小?？Х热~片解剖結(jié)構(gòu)和綜合抗旱性評(píng)價(jià)

王睿芳 馬劍 潘耕耘 陳國(guó)松 趙萬(wàn)里

摘 要 以7個(gè)品種的小?？Х葹楣┰嚥牧?，通過(guò)測(cè)定葉片厚度（LT）、角質(zhì)層厚度（CT）、柵欄組織厚度（PT）、海綿組織厚度（ST）、氣孔密度（SD）和葉片小脈密度（VD），并計(jì)算出葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度（MTR）、葉片組織結(jié)構(gòu)疏松度（MLR）和氣孔面積指數(shù)（SPI），分析其抗旱能力的差異，為小?？Х仍耘嗪秃Y選抗旱性狀提供理論依據(jù)。結(jié)果表明，所選9個(gè)抗旱性指標(biāo)，品種間差異顯著，運(yùn)用主成分分析方法結(jié)果顯示，PT和MTR載荷較高，是反映小?？Х瓤购敌孕畔⒌闹饕蜃?，可以作為評(píng)價(jià)小粒咖啡抗旱性的主要指標(biāo)。其中德熱169、P7963和矮卡綜合抗旱能力較強(qiáng)，CCCA24較弱，P2，德熱296和鐵畢卡居中。

關(guān)鍵詞 小?？Х龋蝗~片解剖結(jié)構(gòu)；柵欄組織厚度；抗旱性

中圖分類(lèi)號(hào) S571.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Leaf anatomical characteristics of 7 Coffea arabica cultivars were investigated to reveal the drought-resistant strategies in Puer， Yunnan. The stomatal density（SD）， leaf thickness（LT）， cuticle thickness（CT）， palisade mesophyll thickness（PT）， spongy mesophyll thickness（ST）and vein density（VD）， and calculated mesophyll structure tense ratio（MTR）， mesophyll structure loosened ratio（MLR）and stomatal pore area index（SPI）were measured. Results showed that 9 leaf anatomical characteristics were significantly different among cultivars. PT and MTR could be effective indicators of drought resistance for C. arabica based on principal component analysis. Dere169， P7963 and Aika were the most drought-resistant cultivars， the remaining cultivars were more drought-resistant than CCCA24.

Key words Coffea arabica； leaf anatomical characteristic； palisade mesophyll thickness； drought resistance

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.02.010

干旱脅迫是影響植物生存、生產(chǎn)和分布最普遍的非生物逆境之一，植物的一生中頻繁遭受空氣和土壤水分的脅迫[1]。因此，植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)與適應(yīng)機(jī)制一直是植物生理生態(tài)學(xué)研究的熱點(diǎn)。葉片既是水分在植物體中運(yùn)輸進(jìn)行光合作用的瓶頸，也是植物進(jìn)行水分蒸騰、運(yùn)輸?shù)拈T(mén)戶(hù)[2-3]。由于葉片受環(huán)境因子的影響顯著，對(duì)干旱等逆境反應(yīng)敏感，其形態(tài)結(jié)構(gòu)特征直接影響到植物的生理活動(dòng)和生態(tài)功能，對(duì)于評(píng)價(jià)植物的抗旱性能具有不可替代的作用[4-5]。

長(zhǎng)期生長(zhǎng)在干旱環(huán)境中的植物葉片通常表現(xiàn)出葉片厚度大、角質(zhì)層厚、柵欄組織厚、海綿組織厚度小、葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度高、疏松度低和氣孔密度高等解剖結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[6-9]。葉片小脈（Minor vein density）則是葉片水分分發(fā)系統(tǒng)，高的小脈密度可以提高水分在葉肉組織中運(yùn)輸所覆蓋的表面積，減少水從葉脈末端到達(dá)蒸騰位置的距離[10]。通常生長(zhǎng)在干旱地區(qū)的植物具有較高的葉脈密度[11]。因此，葉片的許多解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)可以表征植物的抗旱能力，如何綜合葉片的旱生結(jié)構(gòu)特征，對(duì)于評(píng)價(jià)植物的抗旱性有重要意義[12]。

