的方法將擴增產物eIF4E7與經XbaⅠ和 XhoⅠ雙酶切回收的pAI-ALSV大片段連接；將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆進行菌液PCR，鑒定引物為G-Ca4E7-1FX和G-Ca4E7-687RX，反應條件同1.2.3；將PCR檢測呈陽性的克隆提取質粒，用XbaⅠ和XhoⅠ進行雙酶切鑒定，將鑒定正確的eIF4E7基因過量表達載體命名為pAI-Ca4E7；采用熱擊法將pAI-Ca4E7轉化農桿菌LBA4404，經PCR鑒定正確后用于本生煙瞬時表達。

1.2.6 農桿菌介導的瞬時表達 將含有eIF4E7基因過量表達載體pAI-Ca4E7、RNAi載體p1300-Ca4E7或表達載體pCAMBIA1300的農桿菌放在YEB液體培養(yǎng)基（含卡那霉素、鏈霉素和利福平各50 μg/mL）中，以28 ℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)24 h；取50 μL菌液至5 mL上述YEB液體培養(yǎng)基進行過夜培養(yǎng)，離心收集菌體，用MMA溶液（10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES和100 μmol/L AS）重懸菌體至OD600=1.0，靜置誘導培養(yǎng)3 h后經注射接種至5～6葉期的本生煙葉片，每個處理重復接種10片葉；將注射后的植物于26～28 ℃中光照培養(yǎng)，每日光照培養(yǎng)12 h，光照強度為1 500 lx。

1.2.7 半定量RT-PCR檢測沉默效果 （1）半定量引物合成。為檢測RNAi載體的干擾效果，使用Primer Premier 5（version 5.00）軟件設計木薯eIF4E7檢測引物Ca4E7-265F和Ca4E7-669R；并選用本生煙肌動蛋白（Actin） mRNA為內標，設計引物NbACT-247F、NbACT-780R，用以消除不同樣品間模板量的差異。具體引物序列見表1。

（2）半定量檢測。分別在注射農桿菌后第4天（4dpi）、第5天（5dpi）和第6天（6dpi）收集本生煙葉片。為減少由于實驗操作造成的樣品誤差，注射后的葉片只取半片，每10半片葉混在一起提取RNA并反轉錄合成cDNA。RNA的提取和反轉錄反應分別按TIANGEN生物技術公司的TRIzolR Reagent、FastQuant RT Kit（with gDNase）說明書進行。

將上述所得cDNA進行間隔3倍的梯度稀釋，以NbACT-247F和NbACT-780R為引物進行PCR擴增。PCR擴增體系為：不同稀釋濃度的cDNA 4 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，NbACT-247F和NbACT-780R各0.5 μL（10 μmol/L），補ddH2O至總體積25 μL。PCR擴增條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，31個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

取與內標NbActin擴增大體一致的樣品進行eIF4E7表達量分析，以Ca4E7-265F和Ca4E7-669R為引物，PCR擴增體系和條件均與內標相同。以上每個獨立實驗重復3次以上。

2 結果與分析

2.1 克隆載體pRNAiCa4E7R的構建

用引物G-Ca4E7-364FE和G-Ca4E7-656RC擴增反義插入片段Ca4E7R，獲得大于250 bp（圖1泳道1）的條帶，擴增大小與預期結果一致。將目的片段過柱回收后與p18TRNAi經EcoRⅠ和ClaⅠ雙酶切回收的大片段連接，構建含反義插入片段的克隆載體pRNAiCa4E7R。用引物G-Ca4E7-364FE和G-Ca4E7-656RC對pRNAiCa4E7R進行PCR鑒定，鑒定結果顯示擴增條帶（圖1泳道2）與目的片段Ca4E7R大小一致。用EcoRⅠ和BamHⅠ對pRNAiCa4E7R進行雙酶切鑒定，所得酶切片段比對照p18TRNAi?。▓D2泳道1），約為500 bp（圖2泳道2），與預期大小一致；測序結果表明，克隆載體pRNAiCa4E7R的插入片段序列與網上公布的序列一致。以上鑒定結果表明，含反義插入片段的pRNAiCa4E7R克隆載體構建成功，可用于下一步實驗。

