白芨種子萌發(fā)及其原球莖高效增殖體系建立

劉敏　舒雨婷　張玉瓊　郭暢　徐國力　高俊山

摘要：【目的】篩選白芨原球莖誘導(dǎo)和增殖的最適培養(yǎng)基，建立白芨原球莖高效增殖體系，為白芨種苗工廠化組培生產(chǎn)提供技術(shù)支持?！痉椒ā恳园总阜N子為外植體，篩選適宜其無菌萌發(fā)的滅菌方法；以MS或1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的植物生長物質(zhì)和附加物，通過單因素試驗，確定最佳光照和溫度條件，篩選最適合其原球莖誘導(dǎo)的培養(yǎng)基；通過正交試驗，篩選最適合其增殖的培養(yǎng)基?！窘Y(jié)果】采用75%乙醇處理白芨蒴果10 min，無菌萌發(fā)率達90.0%，且種子萌發(fā)不受影響。在原球莖誘導(dǎo)過程中，30.0μmol/m²·s光照強度和25℃溫度環(huán)境有利于原球莖誘導(dǎo)；最適合原球莖誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。在原球莖增殖過程中，添加土豆泥、椰子汁、香蕉泥等附加物對原球莖增殖有益，其中添加50.0g/L土豆泥的增殖效果最佳。正交試驗結(jié)果表明，原球莖增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+50.0 g/L土豆泥，增殖倍數(shù)達5.270?！窘Y(jié)論】建立的白芨原球莖高效增殖體系可在白芨種苗工廠化組培生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：白芨；種子萌發(fā)；原球莖誘導(dǎo)；增殖體系

中圖分類號：S567.23 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）12-2223-05

0引言

【研究意義】白芨[Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.]亦稱甘根、良姜等，是蘭科（Orchidaceae）白芨屬（Bletilla）多年生草本植物，喜潮濕，原產(chǎn)于我國長江流域（中國植物志編輯委員會，2004），安徽省是白芨主產(chǎn)大省。白芨為傳統(tǒng)中藥，性微寒，味苦澀，可用于止血斂瘡、消腫生肌（李雨晴等，2015），《中華人民共和國藥典》（中國藥典委員會，1995）亦有收載，可用于治療各種出血、疼痛及皸裂等。此外，白芨花大而艷麗，株形優(yōu)雅，可作為性狀極佳的地被植物和景觀植物，其根狀莖中的白芨膠可應(yīng)用于化妝品。由于白芨種子萌發(fā)率低、自然增殖緩慢，限制了白芨資源的開發(fā)利用，使白芨供需矛盾日趨突出，也嚴重威脅到白芨自然資源的保護。為了減輕對白芨野生資源的依賴，滿足生態(tài)綠色發(fā)展與林下經(jīng)濟發(fā)展的需要，人工繁育白芨勢在必行。植物組培能快速繁衍大批種苗，且蘭科植物原球莖繁衍增殖技術(shù)已較成熟，但目前白芨原球莖的增殖系數(shù)僅2.00～3.00，與同為蘭科植物的蝴蝶蘭相差甚遠，難以滿足市場需求。因此，優(yōu)化白芨原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)條件及擴大原球莖增殖倍數(shù)，對提高其快繁培養(yǎng)效率具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】管常東等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，白芨種子十分細小又無胚乳，在自然條件下萌生艱難，需在潮濕的苔蘚上才能發(fā)芽；傳統(tǒng)的白芨栽培主要通過分株繁衍，耗時久、效果差，且材料消耗大，難以滿足大批量栽培需要。近年來，國內(nèi)外正在探索白芨的組培技術(shù)，以實現(xiàn)人工種植，減少對野生資源的依賴。葉靜等（2010）研究認為，1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0%活性炭最適合白芨種子萌發(fā)；MS+1.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA最適宜白芨叢生芽增殖。趙漫麗等（2011）研究認為，最適合白芨種子萌發(fā)的培養(yǎng)基為MS+1.0～3.0 mg/L 6-BA+I.0 mg/L NAA+3.0 g/L碳粉；最適合白芨繼代增殖的培養(yǎng)基為MS+1.0～2.0mg/L 6-BA+2.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+4.0 g/L瓊脂+15.0 g/L魔芋粉；最有利于白芨生根的培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+I.5 mg/L NAA+1.5 mg/LIBA+70.0 g/L香蕉泥。李慧敏等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.2 mg/L NAA+附加物最適合白芨假鱗莖誘導(dǎo)。葉秀仙等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，較適宜素心建蘭種子無菌萌發(fā)的培養(yǎng)基為1/2MS+0.3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+2.0 g/L水解蛋白+1.0 g/L活性碳+30.0 g/L蔗糖。易雙雙等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，最適宜樹蘭的增殖培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，增殖系數(shù)為5.20。【本研究切入點】目前，針對建立白芨原球莖高效增殖體系的研究未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以白芨種子為外植體，篩選安全簡便高效的滅菌方法；優(yōu)化種子萌發(fā)和原球莖誘導(dǎo)的環(huán)境因子，篩選最適宜原球莖誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基，提高白芨原球莖增殖系數(shù)，建立白芨原球莖高效增殖體系，為白芨組培苗的規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試白芨果莢飽滿未破裂，顏色均勻且品質(zhì)優(yōu)良，產(chǎn)自湖北宜昌遠安縣。

