尼羅羅非魚(yú)P2X4R基因克隆及原核表達(dá)分析

余艷玲　張永德　潘傳燕　馮鵬霏　羅洪林

摘要：【目的】克隆尼羅羅非魚(yú)P2X4R基因，并構(gòu)建原核表達(dá)載體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，為深入研究P2X4R在魚(yú)類(lèi)中的生物學(xué)功能打下基礎(chǔ)?！痉椒ā坷肞CR克隆尼羅羅非魚(yú)P2X4R基因的3個(gè)片段（Gl、G2和G3），拼接獲得目的基因后連接pCold Ⅱ載體構(gòu)建pCold Ⅱ-P2X4R重組質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，以IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。分別采用SDS-PAGE和HWestem blotting檢測(cè)分析重組蛋白P2X4R的表達(dá)情況，并運(yùn)用生物信息學(xué)在線分析軟件對(duì)其理化性質(zhì)、糖基化位點(diǎn)、跨膜區(qū)域、亞細(xì)胞定位及信號(hào)肽等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析?！窘Y(jié)果】克隆獲得的尼羅羅非P2X4R基因大小為1108 bp，與pCold Ⅱ載體重組后轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞獲得的原核表達(dá)載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可表達(dá)獲得目的蛋白，在IPTG 1.0 mmol/L、37℃誘導(dǎo)4 h的條件下重組蛋白表達(dá)量高于在IPTG 0.1 mmol/L、16℃過(guò)夜誘導(dǎo)的表達(dá)量。重組蛋白P2X4R的分子量約43.0 kD，其氨基酸數(shù)量為354個(gè)，理論等電點(diǎn)（pI）為6.78，不穩(wěn)定指數(shù)為37.62，屬于穩(wěn)定蛋白，脂肪族指數(shù)為74.35；重組蛋白P2X4R具有3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和1個(gè)O-糖基位點(diǎn)；該蛋白未見(jiàn)跨膜區(qū)，其蛋白幾乎100%位于細(xì)胞膜內(nèi)，不含信號(hào)肽?！窘Y(jié)論】誘導(dǎo)表達(dá)獲得的尼羅羅非魚(yú)P2X4R蛋白具有3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和1個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，推測(cè)其存在糖基化現(xiàn)象，可制備相應(yīng)抗體用于揭示羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞的抗原呈遞作用機(jī)制。

關(guān)鍵詞：羅非魚(yú)；P2X4R基因；克?。辉吮磉_(dá)；生物信息學(xué)分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S965.125 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）12-2259-07

