橡膠樹膠孢炭疽菌T—DNA標記基因Lv1初步分析

鄭肖蘭 李秋潔 許沛冬 吳偉懷 鄭金龍 習(xí)金根 梁艷瓊 李銳 張馳成 鄭行愷 賀春萍 易克賢

摘 要 通過對實驗室已構(gòu)建的膠孢炭疽菌T-DNA突變體庫中各突變體致病力的測定，獲得致病力喪失突變菌株T-900，利用TAIL-PCR克隆標記基因側(cè)翼序列，進行比對和序列分析，獲取假設(shè)基因Lv1的全序列，采用生物信息學(xué)方法進行Lv1基因預(yù)測及功能分析，最后通過敲除野生型菌株RC178中的基因Lv1進行功能分析。結(jié)果表明，獲取的假定基因Lv1全序列共4 450 bp，基因預(yù)測顯示T-DNA側(cè)翼序列位于預(yù)測基因的1 727 bp處，正好處于預(yù)測基因的第1個外顯子內(nèi)；并且推測該基因為組蛋白H3基因，含有2個內(nèi)含子，3個外顯子；功能驗證結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除突變體△T-900-16與T-900致病力表現(xiàn)一致，推測Lv1基因與RC178的致病力相關(guān)。

關(guān)鍵詞 膠孢炭疽菌；T-DNA；Lv1；功能分析

中圖分類號 Q78；S432.4 文獻標識碼 A

Abstract Anthracnose leafspot， caused by the fungal pathogen Colletotrichum gloeosporioides， is a devastating disease that affects rubber trees. A mutant strain T-900 was obtained from T-DNA insertion mutation library， with weakened virulence to rubber trees. The flanking sequence was cloned by Tail-PCR and compared with the whole genome sequence of C. gloeosporioides. A 4 450 bp length DNA sequence was obtained and named as Lv1， which was submitted to NCBI for gene prediction and functional analysis. The results showed that the T-DNA insertion site was located at 1 727 bp of Lv1， in the first exon of the gene. Gene structural analysis indicated that Lv1 was speculated as a histone H3 gene with 3 exons and 2 introns. By knocking out Lv1 from a wild strain RC178， the virulence of △T-900-16 was as the same as T-900， which proved that Lv1 was related to the virulence of RC178.

Key words Colletotrichum gloeosporioides； T-DNA； Lv1； functional analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.02.022

橡膠是重要的工業(yè)原料，天然橡膠具有合成橡膠不可代替的特性。商品天然橡膠約99%產(chǎn)自橡膠樹，全世界橡膠樹栽培總面積1 000萬hm2，其中中國有92萬hm2，橡膠樹炭疽病是限制我國橡膠增產(chǎn)的主要因子之一，其病原菌致病性遺傳方面的資料是橡膠樹抗病品種的選育和持久利用的理論基礎(chǔ)[1]。而克隆致病相關(guān)基因則是橡膠樹炭疽病菌致病性的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)工作。

隨著DNA測序技術(shù)的發(fā)展，大量的生物基因組序列在GenBank中快速積累，功能基因組學(xué)成為當(dāng)前生命科學(xué)研究的熱點，目前，基于遺傳學(xué)的基因突變技術(shù)是基因功能研究的重要方法之一[2]。土壤桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)（ATMT）已經(jīng)成為研究病原真菌功能基因的重要技術(shù)[3-4]。通過ATMT突變體尋找致病性相關(guān)基因已成為目前研究橡膠樹炭疽病菌的分子致病機理最有效的研究方法。本試驗從構(gòu)建的橡膠樹炭疽病菌T-DNA插入突變體庫中，篩選獲得一株致病性明顯減弱的突變菌株T-900。通過對T-900的表型分析和插入位點側(cè)翼序列的克隆，結(jié)合生物信息學(xué)分析插入突變基因（擬命名為less virulence 1， 縮寫Lv1），并對其功能進行分析，推測Lv1是橡膠樹膠孢炭疽菌致病性相關(guān)的基因，本研究為闡明橡膠樹炭疽病菌致病的分子機理奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：橡膠樹膠孢炭疽菌野生型RC178，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所保存，突變菌株T-900從本實驗室構(gòu)建的橡膠樹膠孢炭疽菌T-DNA突變體庫中篩選獲得。

