Ⅱ型膠原微圖案化對豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞行為的影響

李裕民　龔逸鴻

摘要：【目的】明確調(diào)控生物材料表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基礎(chǔ)生長行為和功能的影響，為關(guān)節(jié)軟骨組織缺損修復(fù)提供理論依據(jù)?！痉椒ā坷檬橙唆~溶液（Piranha，H₂O₂H₂SO₄）對普通玻片進(jìn)行氧化，以紫外光刻法制備具有不同尺度條帶微圖案的Si印模，經(jīng)氧氣等離子體處理和Ⅱ型膠原（COLⅡ）浸潤后，通過微接觸印刷（pCP技術(shù)）將COLⅡ固定在氧化玻片材料表面，將豬關(guān)節(jié)腔軟骨細(xì)胞接種于微圖案化的支架材料上，經(jīng)37℃、5%COs培養(yǎng)箱培養(yǎng)后采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）比色法和二乙酸熒光素（FDA）熒光染色法分別觀察軟骨細(xì)胞的增殖生長情況?！窘Y(jié)果】經(jīng)食人魚溶液處理后玻片表面羥基化程度提高，親水性明顯增強(qiáng)。通過pCP技術(shù)能成功將COLⅡ印刷在羥基化玻片表面上，且條帶均勻、整齊。將豬軟骨細(xì)胞接種到構(gòu)建的取向性COLⅡ微圖案材料上進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)COLⅡ能為豬軟骨細(xì)胞提供黏附位點，且取向性COLⅡ微圖案對軟骨細(xì)胞的增殖生長有促進(jìn)作用，但不同尺度（100、200和300μm）線寬對軟骨細(xì)胞的增殖生長存在明顯差異，表現(xiàn)為線寬越寬，軟骨細(xì)胞的增殖生長能力越弱。豬軟骨細(xì)胞在COLⅡ微圖案材料上生長狀況良好，隨著培養(yǎng)時間的延長，軟骨細(xì)胞多呈多邊形；其軟骨細(xì)胞培養(yǎng)效果優(yōu)于無規(guī)則的涂覆COLⅡ微圖案材料?！窘Y(jié)論】利用μCP技術(shù)成功構(gòu)建的規(guī)整COLⅡ微米級拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的黏附鋪展、增殖行為有促進(jìn)作用，且線寬尺度與軟骨細(xì)胞增殖生長能力呈反比趨勢。即通過人為調(diào)控生物材料的表面活性拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，在一定程度上能有效調(diào)控或影響關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的生長行為。

關(guān)鍵詞：豬；關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞；Ⅱ膠原（COLⅡ）；微圖案；微接觸印刷（μCP技術(shù)）

