赤眼鱒形態(tài)特征及其兩種同工酶的組織特異性分析

張濤　陳建武　張林　周劍光　何力

摘要：【目的】從形態(tài)特征和生化遺傳層面上豐富赤眼鱒種質(zhì)資源研究數(shù)據(jù)，同時(shí)為篩選出鑒定赤眼鱒種群的生化遺傳標(biāo)記打下基礎(chǔ)?！痉椒ā坎捎眯螒B(tài)學(xué)測(cè)量觀察赤眼鱒的形態(tài)特征，并以聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)其不同組織（心臟、眼睛晶狀體、肌肉、肝臟和腎臟）中的乳酸脫氫酶（LDH）和蘋果酸脫氫酶（MDH），分析兩種同工酶表達(dá)的組織特異性。【結(jié)果】赤眼鱒的眼上緣可見一紅斑，鰓耙短而疏，主要形態(tài)特征為背鰭D.iii-7，胸鰭Pi.14，臀鰭A.iii-7～8，腹鰭V.i-8，其齒式2·4·5/4·4·2或2·4·4/4·4·2。從赤眼鱒的心臟、眼睛晶狀體、肌肉、肝臟和腎臟等5種組織中共檢測(cè)到7條LDH酶帶和6條MDH酶帶，不同組織中的酶帶數(shù)目和活性各不相同，呈明顯的組織特異性，且同一組織不同個(gè)體間也存在明顯差異?！窘Y(jié)論】同工酶表達(dá)的組織特異性除了受遺傳基因調(diào)控外，還與各組織的生化代謝活動(dòng)相關(guān)，其中心臟LDH可作為鑒定赤眼鱒種質(zhì)的生化遺傳標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：赤眼鱒；形態(tài)特征；乳酸脫氫酶（LDH）；蘋果酸脫氫酶（MDH）；組織特異性

中圖分類號(hào)：S965.199 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）12-2281-07

0引言

【研究意義】赤眼鱒（Squaliobarbus curriculus）俗稱野草魚、紅眼魚，原屬于江河野生魚類，除新疆和青藏高原外，我國(guó)各大河流湖泊均有發(fā)現(xiàn)，主要分布在長(zhǎng)江水系和珠江水系，因具有生長(zhǎng)快、抗逆性強(qiáng)、肉質(zhì)細(xì)嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)而深受人們喜愛，現(xiàn)已發(fā)展成為淡水養(yǎng)殖的主要對(duì)象。但近年來因過度捕撈、水資源污染、外來物種入侵及魚類生境遭到破壞，導(dǎo)致赤眼鱒種質(zhì)資源銳減（chen et al.，2009），因此研究和保護(hù)其種質(zhì)資源勢(shì)在必行。【前人研究進(jìn)展】目前，有關(guān)赤眼鱒的研究報(bào)道主要集中在生物學(xué)特征（龍光華等，2005a；郭麗麗等，2009）、繁殖特性與人工繁殖（龍光華等，2005b，2005c；楊明生等，2005）、雜交育種（任麗珍等，2011；何美鳳等，2015；李迪等，2016）及分子遺傳特性評(píng)估（楊太有等，2008；邵芳等，2013；楊慧榮等，2013）等方面，并已證實(shí)赤眼鱒苗種包括仔魚后期、稚魚期和幼魚期3個(gè)時(shí)期，其中，仔魚后期卵黃囊消失，開始攝食；稚魚期出現(xiàn)鱗片至全身批鱗；幼魚期側(cè)線明顯，體形體色與成魚相似。這些研究結(jié)果為赤眼鱒的開口攝食和苗種培育提供了技術(shù)參考和指導(dǎo)。同工酶作為一種生化遺傳標(biāo)記，在魚類的親緣關(guān)系研究、分類和物種鑒定及群體遺傳結(jié)構(gòu)分析等方面已得到廣泛應(yīng)用（Verspoor and Moyes，2005；張娟等，2011；Ardestani et al.，2014）。張瑞等（2014）研究表明，皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai，♀）與黑足鮑（H.iris，♂）雜交F₁代的同工酶主要來自母本皺紋盤鮑。楊鳳香等（2015）通過比較白氏文昌魚（Branchiostoma bel-cheri）、日本文昌魚（B.japonicum）和佛羅里達(dá)文昌魚（B.floridae）的4種同工酶[蘋果酸脫氫酶（MDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、酯酶（EST）、淀粉酶（α-AMY）]的酶譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這4種同工酶的酶帶數(shù)目、染色程度及遷移率在不同文昌魚問的差異較明顯，可作為鑒定文昌魚種群的依據(jù)。張龍崗等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，烏鱧（Ophicephalus argus）和雜交鱧（O.argus ♂×O.maeulata早）的MDH、乙醇脫氫酶（ADH）存在明顯的品種差異性，即這兩種酶可作為鑒別烏鱧和雜交鱧的新指標(biāo)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今，尚無涉及赤眼鱒生化遺傳特性方面的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用形態(tài)學(xué)測(cè)量觀察赤眼鱒的形態(tài)特征，并以聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)其不同組織中的乳酸脫氫酶（LDH）和蘋果酸脫氫酶（MDH），擬從形態(tài)特征和生化遺傳層面上豐富赤眼鱒種質(zhì)資源研究數(shù)據(jù)，同時(shí)為篩選出鑒定赤眼鱒種群的生化遺傳標(biāo)記打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試赤眼鱒樣本均為池塘養(yǎng)殖群體，于2017年3月采自湖北宜昌，共30尾，體重范圍6.3～33.1 g/尾，體長(zhǎng)范圍7.7～12.9 cm/尾。