1.2 方法

1.2.1 膠孢炭疽菌突變菌株T-900致病力測定

參照劉艷等[5]的方法，采用健康的幼嫩葉片進行離體接種。

1.2.2 T-DNA插入位點基因Lv1獲得及生物信息學(xué)分析 為鑒定轉(zhuǎn)化子T-DNA插入拷貝數(shù)的情況，大量提取已被PCR證實且致病力喪失的4個轉(zhuǎn)化子DNA，經(jīng)EcoRⅠ充分酶切后，進行Southern雜交分析。所用的探針為啟動子捕獲載體質(zhì)粒 pCAHPH 中的潮霉素片段，經(jīng)過電泳分離，膠回收后經(jīng)標記獲得。Southern雜交采用地高辛標記試劑盒，改良的實驗方法包括Southern雜交、洗膜及顯色反應(yīng)等參照翟李剛[6]的碩士論文。T-900 T-DNA側(cè)翼序列的克隆則采用TAIL-PCR方法擴增T-900的側(cè)翼序列，所采用的特異引物和簡并引物參考劉艷[7]的碩士論文，并將獲得的側(cè)翼序列在NCBI及橡膠樹膠孢炭疽菌全基因組序列上進行比對分析，分析其同源序列，并獲取插入位點預(yù)測基因Lv1的全序列。進而分析其外顯子、內(nèi)含子。利用Expasy提供的ProtParam、ProtScale、COIL等在線工具分別預(yù)測該基因編碼蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)、親疏水性、卷曲螺旋區(qū)域等；用SignaP4.1 server工具預(yù)測蛋白質(zhì)的信號肽；用PredictProtein工具預(yù)測二級結(jié)構(gòu)；用SMART工具預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域；用Psort工具對該蛋白質(zhì)序列進行亞細胞定位預(yù)測；用Protfun2.2工具進行功能預(yù)測。

1.2.3 T-DNA插入位點基因Lv1功能分析

（1）Lv1基因敲除突變體的獲得。以pCT74質(zhì)粒為模板，以HYG/F（5′GGCTTGGCTGGAGCTAGTGGAGGTCAA3′）和HY/R（5′GTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAA3′）為引物擴增潮霉素抗性基因hph左側(cè)片段，以YG/F（5′GATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCT3′）和HYG/R（5′AACCCGCGGTCGGCATCTACTCTATTC3′）為引物擴增hph右側(cè)片段。然后以RC178的基因組DNA為模板，在Lv1基因上游片段設(shè)計引物：a-F（5′TCCTGTGTCTTTGCGTTTGG3′）和a-R（5′TTGACCTCCACTAGCTCCAGCCAAGCCGGAGTGATTGTGTGCCAGAC3′）；在Lv1基因下游片段設(shè)計引物：b-F（5′GAATAGAGTAGATGCCGACCGCGGGTTAAACAGCAGCAAAGGATGGC3′）和b-R（5′GGGGAGCATAGTATCGGAAAGTACA3′）；通過這兩對引物擴增Lv1基因的上下游片段。引物a-R和b-F 5′端的27 bp分別與HYG/F和HYG/R的序列反向互補。PCR反應(yīng)體系：PCRmix 25 μL、引物2 μL、模板1 μL、H2O 22 μL；PCR反應(yīng)程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)完成后，將PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖進行電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。將預(yù)期片段的PCR產(chǎn)物膠回收，連接，轉(zhuǎn)化后送測序。分析獲得的PCR片段序列與橡膠樹膠孢炭疽菌序列的差異。