2.2 克隆載體pRNAiCa4E7的構建

用引物G-Ca4E7-340FB和G-Ca4E7-656RX擴增反義插入片段Ca4E7F，獲得大于250 bp（圖1泳道3）的條帶，擴增大小與預期結果一致。將目的片段過柱回收后與pRNAiCa4E7R經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切回收的大片段連接，構建含正反義插入片段、形成發(fā)夾結構的克隆載體pRNAiCa4E7。用引物G-Ca4E7-340FB和G-Ca4E7-656RX對pRNAiCa4E7進行PCR鑒定，鑒定結果顯示擴增條帶（圖1泳道4）與目的片段Ca4E7F大小一致；用EcoRⅠ和BamHⅠ進行雙酶切鑒定，獲得與預期一致、大于500 bp的片段（圖2泳道3）；測序結果表明，克隆載體pRNAiCa4E7的正義插入片段序列與網上公布的序列一致。以上鑒定結果表明，含正反義插入片段、發(fā)夾結構的克隆載體pRNAiCa4E7構建成功，可用于下一步實驗。

2.3 RNAi載體p1300-Ca4E7構建及農桿菌轉化

表達載體pCAMBIA1300與pRNAiCa4E7經BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，分別回收大小片段進行連接、轉化。含Kan抗性平板上的克隆用引物G-Ca4E7-340FB和G-Ca4E7-656RX進行PCR鑒定，鑒定結果顯示擴增條帶（圖1泳道5）與目的片段Ca4E7F大小一致；待鑒定質粒用EcoRⅠ和BamHⅠ進行雙酶切鑒定，切下與克隆載體pRNAiCa4E7大小相同的片段（圖2泳道4與泳道3），說明RNAi載體構建成功，命名為p1300-Ca4E7。采用液氮冷激法將p1300-Ca4E7轉化至根癌農桿菌菌株LBA4404，用G-Ca4E7-340FB和G-Ca4E7-656RX進行PCR鑒定，鑒定結果顯示擴增條帶（圖1泳道6）與目的片段Ca4E7F（圖1泳道3）大小一致，說明p1300-Ca4E7已被成功轉入到農桿菌，形成工程菌，可用于本生煙瞬時表達。

2.4 過量表達載體pAI-Ca4E7構建及農桿菌轉化

用G-Ca4E7-1FX和G-Ca4E7-687RX對pAI-Ca4E7進行PCR鑒定，鑒定結果顯示擴增條帶（圖3泳道2）與目的片段eIF4E7（圖3泳道1）大小一致；用XbaⅠ和XhoⅠ對pAI-Ca4E7進行雙酶切鑒定，切下的小片段與預期大小一致；由于插入基因ALSV內部有1個XbaⅠ位點，從載體pAI-ALSV切下2個小片段（圖4泳道1與泳道2）。鑒定結果表明eIF4E7基因已插入到pAI表達載體，命名為pAI-Ca4E7；經測序驗證可知過量表達載體pAI-Ca4E7構建成功。采用液氮冷激法將pAI-Ca4E7轉化至根癌農桿菌菌株LBA4404，用G-Ca4E7-1FX和G-Ca4E7-687RX進行PCR鑒定，鑒定結果顯示擴增條帶（圖3泳道3）與目的片段eIF4E7（圖3泳道1）大小一致，說明pAI-Ca4E7已成功轉入到農桿菌，形成了工程菌，可用于本生煙瞬時表達。