0引言

【研究意義】嘌呤能P2X受體（P2XR）是由細(xì)胞外ATP激活的配體結(jié)合非選擇性陽(yáng)離子通道家族成員（Khakh and North，2006），目前已發(fā)現(xiàn)有7個(gè)亞型，分別為P2X1R～P2X7R（Egan et al.，2004；Weinholdet al.，2010），各亞基結(jié)構(gòu)特征均包含1個(gè)大的細(xì)胞外環(huán)、2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和2個(gè)（氨基和羧基末端）細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域（North，2002）。經(jīng)ATP激活后，P2XR在正常和病理?xiàng)l件下可引起不同的細(xì)胞反應(yīng)（Ralevic and Bumstock，1998），且不同P2XR亞型在免疫細(xì)胞中均有表達(dá)，參與先天免疫調(diào)節(jié)（Vitiello et al.，2012），其中P2X4R是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)量最高的P2XRSIE型。P2X4R基因主要在呼吸道細(xì)胞（Nagaoka et al.，2009；Miklavc et a1.，2013）、小膠質(zhì)細(xì)胞（Trang and Salter，2012）、心肌細(xì)胞（Yang et al.，2014）、生殖細(xì)胞（Gorodeski，2015）、中性白細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞（Di Virgilio and Vu-erich，2015）中表達(dá)，因此，明確P2X4R表達(dá)分帶情況對(duì)研究機(jī)體免疫及其調(diào)控機(jī)理具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】已有研究表明，P2X4R在小膠質(zhì)細(xì)胞中可能參與神經(jīng)性病理疼痛、炎性疼痛（Guo et al.，2005；Tsuda et al.，2005）或癌性疼痛（Gilchrist et al.，2005）調(diào)節(jié)。在大鼠C6膠質(zhì)瘤模型中，P2X4R基因在與腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)（Guo et al.，2004），]tP2X4R與P2X7R互動(dòng)激活NLRP3炎性小體（Zechet al.，2016）。P2X4R在控制動(dòng)物先天性免疫應(yīng)答過(guò)程中也發(fā)揮重要作用（de Rivero Vaccari et al.，2012；Kawano et al.，2012b；Chen et al.，2013），具體表現(xiàn)為調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞自噬能力和激活T細(xì)胞功能（Burnstock and Boeynaems，2014），但在嗜酸性粒細(xì)胞等其他免疫細(xì)胞中的功能尚未明確。成功表達(dá)P2X4R蛋白是進(jìn)一步驗(yàn)證其作用機(jī)理的基礎(chǔ)工作，李琳琳等（2014）成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)大鼠P2X4R的HEK293細(xì)胞系；Zech等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，P2RX4缺乏可緩解支氣管肺泡嗜酸性粒細(xì)胞增多、支氣管周炎、Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生和支氣管高反應(yīng)性，即P2RX4拮抗劑是治療過(guò)敏性哮喘的新選擇；Asatryan等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，P2X4R可在較低的ATP濃度（<0.1mmol/L）下被激活，激活后有助于腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的釋放，且其在觸覺(jué)異常性疼痛和神經(jīng)性疼痛中的作用已被證實(shí)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】與哺乳動(dòng)物相比，P2X4R在低等脊椎動(dòng)物中的研究報(bào)道極少，尤其在魚(yú)類(lèi)免疫學(xué)中的作用機(jī)理亟待闡明?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)克隆尼羅羅非魚(yú)P2X4R基因，并構(gòu)建其原核表達(dá)載體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以期為深入研究P2X4R在魚(yú)類(lèi)中的生物學(xué)功能打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試尼羅羅非魚(yú)取自國(guó)家級(jí)廣西南寧羅非魚(yú)良種場(chǎng)，體重326.3g/尾；大腸桿菌DH5a、BL21（DE3）表達(dá)菌株、pCold Ⅱ克隆載體和限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；2xFast Pfu Mix、NovoRecPCR一步定向克隆試劑盒及DL2000 DNAMarker購(gòu)自Novoprotein公司；AxyPrep質(zhì)粒DNA小提試劑盒購(gòu)自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司；IPTG購(gòu)自美國(guó)sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 pCodII-P2X4R質(zhì)粒載體構(gòu)建

根據(jù)尼羅羅非魚(yú)P2X4R基因序列（GenBank登錄號(hào)XM 003448554），利用Primer Premier 5.0對(duì)目的基因分3個(gè)片段（G1、G2和G3）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表1），分別為P2X4R-F/P2X4R-R1、P2X4R-F1/P2X4R-R2和P2X4R-F2/P2X4R-R，對(duì)應(yīng)目的片段大小為100、948和109 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系50.0μL：2×Fast Pfu Mix 25.0μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2.0μL，DNA模板1.0μL，ddH20補(bǔ)足至50.0μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃20 s，55℃20 s，72℃延伸（片段G1和G3為20 s，片段G2為1 min），進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。然后將擴(kuò)增獲得的3段PCR產(chǎn)物以摩爾比1：1：1等量混合作為模板，再以P2X4R-F和P2X4R-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將3段基因序列進(jìn)行拼接，PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序同上。