以基因上游片段a和hph左側(cè)片段HH的回收產(chǎn)物為模板，以a-F、HY/R為引物；以基因下游片段b和hph右側(cè)片段HY的回收產(chǎn)物為模板，以YG/F、b-R為引物，分別進行融合PCR，獲得基因上游片段與hph左側(cè)片段的融合產(chǎn)物a+HH，和基因下游片段與hph右側(cè)片段的融合產(chǎn)物b+HY。將預(yù)期目的條帶大小的片段回收，連接，轉(zhuǎn)化后送上海立菲生物技術(shù)有限公司測序，并將獲得的正確融合PCR產(chǎn)物保存于 -20 ℃，用于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。

利用同源重組原理對橡膠樹炭疽菌RC178的Lv1進行全基因敲除，具體方法參照李秋潔[8]的碩士論文。

（2）基因敲除突變體的分子驗證。設(shè)計5組引物對獲得的Lv1基因敲除突變菌株進行驗證：①在 hph基因內(nèi)部設(shè)計引物HYG/F與HYG/R，以RC178及突變體基因組為模板，用潮霉素hph基因內(nèi)部引物HYG/F和HYG/R組合，PCR擴增獲得的潮霉素抗性基因片段。原則上疑似突變體中的靶標基因被hph基因替代，或者是hph基因隨機插入突變體基因組中時，均能擴增出目標片段，而野生型菌株和陰性基因敲除突變體則不能擴增目標條帶。②在Lv1基因內(nèi)部設(shè)計引物H3-F（5′CAGCCCAGTT

TCCTACCTA3′）和H3-R（5′ACGCATTCGTAACGCCAGA3′），以野生型和基因敲除突變體基因組進行PCR擴增，如果目的基因Lv1為單拷貝的話，該引物對不能從基因敲除陽性突變體基因組中擴出條帶，但能從野生型和陰性基因敲除突變體基因組中擴增出目的條帶；如果目的基因在菌株總基因組中屬于多拷貝基因，突變體只是敲除了其中一個拷貝，仍然存在著其他與目的基因相同的基因片斷時PCR也能擴增到相應(yīng)條帶。③為了證明獲得的轉(zhuǎn)化子是否為Lv1基因敲除突變體，以該基因兩側(cè)遠端設(shè)計H3-F1（5′TGACAGTGGGCAGCAGGTAT3′）和H3-R1（5′ACGGAAGAGGGGCATTAGGT3′）引物對，以野生型和基因敲除突變體基因組進行PCR擴增，該引物對可進一步驗證獲得的敲除突變體中Lv1基因片段敲除與否。④為了確定是否存在已敲除Lv1基因突變體，在該基因上游設(shè)計引物H3-F2（5′AAAAAAGGGCCATGGTACGTACTCC3′）與潮霉素抗性基因內(nèi)部引物HY/R配對；同時在該基因下游設(shè)計引物H3-R2（5′CCCTACGGCGGTTGAGAATC3′）和潮霉素抗性基因右臂內(nèi)部引物YG/F配對，以野生型和敲除突變體基因組為模板進行PCR擴增，此兩組引物對均可從基因敲除陽性突變體中擴出目的條帶，但不能從野生型與陰性突變體擴出條帶。

（3）Lv1基因敲除突變體的致病力測定。方法參見1.2.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 T-900與RC178的致病力測試

通過離體葉片菌餅刺傷接種測試，接種4 d后觀察，結(jié)果如圖1，發(fā)現(xiàn)空白對照無發(fā)??；T-900雖有發(fā)病，但病斑極?。籖C178發(fā)病，病斑大而且變黑褐色，可見T-900的致病力明顯比野生型菌株RC178的致病力弱。

2.2 T-900的T-DNA插入位點基因Lv1分析

雜交分析結(jié)果如圖2-A，用于雜交的4個轉(zhuǎn)化子插入拷貝數(shù)如下：T-990為3拷貝、T-900為2拷貝、T-1103為單拷貝、T-1580為3拷貝。

圖2-B為T-900經(jīng)過TAIL-PCR擴增的第2輪和第3輪產(chǎn)物的電泳圖，通過對第3輪產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化、克隆和測序，獲得1條1 275 bp特異片段。

將PCR產(chǎn)物序列在NCBI上進行比對，結(jié)果與粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）的H3組蛋白相似性為100%，和蛇苔屬植物的H3組蛋白相似性為99%，據(jù)此初步推測該T-DNA插入位點相關(guān)基因為H3組蛋白相關(guān)基因。

