離體葉片接種法鑒定大豆疫霉根腐病抗病性

劉淼 來(lái)永才 李煒 畢影東 劉明 徐鵬飛 李琬 王玲 邸樹(shù)峰 丁俊男

摘要[目的]探討離體葉片接種法鑒定野生大豆抗病性的準(zhǔn)確性和可靠性。[方法]利用24份栽培大豆對(duì)離體葉片接種法和下胚軸傷口接種法的可行性進(jìn)行考察，并利用離體葉片接種法對(duì)177份黑龍江省采集的野生大豆資源進(jìn)行了抗病性鑒定。[結(jié)果]離體葉片接種法與下胚軸接種法之間的相關(guān)呈極顯著，且2種方法差異不顯著，證明了離體葉片接種法進(jìn)行大豆疫霉根腐病抗性鑒定同樣準(zhǔn)確可行。通過(guò)離體葉片接種法對(duì)177份黑龍江省采集的野生大豆資源的抗病性鑒定，獲得27份抗病材料。[結(jié)論]離體葉片接種法操作簡(jiǎn)單，適合野生大豆抗病性鑒定。

關(guān)鍵詞野生大豆；大豆疫霉根腐病；抗病鑒定；葉片

中圖分類(lèi)號(hào)S565.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）11-0043-04

Abstract[Objective] To explore accuracy and reliability of resistance identification of cultivated soybean sources to Phytophthora root rot by leaf inoculation method. [Method] We studied the accuracy of resistance identification of 24 soybean sources to Phytophthora root rot by leaf inoculation method and hypocotyl wound inoculation method， and identified 177 G. soja varieties from Heilongjiang by leaf inoculation method. [Result] There was significant correlation between leaf inoculation and hypocotyl inoculation method， and there were no significant differences between the two methods. At same time， 177 G. soja varieties from Heilongjiang were valuated the reactions to P. sojae race 1 by way of leaf inoculation. Of all the varieties tested， 27 were resistant. [Conclusion] The leaf inoculation is easy to operate and suitable for the resistant identification of wild soybean.

Key wordsGlycine soja；Phytophthora sojae；Disease resistance identification；Leaf

大豆疫霉根腐病（Phytophthora sojae Kaufmann & Gerdemann）是一種土傳性真菌病害[1-3]。自1989年沈崇堯等[4]首次在我國(guó)大豆主產(chǎn)區(qū)分離到大豆疫霉根腐病病原菌以來(lái)，該病已成為大豆主要病害之一，一般可造成大豆減產(chǎn)10%～40%，嚴(yán)重的可造成絕產(chǎn)[5]。大豆對(duì)大豆疫霉菌的抗性由顯性單基因控制[1]。雖然大豆疫霉根腐病的生理小種很多，新小種的出現(xiàn)也較快，但是種植抗、耐病品種仍然是防治大豆疫霉根腐病的有效手段[6]。

目前，用于大豆疫霉根腐病抗病性鑒定的方法還是以下胚軸接菌法為主。1958年，Kaufmann等[7]首先應(yīng)用下胚軸傷口接種方法鑒定大豆對(duì)疫霉根腐病的抗性。此后，下胚軸接種法便成為鑒別大豆疫霉菌生理小種以及鑒定大豆抗病性的基本方法，人們只是在接種體的制備、接種方法、接種后保濕方法等方面加以改進(jìn)，使接種方法更簡(jiǎn)便有效[8-13]。然而，活體接菌的最大弊端就是無(wú)法保留遺傳分析過(guò)程中所需要保存的感病植株。為了解決這一問(wèn)題，1978年Morrison等[14]利用子葉接種法進(jìn)行抗病鑒定；2009年，于安亮等[11]再次證明了子葉接種法進(jìn)行大豆疫霉根腐病抗性鑒定同樣準(zhǔn)確可行。這種離體的鑒定方式有效地解決了無(wú)法保留感病材料的問(wèn)題。對(duì)于野生大豆來(lái)說(shuō)，由于其獨(dú)特的生長(zhǎng)特點(diǎn)，使其在鑒定過(guò)程中操作比較困難。因此，建立適合野生大豆的快速、有效的疫霉根腐病抗病性鑒定體系，為挖掘野生大豆抗源提供有效快速的方法至關(guān)重要。離體葉片接種法作為一種抗病性鑒定方式目前已在水稻、小麥、油菜、苜蓿、西瓜、香蕉等作物上應(yīng)用[15-22]，但在野生大豆上鮮見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，筆者利用24份黑龍江省栽培大豆對(duì)離體葉片接種法與下胚軸接種法進(jìn)行比較，探討了離體葉片接種法的準(zhǔn)確性和可信程度，并利用2份已知抗性的野生大豆材料對(duì)離體葉片接種法的條件進(jìn)行了摸索，同時(shí)利用離體葉片接種法對(duì)采集自黑龍江省的177份野生大豆資源進(jìn)行了大豆疫霉根腐病抗病性鑒定，以期解決野生大豆抗病性鑒定困難的問(wèn)題。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株。菌株為大豆疫霉菌1號(hào)生理小種，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)張淑珍教授贈(zèng)與，是黑龍江省優(yōu)勢(shì)生理小種。