利用限制性?xún)?nèi)切酶Nde Ⅰ與Hind Ⅲ對(duì)pCold Ⅱ載體進(jìn)行雙酶切線性化處理，然后將拼接獲得的目的基因片段與線性化載體以摩爾比5：1混合，采用NovoRecPCR一步定向克隆試劑盒進(jìn)行連接。PCR反應(yīng)體系20.0μL：10xReaction Buffer 2.0μL，P2X4R250 ng，pCold Ⅱ（Nde Ⅰ/Hind Ⅲ）300 ng，Seamless Cloning Enzyme 1.0μL?；靹?，37℃下放置20 min后立即轉(zhuǎn)化DH5aα感受態(tài)細(xì)胞，抽提測(cè)序結(jié)果正確的陽(yáng)性克隆即為pCold Ⅱ-P2X4R重組質(zhì)粒。

1.3 PCR鑒定

挑取轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基上的白色單克隆，置于500.0μL含氨芐青霉素（Amp）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃下?lián)u床（180 r/min）培養(yǎng)3～4 h后，用于菌液PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系20.0μL：2xFast Taq Master Mix 10.0μL，上游引物P2X4R-F（10μmol/L）和下游引物P2X4R-R（10μmol/L）各1.0μL，DNA模板1.0μL，ddH20 7.0μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃20 s，55℃20 s，72℃1 min，進(jìn)行28個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性克隆經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.4 P2X4R原核表達(dá)

1.4.1表達(dá)菌株轉(zhuǎn)化采用AxvPrep質(zhì)粒DNA小提試劑盒從轉(zhuǎn)化的DH5a感受態(tài)細(xì)胞中提取pColdII-P2X4R重組質(zhì)粒，取10.0μL抽提產(chǎn)物加入到50.0μL的BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min后42℃水浴熱激45 s，立即取出置于冰上冷卻2 min，加入500.0μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃下振蕩培養(yǎng)1 h。將上述培養(yǎng)液均勻涂布于含Amp的LB固體培養(yǎng)基上，37℃下倒置培養(yǎng)16 h，挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃下?lián)u床（180r/min）培養(yǎng)3 h。對(duì)菌液進(jìn)行PCR鑒定，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，陽(yáng)性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.4.2目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 挑取陽(yáng)性單菌落接種于1.O mL的LB液體培養(yǎng)基（Amp 50 μg/mL）中，37℃下?lián)u床（180 r/min）培養(yǎng)過(guò)夜，次日按1%（v/v）比例進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃下?lián)u床（180 r/min）培養(yǎng)至OD600=0.8，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)條件：①I(mǎi)PTG1.0 mmol/L，37℃誘導(dǎo)4 h；②IPTG 0.1 mmol/L，16℃過(guò)夜誘導(dǎo)。按上述條件誘導(dǎo)表達(dá)后收集菌體，并懸浮于PBS緩沖液中，4℃下超聲波破碎，直至溶液透明。12000 r/min離心20 min，分別收集上清液和沉淀，然后進(jìn)行SDS-PAGE分析及Western blotting檢測(cè)。

1.5羅非魚(yú)P2X4R蛋白生物信息學(xué)分析

誘導(dǎo)表達(dá)獲得的尼羅羅非魚(yú)P2X4R蛋白序列采用ProtPara（http：∥web.expasy.org/protparam）進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析，采用NetNGlyc 1.0及NetOGlyc 4.0（http：∥www，expasy.org/tools）對(duì)其糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，以ProtScale（http：∥web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)其親/疏水性及穩(wěn)定性，通過(guò)TMHMM（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）進(jìn)行蛋白跨膜區(qū)和信號(hào)肽預(yù)測(cè)，以TargetP（http：∥www.cbs.dtu.dk/ser-vice/TargetP）進(jìn)行亞細(xì)胞定位，并通過(guò)SWISS-MOD-EL（https：∥swissmodel.expasy.org）進(jìn)行P2X4R蛋白同源性建模。

2結(jié)果與分析

2.1尼羅羅非魚(yú)P2X4R基因克隆

尼羅羅非魚(yú)P2X4R基因分3個(gè)片段（G1、G2和G3）進(jìn)行擴(kuò)增，電泳結(jié)果如圖1所示。其中，G1、G2和G3片段大小分別為100、948和109 bp，且均為單一的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。將3個(gè)基因片段進(jìn)行PCR拼接擴(kuò)增，結(jié)果得到大小為1108 bp的基因片段（圖2），與預(yù)期結(jié)果一致，說(shuō)明目的基因拼接效果良好。