與橡膠樹炭疽病菌全基因組序列進行比對，獲取包括側(cè)翼序列在內(nèi)的4 450 bp核苷酸序列作為預(yù)測基因Lv1，將該序列提交到softberry網(wǎng)站，以 Magnaporthe grisea、Fusarium graminearum和Aspergillus等模式菌進行基因預(yù)測結(jié)果顯示：T-DNA側(cè)翼序列位于預(yù)測基因的1 727 bp處，正好處于預(yù)測基因的第1個外顯子內(nèi)；并且推測該基因為組蛋白H3基因，與前面推測結(jié)果一致；此外，該預(yù)測基因編碼蛋白，含有2個內(nèi)含子和3個外顯子（圖3）。

依據(jù)Lv1核苷酸序列預(yù)測的氨基酸序列為：MARTKQTARKSTGGKAPRKQLASKAARKSAPSTGGVKKPHRYKPGTVALREIRRYQKSTELLIRKLPFQRLVREIAQDFKSDLRFQSSAIGALQESVESYLVSLFEDTNLCAIHAKRVTIQSKDIQLARRLRGERN。對預(yù)測到完整的氨基酸序列，進一步進行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)含有136個氨基酸殘基數(shù)，分子質(zhì)量為15 391.8 u，理論等電點為11.15，分子式為：C672H1 134N216O193S2。不穩(wěn)定系數(shù)為49.3，屬于不穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為80.44，總平均疏水性為-0.717。親疏水性分析表明：該氨基酸序列的親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，在第99～109個氨基酸之間出現(xiàn)疏水性最大值1.378，此區(qū)間疏水性較高；在第37～47氨基酸之間出現(xiàn)親水性最大值-2.70，此區(qū)間親水性較高。綜合總平均疏水性和親疏水性圖的結(jié)果，推測該氨基酸序列所編碼的蛋白質(zhì)具有較強的親水性。預(yù)測蛋白無信號肽，說明該蛋白為非分泌蛋白。該蛋白質(zhì)序列含有51.5%的α螺旋，含有2.2% β折疊，46.3%的無規(guī)卷曲（環(huán)狀結(jié)構(gòu)）。且該蛋白在34～136氨基酸區(qū)域存在H3組蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域與Chaetomium globosum（球毛殼菌）組蛋白H3同源性最高。其亞細胞定位于細胞核，這與H3組蛋白是核小體的組成部分是一致的。同時預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白屬結(jié)構(gòu)性蛋白。

2.3 T-DNA插入位點基因Lv1功能分析

2.3.1 Lv1基因敲除突變體的獲得 采用融合PCR法構(gòu)建Lv1基因敲除突變體，結(jié)果如圖4：泳道1和4是以RC178為模板，分別以a-F和a-R，b-F和b-R為引物擴增Lv1基因的上下游片段，獲得的上游片段a，大小為1 096 bp；下游片段b，大小為854 bp。泳道 2和5是以pCT74質(zhì)粒為模板，以HYG/F和HY/R配對，YG/F與HYG/R配對為引物分別擴增hph左右側(cè)片段，獲得的左側(cè)片段HH，大小為798 bp；獲得的右側(cè)片段HY，大小為918 bp。泳道3是a-F與HYG/R為引物，以上游片段a與潮霉素抗性基因左臂HH為模板，進行融合PCR獲得a+HH產(chǎn)物；泳道6是以b-R與YG-F為引物，下游片段b與潮霉素抗性基因右臂HY為模板進行融合PCR獲得b+HY產(chǎn)物。融合片段a+HH和b+HY回收純化、連接、轉(zhuǎn)化、測序，結(jié)果表明融合片段a+HH（1 879 bp）和b+HY（1 753 bp）為預(yù)期片段，證明融合成功（圖4）。