1.2形態(tài)測(cè)定

按照GB/T 18654.3-2008《養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗(yàn)》中的相關(guān)規(guī)定，用游標(biāo)卡尺（精確度0.1 mm）對(duì)樣品魚進(jìn)行形態(tài)測(cè)定。其中，可數(shù)性狀包括背鰭、臀鰭、胸鰭和腹鰭的鰭式、側(cè)線鱗式及左側(cè)第一鰓弓外側(cè)鰓耙數(shù)，可量性狀包括體長(zhǎng)、體高、頭長(zhǎng)、吻長(zhǎng)、眼徑、眼間距、尾柄長(zhǎng)和尾柄高。

1.3組織酶液制備

參照賀剛等（2012）的方法制備組織酶液。用-剪刀剪除赤眼鱒鰓部后置于水中放血，冰浴條件下趁魚體尚存活時(shí)取心臟、眼睛晶狀體、肌肉、肝臟和腎臟等5種組織樣品，各組織樣品經(jīng)預(yù)冷生理鹽水沖洗干凈后-80℃保存?zhèn)溆茫换蛑苯臃Q重后置于洗凈預(yù)冷的勻漿器中，按1：3（g/mL）的比例加人預(yù)冷雙蒸水，冰浴條件下反復(fù)研磨至漿狀，4℃下12000 r/min離心30 min，重復(fù)3次，收集上清液，分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳及染色

同工酶分析采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳，其分離膠濃度7.5%，濃縮膠濃度3.0%，電極緩沖液為pH 8.3的Tris甘氨酸。電泳采用穩(wěn)壓（220 V）方式，電泳時(shí)間5 h。電泳結(jié)束后取出凝膠板，室溫下避光染色，其中，LDH染色參照楊鳳香等（2015）的方法，MDH染色參照孟彥等（2009）的方法。待顯現(xiàn)清晰條帶后以去離子水漂洗凝膠板2～3次，然后將凝膠板平放在自制燈箱上采用尼康數(shù)碼相機(jī)拍照。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