2.5 半定量RT-PCR檢測沉默效果

為檢測RNAi載體的沉默效果，分別提取注射農桿菌后4dpi、5dpi和6dpi的本生煙葉片RNA進行半定量RT-PCR檢測。結果如圖5所示，在采用本生煙NbActin基因為內標調整樣品cDNA濃度基本一致的情況下（圖5），注射農桿菌后4dpi，單獨注射過量表達載體pAI-Ca4E7或與表達載體pCAMBIA1300共同注射的樣品表達量基本一致，而單獨注射農桿菌的樣品檢測不到木薯eIF4E7基因的表達，說明木薯eIF4E7基因在注射后4dpi能在本生煙中高效瞬時表達。但是，過量表達載體pAI-Ca4E7與干擾載體p1300-Ca4E7共同注射的樣品只檢測到微量的木薯eIF4E7基因表達。注射后5dpi、6dpi的表達情況與注射后4dpi的基本相同。由于干擾載體p1300-Ca4E7與表達載體pCAMBIA1300的大片段是相同的，區(qū)別僅在于干擾載體p1300-Ca4E7含有木薯eIF4E7基因部分片段的發(fā)夾結構，而表達載體pCAMBIA1300的插入片段為sGFP，說明木薯eIF4E7基因的表達量減少是由干擾載體的發(fā)夾結構引發(fā)的基因沉默造成的，所構建的木薯eIF4E7基因RNA干擾載體在體外能有效干擾靶標基因。此外，注射后6dpi過量表達載體pAI-Ca4E7不論單獨注射還是與表達載體pCAMBIA1300共同注射，木薯eIF4E7基因的表達量均有所降低，說明這是由于植物自身的RNAi效果引發(fā)的。

3 討論

隱性抗病基因在植物抗病毒中是普遍存在的，目前已有很多實例顯示隱性抗病基因能夠控制重要的農業(yè)病毒，尤其是對馬鈴薯Y病毒屬病毒，其隱性抗病基因占抗性基因的40%。目前發(fā)現的隱性抗病基因有mo1（萵苣）、nsv（甜瓜）、pot-1（野生馬鈴薯）、pvr1、pvr2、pvr6和pvr2（辣椒）、rym4、rym5和rym6（大麥）、sbm1、wlv和cyv2（豌豆）、va1和va2（煙草）、Isp1-1、Isp1-2和 Isp1-3（擬南芥），tsv1和rymv-1（水稻）等，分別對不同種病毒產生抗性，研究證明這些抗病毒基因大部分是eIF4E家族等位基因，它們之間僅少數位點有差異[8-9]。

前期研究發(fā)現木薯編碼的eIF4E基因家族成員013732m（本文中命名為eIF4E7）與CBSV及UCBSV的VPg蛋白的均發(fā)生互作（實驗數據尚未發(fā)表），說明它們很可能在CBSV及UCBSV侵染中起關鍵作用。為深入研究木薯eIF4E7在CBSV及UCBSV侵染中的作用以及通過RNAi技術培育獲得抗多個CBSV及UCBSV病毒株的木薯品系（或品種），本研究構建靶標木薯eIF4E7基因的RNAi表達載體p1300-Ca4E7，并利用本生煙瞬時表達系統(tǒng)結合半定量RT-PCR對其干擾效果進行研究。