回收純化片段a+HH和b+HY等量混合轉(zhuǎn)化到RC178原生質(zhì)體中，獲得基因敲除突變體，用含250 μg/mL潮霉素培養(yǎng)基進行篩選（圖5），未轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子和RC178在含潮霉素（250 μg/mL）的培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d未長出菌落，正常生長的為基因敲除突變體，結(jié)果一共獲得23個基因敲除突變體，分別命名為△T-900-1、△T-900-2、△T-900-3……△T-900-22、△T-900-23。

2.3.2 Lv1基因敲除突變體的分子驗證 圖6是以RC178及基因敲除疑似突變體基因組為模板，用潮霉素hph基因內(nèi)部引物HYG/F和HYG/R組合，PCR擴增獲得的潮霉素抗性基因片段。從圖6可知，隨機挑取的菌株除RC178外，其他參試基因敲除突變體均擴增出目標條帶，說明參試的突變體均檢測到潮霉素抗性標記基因，推測疑似突變體中的靶標基因已經(jīng)被潮霉素hph基因替代，或者是hph基因隨機插入突變體基因組中。

為了剔除hph基因隨機插入突變體，本試驗以Lv1基因內(nèi)部引物H3-F和H3-R擴增RC178及基因敲除疑似突變體基因組，驗證是否被潮霉素抗性基因置換Lv1。由電泳結(jié)果圖7得知：隨機挑取的每株參試菌包括RC178均能擴增出Lv1基因片斷，推測其原因一個是真正的Lv1基因沒有被敲除，另一個原因是Lv1基因在菌株總基因組中屬于多拷貝基因，突變體只是敲除了其中一個拷貝，仍然存在著其他與目的基因相同的基因片斷。所以PCR能擴增到條帶。

圖8是以H3-F1和H3-R1為引物，PCR擴增RC178和基因敲除突變體基因組的結(jié)果，從圖8可知：泳道1、3、7、8、14、16、19對應(yīng)的突變體為△T-900-1、△T-900-3、△T-900-7、△T-900-8、△T-900-14、△T-900-16、△T-900-19，這些突變體均能擴增出2條條帶：一條1 800 bp左右，另一條2 300 bp左右，此結(jié)果與預(yù)期結(jié)果完全符合。

圖9是引物H3-F2與HY/R配對，H3-R2與YG/F配對，以野生型和敲除突變體基因組為模板進行PCR擴增的結(jié)果。上下游擴增結(jié)果均顯示：泳道1、2、4、6對應(yīng)的突變體△T-900-1、△T-900-3、△T-900-8、△T-900-16對應(yīng)的泳道顯示擴增出目標條帶，證明這4個基因敲除突變體中的Lv1已經(jīng)被敲除。

2.3.3 基因敲除突變體的表型分析 Lv1基因敲除突變體的菌落形態(tài)如圖10，從圖10得知其菌絲顏色及菌落形態(tài)變化不大，但生長速率突變體均比野生型菌株RC178 明顯減弱。

對Lv1基因敲除突變體的致病力測試結(jié)果（圖11）表明，突變體△T-900-1、△T-900-3、△T-900-8的致病力變化并不十分明顯，△T-900-1和△T-900-8甚至有致病力增強的趨勢，僅有△T-900-16致病力明顯減弱。

3 討論

差異表達基因的檢測與分析已成為研究具有差異生物學(xué)表型的常規(guī)策略，對通過實驗所獲得的差異基因片段進行生物信息學(xué)分析，主要包括基于國際互聯(lián)網(wǎng)的序列相似性分析、片段重疊群分析和全長cDNA序列分析，以此對獲得的插入位點基因片段進行功能預(yù)測。

此外，基因敲除是應(yīng)用DNA同源重組原理發(fā)展起來的一門新技術(shù)，是研究基因功能的重要手段。為了深入研究Lv1在野生型菌株RC178致病過程中的作用，本課題構(gòu)建了Lv1基因靶向敲除載體，進一步用于轉(zhuǎn)染RC178原生質(zhì)體，建立Lv1基因敲除突變體，并觀察Lv1在致病過程中的作用。