中圖分類號：S828 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）12-2273-08

0引言

【研究意義】關(guān)節(jié)軟骨是一種無神經(jīng)、無血管的組織，再生能力相對較差（Aigner and Stove，2003），缺損后常因自身修復(fù)能力有限而繼發(fā)成骨關(guān)節(jié)炎。因此，研究軟骨細(xì)胞的生長過程，掌握關(guān)節(jié)軟骨自我修復(fù)發(fā)生規(guī)律尤為重要。目前，治療軟骨缺損的辦法主要圍繞自體軟骨、異體軟骨及人工生物材料展開研究。自體軟骨移植的軟骨源非常有限，且再次移植過程中存在二次損傷的風(fēng)險（Miljkovic et al.，2008）；異體軟骨移植的潛在免疫反應(yīng)及感染率可能會導(dǎo)致治療失敗或效果不佳（ODriscoll，1998；Lee and Shin，2007）。人工生物材料能構(gòu)建可調(diào)控的細(xì)胞生長環(huán)境，有目的地調(diào)控細(xì)胞的生長行為和功能，在體外通過組織工程方法大量擴(kuò)增目標(biāo)組織和細(xì)胞群用于修復(fù)病變?nèi)睋p的軟骨組織（Chen et al.，1997；Lehnert et al.，2004）?？梢姡媒M織工程學(xué)方法培養(yǎng)工程化軟骨進(jìn)行軟骨移植具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】經(jīng)過數(shù)年的發(fā)展，組織工程的概念也與時俱進(jìn)，目前在基礎(chǔ)研究、臨床醫(yī)學(xué)上已得到應(yīng)用，甚至普及到商業(yè)化研發(fā)，如拇指再生術(shù)，即利用成骨細(xì)胞與多孔珊瑚支架復(fù)合在體外培養(yǎng)出與患者缺損部位相匹配的拇指（Vacanti et al.，2001）；Advanced TissueSciences公司研發(fā)出人工皮膚Dermagraft（Atala et al.，2006），并已商品化。此外，Zhang等（2008）在研究影響新生兒成骨細(xì)胞的生物活性時發(fā)現(xiàn)，殼聚糖與納米HAP結(jié)合成的復(fù)合支架較殼聚糖支架更有利于骨的形成。Ortved等（2015）將轉(zhuǎn)染IGF-Ⅰ基因的馬軟骨細(xì)胞與纖維蛋白材料復(fù)合植入關(guān)節(jié)軟骨缺損處，8個月后缺損區(qū)以富含Ⅱ型膠原（COLⅡ）和軟骨細(xì)胞的透明樣軟骨修復(fù)為主。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，表面改性技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于材料科學(xué)研究領(lǐng)域，其中表面微結(jié)構(gòu)構(gòu)建技術(shù)尤其引人關(guān)注。從光學(xué)平版印刷（Bhatia et al.，1992）到溶液親屬性自組裝（Maruyama et al.，1998），再到最新發(fā)展起來的軟光刻技術(shù)（洪吉等，2001），一次次推動材料表面改性技術(shù)的深刻變革。1994年，Biebuyck和Whitesieds首次提出微接觸印刷（簡稱μCP技術(shù)），其具有便捷、低耗的優(yōu)點，可在微米、亞微米級尺寸上微圖案化材料表面性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，以實現(xiàn)小分子、聚合物、生物大分子等在材料表面的選擇性吸附。Jacobs和White-sides（2001）在薄膜電介體上利用電場μCP技術(shù)成功捕獲到亞微米級的電荷圖案。上述研究結(jié)果為在人工生物材料上構(gòu)建可調(diào)控的微納米尺度圖案提供了可行方案。【本研究切入點】至今，有關(guān)微米級拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長行為調(diào)控的研究鮮有報道，而針對關(guān)節(jié)軟骨淺表層微環(huán)境仿生的研究更少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過μCP技術(shù)將COLⅡ固定在氧化玻片材料表面，制備一系列不同尺度的細(xì)胞外基質(zhì)微圖案，以期通過調(diào)控生物材料表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)影響軟骨細(xì)胞的基礎(chǔ)生長行為和功能，為關(guān)節(jié)軟骨組織缺損修復(fù)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

Ⅱ型膠原酶（Collagenase Ⅱ）購自美國Gibco公司，二乙酸熒光素（FDA）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、羅丹明B乙硫氰酸酯（RBITC）和High Glucose-DMEM購自美國Sigma公司，硅片模板（100、200和300 gm）購自上海汶昌芯片科技有限公司。

1.2玻片表面羥基化處理

取直徑1 cm的圓形玻片在乙醇、丙酮中分別超聲波10 mind氮?dú)獯蹈?，去除污漬、油漬等。配制食人魚（Piranha）溶液（H₂5O₄：H₂O₂=7：3，5：5，3：7），冷卻至室溫后放人干凈玻片，置于通風(fēng)櫥中80℃加熱4 h。以去離子水清洗玻片至溶液pH 7.0，保存待用。羥基化玻片用動、靜態(tài)接觸角測試儀測試接觸角（θ）變化。

