水牛波形蛋白基因克隆及其表達(dá)分析

濮黎萍　候振　徐壯壯　陳富美　王煥景　黃鳳玲　張明

摘要：【目的】克隆水牛波形蛋白（VIM）基因，并明確VIM因在水牛成熟卵母細(xì)胞（MII期）和早期胚胎（2-細(xì)胞階段）中的表達(dá)情況，為研究VIM在卵母細(xì)胞成熟及附植前胚胎發(fā)育中的作用機(jī)理打下基礎(chǔ)。【方法】根據(jù)GenBank上已公布的水牛VIM基因mRNA序列設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR克隆水牛VIM因，利用在線軟件程序?qū)寺～@得的水牛VIM基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)以細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)VIM在水牛成熟卵母細(xì)胞（MII期）及早期胚胎（2-細(xì)胞階段）中的表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】水牛VIM基因長(zhǎng)度為1469 bp，其編碼區(qū)長(zhǎng)度1401 bp，編碼466個(gè)氨基酸。水牛VIM基因序列與人類、黑猩猩、食蟹猴、家犬、馬和牛的VIM基因序列具有高度的同源性，分別為93%、93%、93%、94%、94%和99%；基于VIM基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹也顯示水牛與牛的親緣關(guān)系最近。水牛VIM的分子量為53.73 kD，理論等電點(diǎn)（pI）5.05，主要在線粒體中表達(dá)，穩(wěn)定性差（不穩(wěn)定系數(shù)53.65），具有較強(qiáng)的親水性，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，不屬于分泌型蛋白，其蛋白結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主。VIM在水牛成熟卵母細(xì)胞（MII期）及早期胚胎（2-細(xì)胞階段）中均有表達(dá)，且在成熟卵母細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于早期胚胎?！窘Y(jié)論】水牛VIM基因編碼序列具有較高的保守性，且在水牛成熟卵母細(xì)胞（MII期）中的表達(dá)量明顯高于早期胚胎（2-細(xì)胞階段）。

關(guān)鍵詞：水牛；波形蛋白（VIM）；基因克??；生物信息學(xué)分析；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S823.83 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）12-2266-07

0引言

【研究意義】波形蛋白（Vimentin，VIM）與結(jié)蛋白、角蛋白組成中間纖維，而中間纖維又與微管、微絲共同構(gòu)成細(xì)胞骨架。VIM主要存在于中胚層來(lái)源的細(xì)胞中（Coulombe and Wong，2004），由非螺旋的氨基端頭部、螺旋桿狀區(qū)及非螺旋的羧基端尾部組成（Fuchs and Weber，1994），其主要功能包括維持細(xì)胞完整性、參與調(diào)節(jié)基因組DNA表達(dá)（Tolstonog et al.，2001；Corbi et al.，2010）、參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Perlson et a1.，2005；Li et al.，2006）、影響細(xì)胞遷移和黏附（Singh et al.，2003；Zhao et al.，2010）及參與調(diào)控細(xì)胞凋亡（Byun et al.，2001；Yang et al.，2005；Ise et al.，2012）等。因此，深入研究水牛VIM基因?qū)沂酒湓谒Ｂ涯讣?xì)胞成熟及附植前胚胎發(fā)育中的作用機(jī)理具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前，針對(duì)人類VIM基因的研究較多，編碼人類VIM的基因位于染色體10p13上，編碼區(qū)全長(zhǎng)1848 bp，編碼464個(gè)氨基酸，所翻譯蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量約57.00 kD，其在進(jìn)化過程中高度保守（Ivaska et al.，2007）。Tol-stonog等（2001）研究發(fā)現(xiàn)，VIM可與衛(wèi)星DNA、線粒體DNANt端粒DNA等DNA結(jié)構(gòu)相互作用；Moisan和Girard（2006）研究表明，VIM基因在人類自發(fā)凋亡的中性粒細(xì)胞表面表達(dá)，進(jìn)一步佐證VIM與細(xì)胞凋亡相關(guān)；BhaRacharya等（2009）研究證實(shí)，在內(nèi)皮細(xì)胞中VIM與黏附斑的形成有關(guān)；Kim等（2010）發(fā)現(xiàn)VIM對(duì)HEK-293和3T3細(xì)胞在膠原中的延伸及遷移起重要作用；Liu等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧情況下VIM可通過激活PAKl信號(hào)通路促使自身磷酸化并發(fā)生重排，從而增加細(xì)胞的穩(wěn)定性；Ise等（2012）研究表明，VIM以受體形式與凋亡細(xì)胞中的配體結(jié)合，從而致使凋亡細(xì)胞被包裹及清除；奈日樂（2015）研究發(fā)現(xiàn)，VIM通過影響內(nèi)蒙古絨山羊毛囊外根鞘而參與皮膚毛囊周期性生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)；邵曉婷等（2017）研究證實(shí)，VIM可促進(jìn)PCI2細(xì)胞的神經(jīng)分化?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】水牛具有耐粗飼、易飼養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，但其繁殖性能較差。VIM在組織細(xì)胞中不僅作為重要的骨架蛋白，還能通過不同方式調(diào)控多項(xiàng)細(xì)胞功能，但至今未見有關(guān)水牛VIM的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】克隆水牛VIM基因并對(duì)其基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)檢測(cè)VIM在水牛成熟卵母細(xì)胞（MII期）及早期胚胎（2-細(xì)胞階段）中的表達(dá)情況，旨在為研究VIM在卵母細(xì)胞成熟及附植前胚胎發(fā)育中的作用機(jī)理打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