在Lv1基因敲除突變體的PCR驗證過程中，每個參試菌株均能擴增出目的基因片斷，推測其原因一個是真正的Lv1沒有被敲除，另一個原因是該基因在菌株總基因組中屬于多拷貝基因，突變體只是敲除了其中一個拷貝，仍然存在著其他與該基因相同的基因片斷，所以PCR能擴增到條帶；這與相關(guān)文獻報道H3組蛋白基因是已知的重復(fù)基因中唯一的一種具有蛋白質(zhì)編碼機能的基因，它們在DNA合成開始前短暫地表達，因而它的活動與細胞周期密切相關(guān)[9]相符合。推測上述原因也造成Lv1基因敲除突變體的致病力測試結(jié)果中△T-900-3與RC178比較差異并不明顯，△T-900-1、△T-900-8甚至有致病力增強的趨勢。造成此結(jié)果另外原因推測：由于插入突變體T-900的拷貝數(shù)為2，在目的基因敲除過程中有可能敲除另外一個插入側(cè)翼序列，或者由于組蛋白能被組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶進行可逆的甲基化修飾，從而影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)。這與黃鵬云[9]研究發(fā)現(xiàn)稻瘟病菌中由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶所修飾的H3組蛋白甲基化模式，影響染色質(zhì)的狀態(tài)，進而宏觀上影響基因表達，并最終影響稻瘟病菌的發(fā)育和致病過程一致；此外，李毛毛[10]研究發(fā)現(xiàn)組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶HATs在生物體中具有重要的作用，通過與組蛋白去乙?；窰DAC的相互作用實現(xiàn)了生物體內(nèi)基因組整體水平的調(diào)控。HATs和HDAC主要通過對組蛋白中H3、H4核心組蛋白中Lys殘基的乙酰化和去乙?；?，實現(xiàn)調(diào)控不同功能基因的表達；致病力測試結(jié)果中唯有△T-900-16致病力減弱，與原來T-900致病力相似，推測為Lv1已經(jīng)被敲除，下一步工作將設(shè)計引物，將敲除的基因Lv1重新導(dǎo)入△T-900-16作為互補的恢復(fù)菌株，進一步將Lv1基因進行深入研究。

參考文獻

[1] 鄭肖蘭， 傅 帥， 鄭服叢， 等. 植物病原菌抗藥性研究進展[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 31（1）： 86-90.

[2] Zheng Xiaolan， Liu Yan， Wei Xiaohui， et al. Generation and analysis of pathogenicity-related gene mutants of Colletotrichum gloeosporioides using a novel promoter trapping system[J]. Plant Diseases and Pests， 2013（3）： 12-15， 19.

[3] 馮 娟， 朱廷恒， 崔志峰， 等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的灰葡萄孢T-DNA插入突變菌株庫構(gòu)建及插入位點[J]. 微生物學(xué)報， 2009 50（2）： 169-173.

[4] Liu Liping， Zhao Dian， Zheng Lu， et al. Identification of virulence genes in the crucifer anthracnose fungus Colletotrichum higginsianum by insertional mutagenesis[J]. Molecular Pathogenesis， 2013， 64： 6-17.

[5] 劉 艷， 賀春萍， 易克賢， 等. 橡膠炭疽病菌致病相關(guān)突變體的篩選及表型分析[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2014， 35（11）： 2 278-2 283.

[6] 翟李剛. 橡膠樹膠孢炭疽菌CgATG4和CgATG8基因的克隆與功能初步分析[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2013.

[7] 劉 艷. 橡膠炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）致病相關(guān)突變體表型分析及插入位點定位[D]. 海口： 海南大學(xué)， 2010.

[8] 李秋潔. 柱花草炭疽病菌致病缺陷轉(zhuǎn)化子的篩選及其致病相關(guān)基因StCg-ALS和StCg-800的功能分析[D]. ?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)， 2015.

[9] 黃鵬云. 組蛋白H3甲基化模式在稻瘟病菌發(fā)育和致病過程中的功能分析[D]. 杭州： 浙江大學(xué)， 2015.

[10] 李毛毛. 大豆疫霉組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因PsGCN5的克隆與功能分析[D]. 合肥： 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2013.