所測(cè)得可量性狀數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1赤眼鱒的形態(tài)特征

赤眼鱒魚體延長(zhǎng)，略呈圓筒形，腹部圓，后段較側(cè)扁，頭呈圓錐形，吻圓鈍；口端位，稍向上翹；口裂寬。上頜有兩對(duì)細(xì)小的須；眼大，靠近吻端，眼上緣可見一紅斑；鼻孔位于眼前上方。魚鱗較大，圓形，側(cè)線平直，向后延伸至尾柄正中。背鰭無硬刺，起點(diǎn)與腹鰭相對(duì)或略前，背鰭起點(diǎn)至吻端的距離小于至尾鰭基部的距離；胸鰭末端可達(dá)胸鰭起點(diǎn)至腹鰭基部距離的3/5處；臀鰭靠后，起點(diǎn)至腹鰭基部的距離大于至尾鰭基魚的距離；尾鰭分叉深（圖1）。赤眼鱒的主要形態(tài)特征為背鰭D.iii-7，胸鰭Ri-14，臀鰭A.iii-7～8，腹鰭V.i-8。

赤眼鱒通體銀白，但背部顏色較深。體側(cè)每一鱗片后部邊緣有黑斑，組成體色縱裂條紋。背鰭、尾鰭深灰色，尾鰭有黑色邊緣，其他各鰭灰白色（圖1）。鰾2室，前室膨大，后室向尾部逐漸變細(xì)，無鰾管。腹膜黑色。鰓耙很短，頂端尖，排列稀疏，鰓絲長(zhǎng)。下咽齒3行，齒端呈鉤狀，齒式2·4·5/4·4·2或2·4·4/4·4·2。赤眼鱒的頭長(zhǎng)大于體高，吻長(zhǎng)大于眼徑，且尾柄長(zhǎng)約是尾柄高的1.50～1.80倍（表1）。

2.2赤眼鱒LDH的表達(dá)情況

由圖2可看出，從赤眼鱒的心臟、眼睛晶狀體、肌肉、肝臟和腎臟等5種組織中共檢測(cè)到7條LDH酶帶，將分子量最小的酶帶命名為L(zhǎng)DH1，分子量最大的酶帶命名為L(zhǎng)DH7，不同組織中的酶帶數(shù)目和活性各不相同，呈明顯的組織特異性。其中，從心臟中共檢測(cè)到6條酶帶，以LDH5活性最強(qiáng)，LDH1活性最弱，4尾不同赤眼鱒個(gè)體的酶帶數(shù)目和活性程度基本相同；從眼睛晶狀體中共檢測(cè)到6條酶帶，4尾不同赤眼鱒個(gè)體的酶帶數(shù)目和活性程度各不相同，LDH1、LDH2、LDH4和LDH5為共有酶帶，1號(hào)魚和4號(hào)魚的酶帶數(shù)目完全相同，均有LDH3和LDH6；從肌肉中共檢測(cè)到7條酶帶，LDH1、LDH2、LDH4、LDH5和LDH6為共有酶帶，LDH6為所有酶帶中活性最強(qiáng)的酶帶，除3號(hào)魚外其他個(gè)體均有LDH3，只是酶帶活性有所差異；從肝臟中也檢測(cè)到7條酶帶，以4號(hào)魚的酶帶數(shù)目最多（7條），2號(hào)魚僅見1條酶帶，LDH7為所有酶帶中活性最強(qiáng)的酶帶；從4尾不同赤眼鱒個(gè)體的腎臟中均能檢測(cè)到6條酶帶，且以LDH3的活性最弱。