水牛卵巢采自廣西南寧市肉聯(lián)食品加工廠。TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司，PrimeScript^TMRT reagentKit with gDNA Eraser、pMDl8-T載體、Cloning Kit、大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞、膠回收試劑盒等購(gòu)自TaKaRa公司，其他生化試劑均為進(jìn)口分析純。

1.2引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank）2已公布的水牛VIM基因mRNA序列（XM 006052364.1），通過Primer 5.0設(shè)計(jì)一對(duì)引物（5-CAGTCCACCGCCACCCTCTGCAG-3′和5′-CTTCTTGCTGGTAGTATTTTGCTG-3′），引物由深圳華大基因科技有限公司合成。

1.3總RNA提取

采用TRizol法提取水牛卵巢組織總RNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA含量及其完整性。同時(shí)去除基因組DNA，反應(yīng)體系10.0μL，即2.0μL5×gDNA Eraser Buffer，1.0μLgDNA Eraser，1.0μg總RNA，6.0μLRNase Free dH20。反應(yīng)條件為42℃2 min。

1.4反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

反應(yīng)體系20.0μL：10.0μL去除基因組DNA的RNA模板，1.0μL PrimeScript^RTEnzyme Mix I，4.0μL RT Primer Mix，4.0μL 5×PrimeScript Buffer 2，1.0μL RNase Free dH₂O。反轉(zhuǎn)錄程序：37℃15 min，85℃5 s。

1.5 PCR擴(kuò)增

反應(yīng)體系20.0μL：2×Taq PCR Master Mix 10.0μL，上、下游引物各0.5μL，eDNA 2.0μL，ddH₂O 7.0μL。擴(kuò)增程序：98℃預(yù)變性3 min；98℃5 s，58℃15 s，72℃20 s，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸20～30 min。

1.6 PCR產(chǎn)物連接及測(cè)序

采用膠回收試劑盒對(duì)瓊脂糖凝膠電泳分離獲得的目的片段進(jìn)行回收和純化，然后將目的片段克隆至pMD18-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，將菌液涂布于含Amp+的固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16 h后挑取單克隆菌落，并接種至含Amp+的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)PCR檢測(cè)，陽(yáng)性菌液送至深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.7生物信息學(xué)分析