1.3 COLⅡ條帶微圖案構(gòu)建

熒光標(biāo)記COLⅡ溶液制備：將5.0 mL RBITC溶液（25 mg/L）與10.0 mL COLⅡ溶液（10 mg/L醋酸）充分混合，室溫避光放置4 h，過濾后凍干，-20℃放置備用。采用μCP技術(shù)制備COLⅡ微圖形的過程如圖1所示，先用紫外光光刻法制備具有目的圖案的Si印模，隨后配制康道寧184聚二甲基硅氧烷（PDMS）膠體（質(zhì)量比10：1），將PDMS膠體溶液均勻倒在si印模上，利用澆注固化法制備聚二甲基硅氧烷（PD-MS）印章，將固化的印章從印模上剝離并用乙醇與蒸餾水依次充分超聲波清洗，干燥后置于氧氣等離子體中反應(yīng)1 min，并浸沒在COLⅡ溶液（2 mmol/mL）中30 min，氮?dú)饩徛蹈捎≌卤砻?，再與氧化玻片充分接觸40 min，取下印章，即獲得COLⅡ微圖案，最后用1%胃蛋白溶液封閉，PBS清洗2～3次，并以PS（鏈霉素—青霉素雙抗）浸泡過夜。

1.4豬軟骨細(xì)胞分離與培養(yǎng)

利用酶消化法提取豬關(guān)節(jié)腔軟骨細(xì)胞，具體步驟如下：將關(guān)節(jié)面軟骨切成1 cm²小塊后用無菌PBS清洗3～5次，轉(zhuǎn)移至75 cm²培養(yǎng)瓶中，加入Ⅱ型膠原蛋白酶（Collagenase Ⅱ，1 mg/mL），置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中消化1 6 h，5000 r/min離心5 min，棄上清液，將沉淀接種到軟骨全培養(yǎng)基（20%FBS，10 mmol/L HEPES，50 mg/mL Vc，0.4 mmol/L L-proline，0.1 mmol/LNEAA，1%PS）中，置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5豬軟骨細(xì)胞接種

在24孔培養(yǎng)板中，用0.5 mL全培養(yǎng)基浸潤圖案化處理所得的材料，每孔加1.0 mL細(xì)胞懸液（1.5×103/cm²），置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液1次。

1.6豬軟骨細(xì)胞增殖活力檢測

取接種培養(yǎng)第1、3、5和7 d的豬軟骨細(xì)胞用無菌PBS清洗2次，采用MTT比色法測定細(xì)胞活力。在避光條件下棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入5.0 mL滅菌培養(yǎng)液10倍稀釋的MTT溶液（0.5 mg/mL），吹打細(xì)胞，重新置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 h。棄MTT溶液后每孔加入DMSO，搖床（80 r/min）搖勻15 min，于490 mm處測定吸光值。

1.7豬軟骨細(xì)胞FDA免疫熒光染色

取接種培養(yǎng)7 d的豬軟骨細(xì)胞，棄培養(yǎng)液后加入FDA溶液（5 mgm），37℃培養(yǎng)箱中靜置20 min，無菌PBS清洗3次，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8豬軟骨細(xì)胞細(xì)胞骨架染色

取培養(yǎng)接種7和14 d的豬軟骨細(xì)胞，棄培養(yǎng)液后用4%多聚甲醛室溫下固定45 min，1%Triton x-100浸泡5 min，以2.0 mL洗滌液清洗2次后加入封閉液，室溫放置2 h。加入40.0μL一抗（Anti-vinculin），室溫下?lián)u床孵育1.5 h，再以2.0 mL洗滌液清洗3次，每次5 min；加入二抗和鬼比環(huán)肽混合液2.0 mL，室溫孵育3.0 h；重復(fù)清洗3次后加入DAPI，室溫下?lián)u床孵育3 min，封閉液清洗后拍照。

2結(jié)果與分析

2.1玻片表面羥基化效果

由于玻片表面本身含有一定量的羥基，故清潔后的蓋玻片具有一定親水性，其接觸角（θ）測試如圖2所示。由表1可知，隨著食人魚溶液中H₂SO₄占比的提高，蒸餾水在玻片表面的接觸角越小。當(dāng)H2504與H202的比例由3：7變成7：3時，羥基化后的玻片平均接觸角明顯變小，其左接觸角（θ_A）從16.63°降至8.01°、右接觸角（θ_R）由17.19°降至9.36°，說明經(jīng)食人魚溶液處理后玻片表面羥基化程度提高，親水性增強(qiáng)。此外，隨著食人魚溶液氧化時間的延長，玻片接觸角逐漸變小，即玻片羥基化程度增加。