1.2試驗方法

1.2.1滅菌方法篩選 將白芨蒴果用自來水沖洗30 min，用洗潔精清洗蒴果表面，然后隨機分成3個處理，處理1蒴果先用75%乙醇浸泡30～45 s，然后用0.1%升汞消毒8～10 min，無菌水沖洗5-8次，無菌濾紙吸干表面水分；處理2蒴果在75%乙醇中浸泡10min，取出后置于超凈工作臺上吹干；處理3蒴果用10%次氯酸鈉消毒8～10 min，然后用無菌水沖洗5～8次，無菌濾紙吸干表面水分。各處理均浸泡8個蒴果，浸泡液沒過蒴果。隨后剖開果莢將種子接種于1/2MS培養(yǎng)基中，每處理組接種20瓶，每組6次重復(fù)，培養(yǎng)7 d后統(tǒng)計污染數(shù)，計算無菌萌發(fā)數(shù)和萌發(fā)率。

無菌萌發(fā)數(shù)=總瓶數(shù)-污染數(shù)-不萌發(fā)數(shù)

萌發(fā)率（%）=無菌萌發(fā)瓶數(shù)/總瓶數(shù)×100

1.2.2原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選 以1/2MS和MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度6-BA和NAA組成8個培養(yǎng)基配方，篩選出白芨原球莖誘導(dǎo)的最佳植物生長物質(zhì)組合。

1.2.3原球莖誘導(dǎo)環(huán)境因子篩選 以1/2MS為基本培養(yǎng)基，分別添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA，置于光照強度梯度為黑暗、10.0μmol/m²·s、20.0μmol/m²·s和30.0μmol/m²·s及溫度梯度為10、15、20和25℃等條件下進行單因素試驗，篩選出原球莖誘導(dǎo)的最佳條件。

1.2.4原球莖增殖培養(yǎng)基篩選 分別以1/2MS、3/4MS和MS為基本培養(yǎng)基，添加0.5、1.0、1.5 mg/L 6-BA和0.1、0.2、0.3 mg/L NAA及50.0 g/L香蕉泥、土豆泥和椰子汁，通過正交試驗設(shè)計（表1），篩選出白芨原球莖增殖系數(shù)最高的培養(yǎng)基配方。

培養(yǎng)條件：選擇形態(tài)大小相近、未開裂的白芨蒴果，滅菌后將果莢內(nèi)的種子接入不同設(shè)置的培養(yǎng)基，各組處理均添加7.8 g/L瓊脂粉和30.0 g/L蔗糖，并將pH調(diào)整為5.8～6.0，每天光照14 h。