2.3赤眼鱒MDH的表達(dá)情況

MDH分上清液型（S-MDH）和線粒體型（M-MDH）兩種類型，分別由兩個(gè)基因位點(diǎn)控制，為二聚體。由圖3可看出，從赤眼鱒的5種組織中共檢測(cè)到6條MDH酶帶，將分子量最小的酶帶命名為MDH1，分子量最大的酶帶命名為MDH6，其數(shù)目和活性也存在明顯的組織特異性。其中，從心臟中共檢測(cè)到3條酶帶，MDH3為共有酶帶，MDH2活性最強(qiáng)，MDH1活性較弱，1號(hào)魚和2號(hào)魚的帶型相同，3號(hào)魚和4號(hào)魚的帶型相同；在4尾樣本魚的眼睛晶狀體中均未檢測(cè)到酶帶；從肌肉中共檢測(cè)到6條酶帶，MDH3為共有酶帶，以2號(hào)魚的酶帶數(shù)目最多（5條）、3號(hào)魚的酶帶數(shù)目最少（僅1條）；從肝臟中共檢測(cè)到5條酶帶，1號(hào)魚未檢測(cè)到酶帶，2號(hào)魚檢測(cè)到1條酶帶（活性較弱），3號(hào)魚的酶帶數(shù)目最多（4條），4尾樣本魚中未發(fā)現(xiàn)共有酶帶；從腎臟中共檢測(cè)到3條酶帶，MDH2為共有酶帶。

2.4赤眼鱒生化遺傳標(biāo)記

除了心臟和腎臟外，其余組織的LDH和MDH均呈多態(tài)性，不適宜作為鑒定赤眼鱒種質(zhì)的生化遺傳標(biāo)記。同時(shí)考慮到腎臟成分相對(duì)復(fù)雜，易造成污染，故不建議采用腎臟作為生化遺傳標(biāo)記。心臟組成主要是心肌，其成分相對(duì)簡(jiǎn)單，制備同工酶樣本時(shí)不易造成提取成分污染。由圖4可看出，10尾赤眼鱒樣本的心臟LDH均呈單態(tài)，即不存在個(gè)體差異，且各酶帶分離清晰，因此建議采用心臟LDH作為鑒定赤眼鱒種質(zhì)的生化遺傳標(biāo)記。

3討論

3.1形態(tài)學(xué)方法在魚類種質(zhì)鑒定中的應(yīng)用

由于不同魚類具有不同的形態(tài)學(xué)特征，觀察其外部形態(tài)特征，或通過形態(tài)測(cè)量獲取可數(shù)性狀和可量性狀數(shù)據(jù)，可直觀、便捷地進(jìn)行種類鑒定（丁嚴(yán)冬等，2015）。除傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)外，近年來還有學(xué)者將框架數(shù)據(jù)運(yùn)用到魚類種質(zhì)鑒定中（宓國(guó)強(qiáng)等，2010；許淼洋等，2013）。通過與前人的相關(guān)研究結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)本研究選取的赤眼鱒與珠江水系赤眼鱒的部分形態(tài)特征存在明顯差異。本研究中，赤眼鱒的齒式2·4·5/4·4·2或2·4·4/4·4·2，體長(zhǎng)為體高的4.50-5.00倍，尾柄長(zhǎng)為尾柄高的1.50～1.80倍；而珠江水系赤眼鱒的齒式2·4·5/5·4·2或2·4·4/4·4·2或2·4·5/4·3·2，體長(zhǎng)為體高的3.80～4.40倍，尾柄長(zhǎng)為尾柄高的1.20～1.40倍（廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)研究所和中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所，2006）。造成這種差異的原因除了與樣本量及規(guī)格差異有關(guān)外，可能還與測(cè)量方法有關(guān)，如可量性狀參數(shù)的起始點(diǎn)界定，常因研究者的不同而產(chǎn)生差異。此外，本研究挑選的赤眼鱒樣本為池塘養(yǎng)殖群體，其餌料來源相對(duì)野生群體更豐富，但是否會(huì)造成部分可量性狀差異，尚需進(jìn)一步探究。