小粒咖啡（Coffea arabica L.）是淺根性經(jīng)濟(jì)作物，原是熱帶雨林的林下成分，在系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中形成了喜濕潤(rùn)的生態(tài)習(xí)性，屬于對(duì)干旱敏感的植物[13-14]。輕度水分脅迫即可導(dǎo)致光合速率下降[15-17]。隨著水分脅迫的加劇，導(dǎo)致葉綠素降解[18]，抗壞血酸過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶等酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸和丙二醛含量增加，蔗糖轉(zhuǎn)化酶、蔗糖磷酸合酶及果糖-1，6-二磷酸酶增加，促使可溶性糖類(lèi)物質(zhì)增加而淀粉含量減少[19]，整個(gè)植株光合碳積累減少，下部葉片變黃凋落，上部新形成的葉片變厚變小[20]等生理生化和形態(tài)上的響應(yīng)。然而，作為“云南高原特色農(nóng)業(yè)”的小?？Х确N植主要分布于云南干熱區(qū)的山地、坡地，灌溉條件差，而且冬春干旱和夏秋間歇性干旱在云南咖啡種植區(qū)普遍發(fā)生，咖啡的產(chǎn)量和品質(zhì)得不到保障。近年來(lái)，許多學(xué)者開(kāi)展了咖啡的抗旱性生理生化特征研究[14-23]，而缺乏通過(guò)葉片解剖結(jié)構(gòu)定量分析多個(gè)品種間抗旱性差異的研究。本研究運(yùn)用解剖學(xué)方法，研究特定生境下云南小?？Х痊F(xiàn)有主要品種葉片的抗旱性特征，以期為選育抗旱品種提供必要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用7個(gè)品種的小?？Х龋謩e為P7963，矮卡，鐵畢卡，CCCA24，P2，德熱169，德熱296。取樣地點(diǎn)位于云南省普洱市思茅區(qū)的云南省小?？Х攘挤N苗木繁育基地（22°67′N(xiāo)，100°88′E；1 000～1 100 m）。實(shí)驗(yàn)用地位于東南坡，坡度為20 ℃。選擇生長(zhǎng)在同一水平階上長(zhǎng)勢(shì)一致的6年生小?？Х葹閷?shí)驗(yàn)材料，種植密度為4 950株/hm2。實(shí)驗(yàn)地土壤為赤紅壤，土層0～20 cm有機(jī)質(zhì)3.07 g/kg，全C 13.69 g/kg，全N 1.35 g/kg，全P 0.38 g/kg，全K 2.30 g/kg。土壤容重為1.49 g/cm3，田間持水量為23.98%。實(shí)驗(yàn)地常規(guī)施肥分4次進(jìn)行：第1次3月，過(guò)磷酸鈣150 g/株；第2次6月，復(fù)合肥150 g/株，尿素100 g/株；第3次8月，復(fù)合肥150 g/株；第4次12月，有機(jī)肥6 000 g/株（由咖啡果皮和咖啡銀皮堆漚而成），鈣鎂磷肥200 g/株。實(shí)驗(yàn)地采用滴灌供水（僅在旱季11月至翌年4月）。

2016年4月對(duì)目標(biāo)樹(shù)種取樣，從至少5棵不同個(gè)體上采集5～10個(gè)成熟陽(yáng)生葉片。葉片采下后立刻放入FAA（Formalin-acetic acid-alcohol，70%酒精90 mL+冰醋酸5 mL+福爾馬林5 mL）固定，加入5 mL甘油以防止蒸發(fā)和材料收縮變硬。所有樣品取樣時(shí)間為晴天上午9 ： 00～11 ： 00 am。

1.2 方法

1.2.1 葉片的橫切結(jié)構(gòu)觀察與測(cè)定 葉片橫切需要避開(kāi)主脈，采用徒手切片方法制作葉片的橫切臨時(shí)裝片。在雙筒光學(xué)顯微鏡（Leica DM2500，Leica-Microsystems，Wetzlar，Germany）下20倍和40倍下觀察并拍照，每個(gè)葉片拍攝 5～7 個(gè)視野，共取25個(gè)重復(fù)。用 ImageJ（v.1.48；developed by National Institute of Mental Health，Bethesda，Maryland，USA）圖形處理軟件測(cè)定葉片厚度（Leaf thickness；LT）、角質(zhì)層厚度（Cuticle thickness；CT），柵欄組織厚度（Palisade mesophyll thickness；PT）和海綿組織厚度（Spongy mesophyll thickness；ST），并計(jì)算葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度（Mesophyll structure tense ratio；MTR=PT/LT）和葉片組織結(jié)構(gòu)疏松度（Mesophyll structure loosened ratio；MLR=ST/LT）；所有樣品測(cè)定在中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園熱帶森林重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2.2 氣孔特征 剪取葉片中部2～3 cm葉段，避開(kāi)主脈把葉段分為兩部分，用刀片輕輕刮去葉肉組織，觀察下表皮氣孔特征。因咖啡是典型的葉片下表皮氣孔植物[20]，取下表皮制成臨時(shí)裝片。每個(gè)葉片在顯微鏡40倍鏡頭下拍攝5～7個(gè)視野，共取25個(gè)重復(fù)。用ImageJ軟件測(cè)出保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度并數(shù)出單位面積內(nèi)氣孔數(shù)量，計(jì)算氣孔密度（Stomatal density，SD）和氣孔面積指數(shù)（Stomatal pore area index，SPI）。