1.3統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 18.0進行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同滅菌方法對白芨種子萌發(fā)的影響

從表2可看出，白芨果莢3種滅菌處理方式的污染率存在顯著差異（P<0.05，下同），其中處理2的滅菌效果最好，無菌萌發(fā)率達90.0%，顯著高于處理1和處N3。綜合考慮操作簡便、成本較低及環(huán)境友好等因素，后續(xù)試驗選擇處理2滅菌方法進行滅菌。

2.2不同基本培養(yǎng)基和植物生長物質(zhì)濃度配比對白芨原球莖誘導(dǎo)的影響

從表3可看出，不同配方培養(yǎng)基對白芨原球莖誘導(dǎo)效果明顯不同，以1/2MS培養(yǎng)基中原球莖誘導(dǎo)萌發(fā)和生長速度較快，其中又以1號培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果最佳，培養(yǎng)約17.00 d即萌發(fā)，萌發(fā)兩周見綠，且顏色很深，說明較低濃度的植物生長物質(zhì)組合（1.0 mg/L6-BA+0.1 mg/L NAA）有利于白芨原球莖誘導(dǎo)和生長。

由表4可知，基礎(chǔ)培養(yǎng)基類型、6-BA和NAA濃度對白芨原球莖的誘導(dǎo)均有極顯著影響（P<0.01，下同），以基礎(chǔ)培養(yǎng)基類型和6-BA濃度的影響更突出。

綜合分析白芨種子的萌發(fā)時間和生長情況，在培養(yǎng)基1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA中，白芨原球莖的誘導(dǎo)速度最陜，長勢最佳。

2.3不同光照強度對白芨原球莖誘導(dǎo)的影響

由表5可知，不同光照強度對白芨原球莖誘導(dǎo)存在顯著影響，在一定范圍內(nèi)光照強度提高有利于白芨原球莖誘導(dǎo)，其中光照強度為30.0μmol/m²·s時白芨原球莖誘導(dǎo)效果最佳，種子萌發(fā)時間最短（僅20.00 d），原球莖長勢極佳，而黑暗處理的白芨種子幾乎不萌發(fā)，處理50 d后轉(zhuǎn)入光照條件下培養(yǎng)可萌發(fā)。

2.4不同溫度對白芨原球莖誘導(dǎo)的影響

由表6可知，不同溫度對白芨原球莖誘導(dǎo)存在顯著差異，低溫延緩白芨種子萌發(fā)和原球莖形成，適宜溫度對原球莖的誘導(dǎo)較有利，在20～25℃時種子萌發(fā)及原球莖形成更快，以25℃為白芨原球莖誘導(dǎo)最佳溫度，誘導(dǎo)23.00 d原球莖即萌發(fā)，且長勢極佳。

2.5不同培養(yǎng)基對白芨原球莖增殖的影響

從表7可看出，不同培養(yǎng)基配方對白芨原球莖增殖效果的影響明顯不同。其中，MS培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L 6-BA、0.2 mg/L NAA和50.0 g/L土豆泥，白芨原球莖的增殖倍數(shù)達5.270。正交試驗結(jié)果表明，培養(yǎng)基成分對原球莖的增殖倍數(shù)有顯著影響，其中，最佳基本培養(yǎng)基類型為MS培養(yǎng)基，最佳6-BA濃度為0.5 mg/L，最佳NAA濃度為0.2 mg/L，最有利于原球莖增殖的附加物為50.0 g/L土豆泥。綜合考慮，原球莖增殖的最佳配方為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/LNAA+50.0 g/L土豆泥。