2.2 pCold Ⅱ-P2X4R重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果

挑取轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基上的6個(gè)白色單克隆，經(jīng)PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，目的基因片段大小1108bp的單一特異性條帶（圖3），與P2X4R基因的PCR拼接擴(kuò)增結(jié)果一致，說(shuō)明P2X4R基因已成功連接至pCold Ⅱ載體上。pColdⅡ-P2X4R重組質(zhì)粒中P2X4R基因的位置如圖4所示。

2.3重組P2RX4蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)情況

采用兩種不同誘導(dǎo)條件對(duì)重組P2X4R蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析和Westem blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，兩種誘導(dǎo)條件下重組P2X4R蛋白均有表達(dá)（圖5和圖6），重組P2X4R蛋白分子量約43.0 kD，其表達(dá)形式均為包涵體，未檢測(cè)到可溶性蛋白。此外，在IPTG 1.0 mmol/L、37℃誘導(dǎo)4 h的條件下重組蛋白表達(dá)量高于在IPTG 0.1 mmol/L、16℃過(guò)夜誘導(dǎo)的表達(dá)量。

2.4尼羅羅非魚(yú)P2X4R蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果

采用ProtPara對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)獲得的尼羅羅非魚(yú)P2X4R蛋白進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白氨基酸數(shù)量為354個(gè)，理論等電點(diǎn)（pI）為6.78。尼羅羅非魚(yú)P2X4R蛋白在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞（體外）的半衰期為30 h，在酵母細(xì)胞內(nèi)的半衰期大于20 h，在大腸桿菌內(nèi)的半衰期大于10 h；不穩(wěn)定指數(shù)（Ⅱ）為37.62，屬于穩(wěn)定蛋白，脂肪族指數(shù)為74.35。糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，尼羅羅非魚(yú)P2X4R蛋白有3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，閾值為0.50（圖7），1個(gè)O-糖基位點(diǎn)。采用TMHMM對(duì)尼羅羅非魚(yú)P2X4R蛋白跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，未發(fā)現(xiàn)該蛋白存在跨膜區(qū)（圖8），其蛋白幾乎1 00%位于細(xì)胞膜內(nèi)，不含信號(hào)肽。親/疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果（圖9）顯示，尼羅羅非魚(yú)P2X4R蛋白的平均親和性（GRAVY）為-0.307，說(shuō)明該蛋白為親水性蛋白。亞細(xì)胞定位結(jié)果發(fā)現(xiàn)，尼羅羅非魚(yú)P2X4R蛋白的分泌途徑為“-”型（圖10），即定位在其他細(xì)胞器，無(wú)預(yù)測(cè)剪切位點(diǎn)序列，與TMHMM預(yù)測(cè)結(jié)果一致。利用SWISS-MODEL對(duì)尼羅羅非魚(yú)P2X4R蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖11所示。