由于木薯轉化工作不僅耗時長，而且難度比較大[10]，因此很有必要在用于轉化木薯之前鑒定所構建的RNAi載體是否能有效地沉默靶標基因。為檢測干擾載體p1300-Ca4E7的沉默效果，本研究采用本生煙瞬時表達結合半定量RT-PCR的方法，構建了木薯eIF4E7基因的過量表達載體pAI-Ca4E7，并利用農桿菌注射法將其單獨或與干擾載體p1300-Ca4E7一起轉入本生煙葉片中表達。半定量RT-PCR分析表明注射后第4天表達載體pAI-Ca4E7能在本生煙葉片中高效表達eIF4E7基因，但將pAI-Ca4E7與干擾載體p1300-Ca4E7一起注射后eIF4E7基因的表達量明顯降低，說明構建的木薯eIF4E7基因RNA干擾載體能有效沉默靶標基因。與文獻報道的方法（利用轉化體系成熟的植物如擬南芥[11]、煙草[12]、水稻[13]等，或導入原生質體后再進行RT-PCR檢測[14]）比較，本研究采用的RNAi載體沉默效果檢測方法具有簡單、快捷、靈敏等特點。注射農桿菌后第4天便可進行檢測，而轉化體系成熟的模式植物獲得轉基因植物至少也需要3個月的時間；利用原生質體時間雖然相對短，但原生質體的制備還是比較困難。本研究構建高效沉默該基因的RNAi載體，為研究木薯eIF4E7在CBSV及UCBSV侵染中的作用及通過RNAi技術培育獲得抗多個CBSV及UCBSV病毒株的木薯品系（或品種）奠定基礎。

參考文獻

[1] Cui X Y， Wei T Y， Chowda-Reddy R V， et al. The Tobacco etch virus P3 protein forms mobile inclusions via the early secretory pathway and traffics along actin microfilaments[J]. Virology， 2010， 397： 56-63.

[2] Fraile A， Garcia-Arenal F. The Coevolution of Plants and Viruses： Resistance and Pathogenicity[J]. Adv Virus Res， 2010， 76： 1-32.

[3] Mazier M， Flamain F， Nicola1·· M， et al. Knock-down of both eIF4E1 and eIF4E2 genes confers broad-spectrum resistance against potyviruses in tomato[J]. PLoS One， 2011， 6（12）： e29595.

[4] Rodriguez-Hernandez A M， Gosalvez B， Sempere R N， et al. Melon RNA interference （RNAi） lines silenced for Cm-eIF4E show broad virus resistance[J]. Molecular Plant Pathology， 2012， 13（7）： 755-763.

[5] Ashby J A， Stevenson C E M， Jarvis G E， et al. Structure-based mutational analysis of eIF4E in relation to sbm1 resistance to pea seed-borne mosaic virus in pea[J]. PloS One， 2011， 6（1）： e15873.

[6] Wang X， Kohalmi S E， Svircev A， et al. Silencing of the host factor eIF （iso） 4E gene confers plum pox virus resistance in plum[J]. PLoS One， 2013， 8（1）： e50627.

[7] Deleris A， Gallego-Bartolome J， Bao J， et al. Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense[J]. Science， 2006， 313（5 783）： 68-71.

[8] Acosta-Leal R， Xiong Z. Intrahost mechanisms governing emergence of resistance-breaking variants of potato virus Y[J]. Virology， 2013， 43： 39-47.

[9] Acosta-Leal R， Xiong Z. Complementary functions of two recessive R-genes determine resistance durability of tobacco ‘Virgin A Mutant （VAM） to potato virus Y[J]. Virology， 2008， 379（2）： 275-283.

[10] Zhang P， Puonti-Kaerlas J. Regeneration of transgenic cassava from transformed embryogenic tissues[J]. Methods Mol Biol， 2005， 286： 165-176.

[11] 尹明智， 官 梅， 肖 鋼， 等. DOF轉錄因子AtDof1.7 RNA干擾載體的構建及擬南芥的遺傳轉化[J]. 作物學報， 2011， 37（7）： 1 196-1 204.

[12] 韓海洋， 孫 煥， 王雪華， 等. JcERF1基因RNA干擾載體的構建、轉化及沉默效果研究[J]. 四川大學學報， 2015， 52（5）： 1 164-1 170.

[13] 劉燕霞， 彭 廷， 趙亞帆， 等. 水稻簡易RNAi載體構建及沉默效果鑒定[J]. 農業(yè)生物技術學報， 2014， 22（7）： 832-840.

[14] 霍 鵬， 言 普， 沈文濤， 等. 番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因嵌合hpRNA載體一步快速構建及沉默效果的研究[J]. 生命科學研究， 2016， 20（1）： 50-56.