2.2 μCP材料在顯微鏡透射和反射模式下的形貌觀察結(jié)果

圖3是一套完整微圖案模具在反射模式下的顯微照片，其線間距均為100 pm，模板刻畫的圖案清晰。經(jīng)澆筑法翻印的PDMS印章在顯微鏡透射模式下觀察發(fā)現(xiàn)，以PDMS（10：1）澆筑后得到的印章邊緣整齊，圖案完整（圖4），完全復(fù)刻了模板的圖案形狀，說明PDMS澆筑法制備印章成功。

2.3條帶微圖案熒光觀察結(jié)果

玻片經(jīng)食人魚溶液氧化生成大量羥基，這些羥基能與膠原上的大量氨基交聯(lián)，而促使膠原接枝在氧化玻片上。用RBITC熒光標(biāo)記的COLII進(jìn)行印刷，在波長265 nmqr可激發(fā)顯示出紅光。由圖5可看出，μCP材料表面圖案部分呈現(xiàn)明顯且均勻的紅色熒光，非圖案部分無法觀察到熒光，說明COLII通過μCP技術(shù)已成功印刷在羥基化玻片表面上，且條帶均勻、整齊，可用于后續(xù)研究。

2.4條帶微圖案掃描電鏡觀察結(jié)果

采用SEM掃描電鏡觀察制備獲得的取向性COLII條帶噴金樣品，發(fā)現(xiàn)其條帶邊緣清晰，圖案完整（圖6）。將100 μm COLII微圖案視野放大，可觀察到密集分布的條形纖維狀物質(zhì)，且呈一種相對有序的排列次序（圖7）。

2.5豬軟骨細(xì)胞接種黏附增殖情況

在羥基化玻片和完全涂覆COLII的玻片（無微圖案）上分別接種豬軟骨細(xì)胞（24孔板，1.5×10³/孔），接種培養(yǎng)第4、7和11 d在熒光顯微鏡下觀察其熒光染色情況，對比兩種不同材料對軟骨細(xì)胞的黏附效果。圖8為豬軟骨細(xì)胞接種在羥基化潔凈玻片表面的熒光染色照片，圖9為豬軟骨細(xì)胞接種在涂覆COLII玻片（無微圖案）的熒光染色照片。對比發(fā)現(xiàn)，同一時間點下，涂覆COLII玻片（無微圖案）的熒光染色信號明顯強(qiáng)于羥基化潔凈玻片，說明涂覆COLII的玻片（無微圖案）更有利于豬軟骨細(xì)胞的黏附和鋪展。由此推測，COLII對軟骨細(xì)胞起到提供黏附位點的作用，且能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖行為。

2.6豬軟骨細(xì)胞的增殖活力

將豬軟骨細(xì)胞接種到不同尺度（100、200和300μm）的取向性COLII微圖案材料表面上培養(yǎng)，以無規(guī)則的涂覆COLII微圖案為對照材料（CT），分別取培養(yǎng)第1、3、5和7 d的細(xì)胞進(jìn)行MTT染色觀察。結(jié)果顯示，豬軟骨細(xì)胞在兩種材料上均能夠正常增殖生長，但在取向性COLII微圖案表面的長勢整體上優(yōu)于對照組（圖10），說明取向性材料對軟骨細(xì)胞的黏附和增殖能力有積極作用。此外，不同尺度（100、200和300μm）線寬對豬軟骨細(xì)胞的增殖生長也存在明顯差異，表現(xiàn)為線寬越寬，軟骨細(xì)胞的增殖生長能力越弱，即100 μm線寬條帶下的軟骨細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)。

2.7豬軟骨細(xì)胞FDA免疫熒光染色結(jié)果

接種培養(yǎng)7 d的豬軟骨細(xì)胞經(jīng)FDA熒光染色后，于熒光顯微鏡下觀察其增殖生長情況，結(jié)果顯示，COLII微圖案材料表面均呈現(xiàn)綠色熒光，且數(shù)量多、密度大（圖11）；隨著培養(yǎng)時間的延長，軟骨細(xì)胞多呈多邊形，說明軟骨細(xì)胞在COLII微圖案材料上生長狀況良好。