使用在線軟件程序?qū)寺～@得的水牛VIM基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并預(yù)測(cè)其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽、蛋白定位、親/疏水性及其功能結(jié)構(gòu)域。

1.8表達(dá)分析

水牛成熟卵母細(xì)胞（MII期）及早期胚胎（2-細(xì)胞階段）的獲得分別參照王彩玲等（2015）、李敏玲等（2016）的方法。采用細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)VIM在水牛成熟卵母細(xì)胞（MII期）及早期胚胎（2-細(xì)胞階段）中的表達(dá)情況，將MII期的卵母細(xì)胞及2-細(xì)胞期的早期胚胎在PBS中清洗3遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3遍，以含1%Triton X-100的PBS透膜20 min，PBS清洗3遍后用含1%BSA的PBS封閉1 h；加入一抗（含1%BSA的PBS，1：200）后4℃下孵育過夜，PBS清洗3遍，每次2 min；加入二抗（含1%BSA的PBS，1：500）并室溫孵育1 h，PBS清洗3遍，每次2 min；使用抗熒光淬滅劑（含DAPI）封片，熒光顯微鏡下檢測(cè)拍照。

2結(jié)果與分析

2.1水牛VIM基因的克隆、鑒定及測(cè)序結(jié)果

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在1500 bp附近處出現(xiàn)清晰的目的條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。菌液PCR鑒定也得到相應(yīng)的目的條帶，可初步判定為陽(yáng)性克隆菌液。測(cè)序結(jié)果表明，克隆獲得的目的片段（水牛VIM基因）長(zhǎng)度為1469 bp，其中編碼區(qū)長(zhǎng)1401 bp，將其提交Gen-Bank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為MF459044。

2.2同源性比對(duì)分析結(jié)果

將克隆獲得的水牛VIM基因序列與其他物種的VIM基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因序列與人類（NM 003380.3）、黑猩猩（NM001009148.2）、食蟹猴（NM 001284705.1）、家犬（NM001287023.1）、馬（NM 001243145.1）和牛（NM 173969.3）的VIM基因序列具有很高的同源性，分別為93%、93%、93%、94%、94%和99%。對(duì)VIM基因的推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其同源性更高，與牛的同源性100%，人類的98%、家犬的98%、黑猩猩的97%、食蟹猴的97%、馬的97%，說明VIM在物種進(jìn)化過程中具有高度的保守性。

2.3系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果

利用MEGA 7.0構(gòu)建水牛VIM基因序列與NCBI已公布的牛、野雞（NM 001048076.2）、家犬、大鼠（NM 031140.1）、人類、小鼠（NM 011701.4）、安大略鮭（NM 001124729.1）、馬及虹鱒魚（NM 001124729.1）等物種VIM基因序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)水牛與牛的親緣關(guān)系最近，其次是馬和家犬，而與安大略鮭和虹鱒魚的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.4.1基本理化性質(zhì)利用NCBI的ORF finder將克隆得到的水牛VIM基因序列翻譯成相應(yīng)的氨基酸序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其編碼466個(gè)氨基酸（圖3）。利用Ex-PASy ProtParam程序預(yù)測(cè)得到水牛VIM的分子量為53.73 kD，分子式為C₂₂₉₈H₃₇₃₆N₆₈₆O₇₇₃S₁₂，理論等電點(diǎn)（pI）5.05，負(fù)電荷[天冬氨酸（Asp）+谷氨酸（Glu）]氨基酸84個(gè)，正電荷[精氨酸（Arg）+賴氨酸（Lys）]氨基酸65個(gè)，其中以高氨酸（Leu）、Glu和絲氨酸（ser）含量較高，分別為11.8%、11.6%和8.6%。該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)53.65，屬于不穩(wěn)定蛋白。