1.1.2培養(yǎng)基。胡蘿卜培養(yǎng)基（CA）：將新鮮的胡蘿卜洗凈并切成小塊，稱(chēng)取200 g，用植物組織攪碎機(jī)攪碎，加入1 000 mL蒸餾水煮沸30 min，用3層紗布濾去殘?jiān)?，將過(guò)濾后的胡蘿卜汁定容至1 000 mL，加入20 g瓊脂，120 ℃高溫高壓滅菌20 min。滅菌后的培養(yǎng)基倒入滅菌的平皿中，高度為05 cm。

1.1.3試驗(yàn)品種。黑龍江省采集的野生大豆179份，其中ZYD594為已知的感病材料，龍野01-491為已知的抗病材料，用于離體葉片接種法條件摸索。栽培大豆品種24份，為黑龍江省部分育種單位育成的品種，用于離體葉片鑒定法的可行性驗(yàn)證。

1.2方法

1.2.1菌種培養(yǎng)。將大豆疫霉根腐病1號(hào)菌取10 mm×10 mm的正方形菌塊接種于2%胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基，于25 ℃暗培養(yǎng)7 d。

1.2.2下胚軸接種和離體葉片接種。取健康無(wú)病的大豆種子種于混合有1/3草炭土的小缽中，待其出苗后分別采用下胚軸接種法和離體葉片接種法進(jìn)行接種。

1.2.2.1下胚軸接種法。參照Kaufmann等[7]的接種方法。當(dāng)待鑒定幼苗第1對(duì)對(duì)生真葉展開(kāi)時(shí)，在距離子葉下方1 cm處用手術(shù)刀片切出傷口，深度為莖的1/3。將10 mm×10 mm的正方形菌塊接種到傷口上。接種后將植株放入保濕箱中保溫保濕。3 d后，轉(zhuǎn)移至普通溫室內(nèi)等待發(fā)病，并調(diào)查發(fā)病率。每份材料每次處理30株，3次重復(fù)。

1.2.2.2離體葉片接種法。當(dāng)待鑒定幼苗第一復(fù)葉完全展開(kāi)時(shí)將其剪下，置于不銹鋼托盤(pán)內(nèi)，盤(pán)底放無(wú)菌紗布和適量蒸餾水。用滅菌后的手術(shù)刀在葉片上表面中心位置劃出小傷口。在培養(yǎng)7 d的大豆疫霉根腐病菌株邊緣切取適當(dāng)大小的圓形菌塊，接種于傷口之上。菌塊的直徑略小于葉片寬度。以只劃傷口不接種為空白對(duì)照1組，接種空白胡蘿卜培養(yǎng)基為空白對(duì)照2組。用保鮮膜覆蓋托盤(pán)，保持相對(duì)濕度為100%。28 ℃、每日光照12 h培養(yǎng)，發(fā)病后調(diào)查發(fā)病率。每份材料每次處理30個(gè)葉片，3次重復(fù)。

1.2.3數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計(jì)分析用DPS（7.05 版）對(duì)離體葉片接種法和下胚軸接種法進(jìn)行離相關(guān)分析，并對(duì)2種方法進(jìn)行r×c獨(dú)立性測(cè)驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1離體葉片接種法條件確定利用離體葉片接種法接種2 d后，感病材料ZYD594的接菌部位出現(xiàn)褐斑；接種5 d后，褐斑明顯擴(kuò)大，幾乎蔓延整片葉；接菌7 d后，褐斑部位已明顯失綠且腐爛；抗病材料龍野01-491的接菌部位始終未發(fā)生明顯變化（圖1）。因此，確定接菌5 d后對(duì)發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查。

感病材料ZYD594經(jīng)單純劃傷（對(duì)照1組）以及接種空白胡蘿卜培養(yǎng)基（對(duì)照2組）2種處理5 d后，葉片均未發(fā)生明顯變化（圖2），說(shuō)明傷口和培養(yǎng)基均未對(duì)葉片產(chǎn)生影響，葉片接菌后的發(fā)病情況均由大豆疫霉菌感染所致。

4離體葉片接種法的調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)參考Yang[23]對(duì)大豆疫霉根腐病抗感情況的分型標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)查葉片的發(fā)病數(shù)量并計(jì)算發(fā)病率（發(fā)病率=發(fā)病葉片數(shù)/接種葉片總數(shù)×100%）。發(fā)病率≥70%為感?。⊿），發(fā)病率≤30%為抗?。≧），發(fā)病率在30%～70%為中間類(lèi)型（I）。