2.8豬軟骨細(xì)胞骨架染色結(jié)果

選取100μm線寬的取向性COLII微圖案材料和無規(guī)則的涂覆COLII微圖案材料（CT）進(jìn)行對比，于豬軟骨細(xì)胞培養(yǎng)7和14 d時進(jìn)行細(xì)胞骨架熒光染色，結(jié)果（圖12）發(fā)現(xiàn)，取向性COLII微圖案材料上的軟骨細(xì)胞鋪展?fàn)顩r良好，細(xì)胞骨架清晰；而在無規(guī)則的涂覆COLII微圖案材料上，軟骨細(xì)胞數(shù)量偏少，且細(xì)胞鋪展?fàn)顩r較差。

3討論

由于軟骨組織的天然環(huán)境結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其修復(fù)再生能力較差，而現(xiàn)行的軟骨缺損修復(fù)手段（異體軟骨移植、骨膜移植術(shù)等）均存在一定缺陷（Yannas et al.，1989）。對于軟骨組織工程來說，種子細(xì)胞、支架和生活環(huán)境是關(guān)鍵的三要素（Stoddart et al.，2009）。軟骨細(xì)胞的增長必須依附于材料支架，而細(xì)胞所處的細(xì)胞外微環(huán)境在增殖生長代謝過程中時刻與軟骨細(xì)胞相互作用（Darling et al.，2009），即軟骨細(xì)胞的黏附、鋪展、生長及蛋白表達(dá)等均與材料支架的表面性能相關(guān)聯(lián)。膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白，軟骨組織的細(xì)胞外基質(zhì)主要是COLII（組織干重占比60%～70%）和蛋白糖聚集體（組織干重占比20%～40%），其他成分包括糖蛋白、脂類物質(zhì)和軟骨細(xì)胞。一旦軟骨組織中的膠原蛋白含量降低，尤其在外界壓力的作用下，關(guān)節(jié)磨碎加快；同時隨著年齡增長、免疫力降低，關(guān)節(jié)軟骨在炎癥因子的作用下極易形成退行性關(guān)節(jié)炎?？梢?，COLII在維持正常軟骨結(jié)構(gòu)及功能方面具有不可忽視的作用。

目前，國內(nèi)外學(xué)者多側(cè)重于納米級、亞微米級的圖案化研究（Zhang et al.，2008；Ortved et al.，2015），有關(guān)微米級圖案對細(xì)胞基本生長行為的調(diào)控研究較少。細(xì)胞與所處的微環(huán)境時刻都在相互作用，從仿生角度出發(fā)，在體外構(gòu)建取向性圖案，模擬天然關(guān)節(jié)軟骨淺表層的膠原取向性排布，在一定程度上重現(xiàn)了淺表層軟骨細(xì)胞生長的微環(huán)境，同時紫外光光刻圖案線寬可進(jìn)行人為調(diào)控，以此研究不同微環(huán)境對軟骨細(xì)胞基本生長行為的影響，可為關(guān)節(jié)軟骨組織缺損修復(fù)打下基礎(chǔ)。本研究利用IaCP技術(shù)，在食人魚溶液羥基化改性的玻片上制備100、200和300 gm3種線寬尺度的取向性COLII微圖案化拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)生物活性表面，接種豬軟骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示，COLII能為豬軟骨細(xì)胞提供黏附位點，且取向性COLII微圖案對軟骨細(xì)胞的增殖生長有促進(jìn)作用，同時微圖案線寬越窄，軟骨細(xì)胞的增殖生長能力越強(qiáng)。該結(jié)論為研究微米級拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對軟骨細(xì)胞生長行為的影響提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，但有關(guān)蛋白表達(dá)及百微米級別內(nèi)的取向性拓?fù)鋱D案對軟骨細(xì)胞基礎(chǔ)生長行為的影響仍有待進(jìn)一步探究。

4結(jié)論

利用μCP技術(shù)成功構(gòu)建的規(guī)整COLII微米級拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的黏附鋪展、增殖行為有促進(jìn)作用，且線寬尺度與軟骨細(xì)胞增殖生長能力呈反比趨勢。即通過人為調(diào)控生物材料的表面活性拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，在一定程度上能有效調(diào)控或影響關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的生長行為。