2.4.2亞細(xì)胞定位、跨膜性、信號(hào)肽和親/疏水性以PSORTⅡ程序預(yù)測(cè)水牛VIM的亞細(xì)胞定位情況，發(fā)現(xiàn)該蛋白主要定位于線粒體（82.6%）、細(xì)胞核（8.7%）和細(xì)胞質(zhì)（8.7%）；利用TMHMM 2.0預(yù)測(cè)分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)水牛VIM無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，不屬于跨膜蛋白（圖4）；采用Signal P4.1 Server預(yù)測(cè)水牛VIM信號(hào)肽，發(fā)現(xiàn)該蛋白不存在信號(hào)肽，不屬于分泌型蛋白（圖5）；利用ExPASy ProtScale預(yù)測(cè)其親/疏水性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白具有較強(qiáng)的親水性，圖6中紅色框內(nèi)為親水區(qū)域。

2.4.3蛋白結(jié)構(gòu) 采用DNAStar Protean對(duì)水牛VIM二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含有16個(gè)α-螺旋、8個(gè)β-折疊、21個(gè)T-轉(zhuǎn)角和23個(gè)無(wú)規(guī)卷曲，以α-螺旋為主（圖7）。同時(shí)利用SWISS-MODEL進(jìn)行同源建模預(yù)測(cè)水牛VIM三級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)也是以α-螺旋為主（圖8），與其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

2.4.4 VIM在水牛成熟卵母細(xì)胞及早期胚胎中的表達(dá)情況采用細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)VIM在水牛成熟卵母細(xì)胞（MII期）及早期胚胎（2-細(xì)胞階段）中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，水牛VIM在成熟卵母細(xì)胞及早期胚胎中均有表達(dá)（圖9），且在成熟卵母細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于早期胚胎。

3討論

目前，有關(guān)VIM與疾病相關(guān)性的研究較多，并已證實(shí)VIM甲基化水平可作為結(jié)腸癌（Shirahata et al.，2009）、膀胱癌及腺癌（Costa et al.，2010）、食管及胃癌（Moinova et al.，2012）、宮頸癌（Jung et al.，2011）等癌癥的早期診斷指標(biāo)。Zhao等（2010）還研究發(fā)現(xiàn)，VIM與癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力有關(guān)，且其表達(dá)在分化程度低的癌細(xì)胞中明顯增加。本研究克隆獲得水牛VIM基因，其編碼區(qū)長(zhǎng)1401 bp，編碼466個(gè)氨基酸，同源性比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果均表明，水牛刪基因與牛VIM基因的同源性最高，其次是馬和家犬，說明VIM在物種進(jìn)化過程中具有高度的保守性。在線生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白分子量為53.73 kD，理論等電點(diǎn)（pI）5.05，主要在線粒體中表達(dá)，穩(wěn)定性差（不穩(wěn)定系數(shù)53.65），具有較強(qiáng)的親水性，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，不屬于分泌型蛋白，其蛋白結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主。

此外，也有關(guān)于VIM在細(xì)胞其他功能方面的研究報(bào)道。Byun等（2001）研究發(fā)現(xiàn)VIM的裂解產(chǎn)物可使細(xì)胞凋亡加速；Perlson等（2006）研究表明，VIM作為分子伴侶去保護(hù)pErk不會(huì)被降解，而有利于pErk在細(xì)胞中進(jìn)行信息傳遞；Kueper等（2007）研究發(fā)現(xiàn)抑制VIM的修飾與改變可使組織內(nèi)源性老化推遲；Corbi等（2010）研究證實(shí)，VIM可通過與eEFlγ結(jié)合再與RNA polⅡ形成復(fù)合體以調(diào)控VIM基因的表達(dá)。本研究首次研究VIM在水牛卵母細(xì)胞附植前胚胎中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，VIM在水牛成熟卵母細(xì)胞（MII期）及早期胚胎（2-細(xì)胞階段）中均有表達(dá)，且在成熟卵母細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于早期胚胎，但具體原因有待進(jìn)一步探究。

4結(jié)論

水牛VIM基因編碼序列具有較高的保守性，且在水牛成熟卵母細(xì)胞（MII期）中的表達(dá)量明顯高于早期胚胎（2-細(xì)胞階段）。