3討論

本研究探索不同滅菌方法、基本培養(yǎng)基、環(huán)境因素、植物生長物質(zhì)和附加物等對白芨原球莖誘導(dǎo)和增殖的影響，篩選適合原球莖誘導(dǎo)和增殖的最佳培養(yǎng)基，以構(gòu)建白芨原球莖高效增殖體系。其中，75%酒精滅菌方式操作環(huán)節(jié)少，對白芨無毒害作用，滅菌效果（滅菌率達90.0%）優(yōu)于次氯酸鈉和升汞。Thompson等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，對多種非洲蘭科植物果實最適宜的滅菌方法是先噴灑75%酒精，再用1.75%次氯酸鈉和1%吐溫-20滅菌20 min，然后用1%苯菌靈消毒10 min，最后用無菌水沖洗，滅菌率達65%以上，滅菌效果較本研究差。胡琦敏等（2016）研究表明，最適合蘭科植物灰?guī)r金線蓮蒴果的滅菌方法是0.1%升汞浸泡20 min，種子萌發(fā)率最高，但滅菌方法比本研究繁瑣，耗時較長。

管常東等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA是白芨原球莖誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基，本研究結(jié)果與其相似，白芨原球莖誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。袁寧等（2009）研究認為，1/2MS+1.0 mg/L 6-BA是適宜白芨種子無菌萌發(fā)的培養(yǎng)基，種子在無菌播種約45 d時萌發(fā)，生長狀態(tài)良好，但萌發(fā)時間比本研究長，可能與本研究中加入0.1 mg/L NAA并在光照下培養(yǎng)可促進原球莖萌發(fā)生長有關(guān)。

本研究中，在30.0μmol/m²·s和25℃條件下白芨種子即可萌發(fā)，萌發(fā)后10.00 d即變綠，約20.00 d可見原球莖生長，而袁寧等（2009）對白芨種子采用20～25℃、暗培養(yǎng)條件，45 d左右種子才萌發(fā)，葉靜等（2010）對白芨原球莖先進行暗培養(yǎng)5 d，20 d后變成綠色，27 d產(chǎn)生原球莖，33 d長出芽尖，結(jié)合本研究中暗培養(yǎng)50 d種子不萌發(fā)分析，光照是促進白芨種子萌發(fā)的重要條件。Thompson等（2006）在25℃和8.5μmol/m²·s光照下培養(yǎng)多種非洲蘭科植物種子，種子萌發(fā)后生長狀態(tài)良好，所使用的光照強度小于本研究，說明不同種蘭科植物種子的無菌萌發(fā)可能需光程度不同，提供光照可明顯縮短其萌發(fā)時間，加速原球莖形成進程。本研究中，白芨種子萌發(fā)和原球莖生長的較佳溫度為20～25℃，與Jhompson等（2006）、袁寧（2009）的研究結(jié)果一致，可作為白芨原球莖規(guī)?；囵B(yǎng)溫度。

Jiang等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，以獨花蘭嫩芽為外植體，在最佳增殖培養(yǎng)基1/2MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA中增殖倍數(shù)為1.4-3.3。石云平等（2013）研究認為，MS+1.0 mg/L 6-BA+3.0 mg/L 2，4-D為最適宜增殖培養(yǎng)基，叢芽增殖倍數(shù)達2.88。本研究中，白芨原球莖增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L6-BA+0.2 mg/L NAA+50.0 g/L土豆泥，增殖倍數(shù)達5.270，明顯高于上述研究結(jié)果，可能與適當(dāng)降低植物生長物質(zhì)濃度特別是NAA濃度及添加50.0 g/L土豆泥有利于原球莖增殖有關(guān)。本研究的增殖培養(yǎng)基可提高白芨原球莖增殖倍數(shù)，有利于白芨批量繁殖，可在工廠化生產(chǎn)中投入使用。

4結(jié)論

本研究建立的白芨原球莖高效增殖體系為：使用75%乙醇浸泡白芨果莢10 min消毒滅菌，以1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA為原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+50.0 g/L土豆泥為增殖培養(yǎng)基。該體系可在白芨種苗工廠化組培生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。