3.2同工酶表達(dá)的組織特異性

本研究結(jié)果表明，LDH和MDH兩種同工酶在赤眼鱒組織中的表達(dá)均具有組織特異性，即某一同工酶在同一個(gè)體不同組織器官中的表達(dá)類型和程度皆有不同。從赤眼鱒的心臟中共檢測(cè)到5條LDH酶帶，在其腎臟中共檢測(cè)到6條酶帶，]tLDH在心臟中的表達(dá)活性整體上強(qiáng)于腎臟。同工酶在組織器官中的表達(dá)情況受遺傳基因調(diào)控，因此部分同工酶基因只在特定的組織或器官中表達(dá)。一般認(rèn)為，脊椎動(dòng)物同工酶LDH在胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化中具有明顯的分化調(diào)控模式，表現(xiàn)出高度的發(fā)育和組織特異性（張娟等，2011）。從本研究結(jié)果來看，赤眼鱒心臟和腎臟中的LDH均為單態(tài)，可考慮作為鑒定赤眼鱒種質(zhì)的生化遺傳標(biāo)記，但在實(shí)際操作中采集赤眼鱒腎臟組織時(shí)易摻入其他組織而影響研究結(jié)果，而心臟組成主要是心肌，成分相對(duì)簡(jiǎn)單，制備同工酶樣本時(shí)不易造成提取成分污染，故建議采用心臟LDH作為鑒定赤眼鱒種質(zhì)的生化遺傳標(biāo)記。

3.3同工酶表達(dá)的活性強(qiáng)弱

同工酶的表達(dá)與組織器官的代謝活動(dòng)也密切相關(guān)。LDH是糖酵解過程中的一種重要酶系，能促使乳酸與丙酮酸問發(fā)生可逆的轉(zhuǎn)化（余敏等，2006）；MDH是參與三羧酸循環(huán)的酶系，在葡萄糖異生和糖酵解過程中發(fā)揮重要作用（林文燕等，2010）。本研究從赤眼鱒肝臟中檢測(cè)出7條LDH酶帶，眼睛晶狀體中檢測(cè)到6條酶帶，且LDH在肝臟中的表達(dá)活性比在眼睛晶狀體中的強(qiáng)；在MDH方面，從赤眼鱒肝臟中檢測(cè)出5條酶帶，而在眼睛晶狀體中未檢測(cè)到對(duì)應(yīng)的酶帶。肝臟是機(jī)體重要的代謝功能器官，具有解毒、儲(chǔ)存糖原、促進(jìn)蛋白合成、分泌膽汁促消化等重要生理作用，因此同工酶在肝臟中的普遍表達(dá)與其行使復(fù)雜、重要的生理功能密切相關(guān)。

3.4同工酶表達(dá)的個(gè)體差異

同工酶在同一物種不同個(gè)體相同組織中的表達(dá)差異可能與其生長(zhǎng)發(fā)育階段、健康狀態(tài)、地理環(huán)境（生境）等均有關(guān)聯(lián)。薛俊增（2002）研究發(fā)現(xiàn)，病蟹和健康蟹的同工酶分離圖譜存在明顯差異，如健康蟹的心臟和肌肉LDH均有2條譜帶，而病蟹只有1條譜帶。賈守菊等（2004）研究表明，中華絨螯蟹不同發(fā)育階段ADH的酶帶數(shù)目及其活性均呈減弱趨勢(shì)，而EST在抱卵蟹時(shí)的酶帶數(shù)最多、活性最強(qiáng)。余敏等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，云南高背鯽魚心臟EST-5在10尾樣本魚中僅部分表達(dá)，存在明顯的個(gè)體差異。黃孝湘等（2012）推測(cè)，造成不同水域克氏原螯蝦同種組織LDH酶帶數(shù)目差異的原因是水質(zhì)問題。本研究結(jié)果表明，除了心臟和腎臟外，其余組織的LDH和MDH均呈多態(tài)性，如2號(hào)魚肌肉中檢測(cè)到7條LDH酶帶，而3號(hào)魚肌肉中僅檢測(cè)到6條酶帶，其差異可能與不同個(gè)體的大小或健康狀況有關(guān)，但具體原因有待進(jìn)一步探究。

4結(jié)論

同工酶表達(dá)的組織特異性除了受遺傳基因調(diào)控外，還與各組織的生化代謝活動(dòng)相關(guān)，其中心臟LDH可作為鑒定赤眼鱒種質(zhì)的生化遺傳標(biāo)記。