3討論

P2X4R是不同免疫細(xì)胞表達(dá)的主要嘌呤能P2X受體亞型之一，在哺乳動(dòng)物中發(fā)揮重要的先天性免疫作用（Coutinho-Silva et al.，2005；de Rivero Vaccari et al.，2012）。與ATP結(jié)合后，P2X4R被快速活化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高、絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）激活和促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生（Seil et al.，2010；Tsuchiya et al.，2014）。P2X4R還參與NLRP3炎癥小體激活（de Rivero Vaccari et al.，2012；Chenet al.，2013）和P2X7R依賴(lài)性巨噬細(xì)胞凋亡（Kawano et al.，2012a），在微生物感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用（Hung et al.，2013）。2009年，Kawate等首次構(gòu)建了斑馬魚(yú)P2X4R的晶體結(jié)構(gòu)；Li等（2015）通過(guò)克隆日本比目魚(yú)（Paralichthys olivaceus）P2X4基因的全長(zhǎng)cDNA序列，發(fā)現(xiàn)P2X4R是一種膜糖蛋白，可與ATP釋放通道Pannexin-1相互作用，主要在日本比目魚(yú)肝胰腺中表達(dá)。本研究通過(guò)原核載體成功誘導(dǎo)表達(dá)獲得的尼羅羅非魚(yú)P2X4R蛋白主要以包涵體形式存在，其可溶性蛋白含量較少。原核表達(dá)蛋白常以包涵體形式存在，可通過(guò)蛋白復(fù)性加以解決，但蛋白復(fù)性處理程序較繁瑣，因此在誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白時(shí)最好降低甚至消除包涵體的產(chǎn)生，實(shí)現(xiàn)可溶性蛋白完全表達(dá)。導(dǎo)致原核蛋白表達(dá)形成包涵體的原因主要有兩種：一種是由于周?chē)h(huán)境的影響或缺乏所需要的酶和輔助因子，另一種是在超表達(dá)時(shí)由于折疊過(guò)快，未能及時(shí)進(jìn)行正確的折疊所導(dǎo)致（Clark，2001）。本研究結(jié)果表明，通過(guò)降低誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑濃度可降低P2X4R蛋白包涵體含量，但并未促使可溶性蛋白大量表達(dá)，后期仍需進(jìn)行包涵體復(fù)性處理以獲得可溶性P2X4R蛋白。

通過(guò)對(duì)比NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中羅非魚(yú)P2X4R蛋白序列與本研究誘導(dǎo)表達(dá)獲得的尼羅羅非魚(yú)P2X4R蛋白，發(fā)現(xiàn)二者問(wèn)的最大差異在于氨基酸數(shù)量和跨膜結(jié)構(gòu)，其跨膜區(qū)分析結(jié)果表明，參考羅非魚(yú)P2X4R蛋白有5個(gè)片段結(jié)構(gòu)，其中2個(gè)片段分布在細(xì)胞膜上，2個(gè)片段為跨膜區(qū)，1個(gè)片段分布在細(xì)胞內(nèi)；而本研究誘導(dǎo)表達(dá)獲得的尼羅羅非魚(yú)P2X4R蛋白未見(jiàn)跨膜區(qū)，蛋白序列幾乎100%位于細(xì)胞膜內(nèi)，推測(cè)該蛋白為完整羅非魚(yú)P2X4R蛋白的一部分，且是分布在細(xì)胞內(nèi)的蛋白片段。理論上，誘導(dǎo)表達(dá)的尼羅羅非魚(yú)P2X4R蛋白條帶應(yīng)略低于（Western blotting極性處理組）目的條帶，但該結(jié)果僅在IPTG 0.1 mmol/L、16℃過(guò)夜誘導(dǎo)的條件下出現(xiàn)，且出現(xiàn)一條分子量大于目的蛋白的條帶，即雙條帶現(xiàn)象。蛋白糖基化修飾是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)糖鏈添加到蛋白質(zhì)上形成寡糖鏈的過(guò)程，研究表明細(xì)胞中有一半以上的蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化。糖基化作為一種主要的翻譯后修飾方式，對(duì)蛋白功能的正常發(fā)揮起重要作用，主要調(diào)控蛋白質(zhì)在組織和細(xì)胞中的定位、功能、活性、壽命和多樣性。Gong等（2002）研究認(rèn)為，具有糖基化位點(diǎn)的蛋白可通過(guò)糖基化位點(diǎn)基因誘變以去除糖基化位點(diǎn)的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，兩種IPTG誘導(dǎo)條件下表達(dá)獲得的尼羅羅非魚(yú)P2X4R蛋白具有3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和1個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，推測(cè)其存在糖基化現(xiàn)象，但尚需通過(guò)糖基化染色進(jìn)一步驗(yàn)證。

4結(jié)論

誘導(dǎo)表達(dá)獲得的尼羅羅非魚(yú)P2X4R蛋白具有3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和1個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，推測(cè)其存在糖基化現(xiàn)象，可制備相應(yīng)抗體用于揭示羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞的抗原呈遞作用機(jī)制。