2.2離體葉片接種法的可行性驗(yàn)證 由于下胚軸接種法在野生大豆上不易操作、成功率極低，該研究選用24個(gè)黑龍江省栽培大豆品種進(jìn)行離體葉片接種法與下胚軸接種法的比較研究，結(jié)果如表1所示。下胚軸接種法獲得4個(gè)抗性品種、4個(gè)中間型品種和16個(gè)感病品種，分別為總數(shù)的17%、17%和66%。離體葉片接種法獲得4個(gè)抗性品種、6個(gè)中間型品種和14個(gè)感病品種，分別為總數(shù)的17%、25%和58%。鑒定結(jié)果的一致率達(dá)91.67%。兩者相比較，有2個(gè)品種在下胚軸接種法時(shí)表現(xiàn)為感病，而在離體葉片接種法時(shí)表現(xiàn)為中間類(lèi)型。

2.3黑龍江省采集的野生大豆疫霉根腐病抗病性鑒定利用離體葉片接種法對(duì)黑龍江省采集的177份野生大豆的疫霉根腐病抗病性進(jìn)行鑒定。由表4可知，177份野生大豆資源中，抗病材料27份，占供試材料的15.25%；中間類(lèi)型材料84份，占供試材料的47.56%；感病材料66份，占供試材料的37.29%。

3結(jié)論與討論

野生大豆在世界上分布范圍非常狹窄，僅分布于中國(guó)、朝鮮半島、日本列島及俄羅斯的遠(yuǎn)東地區(qū)[24-25]。而我國(guó)的野生大豆資源占全世界的90%以上，其中80%以上野生大豆分布在35° N以北[26-27]。黑龍江省位于我國(guó)最北部，地處中溫帶與寒溫帶交界處，屬于我國(guó)高寒地區(qū)。黑龍江省野生大豆資源豐富，具有寒地野生大豆的獨(dú)特性，在我國(guó)乃至世界均占有非常重要的位置。然而，隨著經(jīng)濟(jì)建設(shè)的快速發(fā)展以及生態(tài)環(huán)境的不斷改變，野生資源的生存環(huán)境正面臨著巨大威脅。野生大豆的分布面積在不斷縮小，類(lèi)型和數(shù)量在逐漸減少，尤其是特殊的生態(tài)環(huán)境和獨(dú)特類(lèi)型[27]。因此，對(duì)寒地野生大豆資源的研究與利用，不僅是為了保護(hù)與保存寒地野生大豆資源類(lèi)型，而且對(duì)科研、育種以及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展也具有重要意義。通過(guò)對(duì)野生大豆資源抗病性鑒定和抗病品種的篩選，不僅可以加速開(kāi)展我國(guó)大豆種質(zhì)資源的抗病性

鑒定，而且為抗病育種提供了豐富抗病資源，從而加速了大豆的抗病育種。

野生大豆是栽培大豆的近緣祖先種，在形態(tài)上與栽培大豆相似，但在一些性狀及長(zhǎng)勢(shì)上差異顯著。野生大豆的種子較小。在黑龍江省采集的野生大豆中，有84%的野生大豆其百粒重≤3 g[28]，而栽培大豆的百粒重則多在22 g左右。野生大豆的莖細(xì)且蔓生纏繞，尤其在幼苗期，莖粗不足栽培大豆的1/2，這一特點(diǎn)令常用的下胚軸接種法在野生大豆下胚軸處很難操作，且野生大豆的下胚軸難以承載菌塊重量。這些差異造成了常用的疫霉根腐病抗病性鑒定方法在野生大豆上應(yīng)用困難的問(wèn)題。離體葉片接種法能夠很好地回避野生大豆下胚軸不易操作特點(diǎn)，又能保留感病材料。通過(guò)對(duì)離體葉片接種法與下胚軸接種法的相關(guān)分析以及獨(dú)立性測(cè)驗(yàn)可知，2種方法的相關(guān)性非常高，且離體葉片接種法完全可以用來(lái)對(duì)大豆疫霉根腐病抗病性進(jìn)行鑒定。因此，離體葉片接種法是適合野生大豆疫霉根腐病抗性鑒定的有效方法。

對(duì)于植物抗病性鑒定，1份材料通常要選擇一定數(shù)量的單株作為檢測(cè)樣本，且一般要進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)來(lái)避免偶然性并減小誤差。對(duì)于特殊材料（如雜交后代）的檢測(cè)，用常規(guī)的方法無(wú)法做到重復(fù)檢測(cè)。葉片是植物的重要器官之一，且在一定的生育時(shí)期內(nèi)，植物不斷長(zhǎng)出新葉。若利用離體葉片接種法鑒定植物抗病性，則為單株重復(fù)檢測(cè)提供了可能，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。但由于植物成株抗性的存在[29]，不同時(shí)期的新生葉片是否均可作為抗病性檢測(cè)的接菌體還有待進(jìn)一步研究。

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