1.2.3 小葉脈長(zhǎng)度和葉脈密度 為了測(cè)量小葉脈密度，剪取葉片中部1 cm2的區(qū)域，25個(gè)重復(fù)。將剪下的樣本放入盛有5%氫氧化鈉溶液的試管中，置于恒溫水浴槽（中國(guó)常州，諾基，DKZ-450B）中。水浴槽的溫度設(shè)置在70 ℃，轉(zhuǎn)速設(shè)置在每分鐘60轉(zhuǎn)。試管中的氫氧化鈉溶液每天更換，直到葉肉組織被清除，葉脈顯現(xiàn)出來(lái)為止。將處理過(guò)的樣本在蒸餾水中浸泡30 min后制片裝片，用光學(xué)顯微鏡DM2500觀察并拍照。每個(gè)圖片中葉脈的長(zhǎng)度用圖像處理軟件ImageJ測(cè)量，葉脈密度（Vein density，VD）是單位面積內(nèi)葉脈的總長(zhǎng)度。

1.2.4 不同抗旱性指標(biāo)的抗旱性評(píng)價(jià) 對(duì)7個(gè)品種的小?？Х鹊?項(xiàng)葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)進(jìn)行隸屬函數(shù)值的計(jì)算，其公式[9]：

X（μ）=（X-Xmin）/（Xmax-Xmin）

式中μ為品種代號(hào)，X（μ）表示該品種的隸屬函數(shù)值，X表示各指標(biāo)的測(cè)定值，Xmax和Xmin分別表示各處理組所對(duì)應(yīng)指標(biāo)的最大和最小測(cè)定值。

1.2.5 綜合抗旱性排名 對(duì)所有抗旱性生理指標(biāo)運(yùn)用主成分分析方法，進(jìn)行綜合抗旱性評(píng)價(jià)。即用主成分分析法提取累計(jì)方差貢獻(xiàn)率≥80%的公因子，計(jì)算小粒咖啡不同品種的公因子得分，再以各主成分的方差貢獻(xiàn)率為權(quán)數(shù)，對(duì)所提取的得分進(jìn)行加權(quán)求和，得到各品種的抗旱性綜合評(píng)分。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

采用單因素一元方差分析（One-Way ANOVA，Ducan test）來(lái)檢驗(yàn)每一指標(biāo)不同品種間的差異顯著性。統(tǒng)計(jì)分析在SPSS 18.0軟件中進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 小?？Х戎仓耆~片解剖特征比較和相關(guān)性分析

7個(gè)品種的小?？Х雀鹘馄侍卣鞔嬖陲@著差異（表1）。在測(cè)定的9個(gè)葉片性狀中，MLR為52.16%～62.36%，變異系數(shù)最小（7.85%）；SPI為12.05%～20.02%，變異系數(shù)最大（26.30%）；其余的性狀變異系數(shù)介于9.64%～24.66%之間。P7963、矮卡和德熱169的葉片和柵欄組織較厚，柵欄組織在葉片中的分配比例較高，使得這3個(gè)品種的MTR較高。而較高的海綿組織分配比例，使得德熱296的MLR較高。葉表皮氣孔密度差異顯著，其中德熱296的SD最高，為236.81 No./mm2，而矮卡的SD最低，為163.94 No./mm2。德熱169和CCCA24的VD顯著差異，但顯著高于其他5個(gè)品種，其中德熱296的VD最小，為6.55 μm/μm2。7個(gè)品種之間的CT變異較小，其中德熱296的CT最厚，為7.63 μm，顯著高于其它6個(gè)品種。

為了驗(yàn)證植物特征之間是否存在相關(guān)性關(guān)系，對(duì)葉片解剖性狀的9個(gè)指標(biāo)進(jìn)行了兩兩分析并發(fā)現(xiàn)一些特征間存在顯著的相關(guān)關(guān)系（表2）。比如，LT 與MTR之間顯著正相關(guān)，與MLR之間顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明隨著LT的加厚，葉片的PT所占比例增加，ST所占比例減少。CT與LT和MTR存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系，與MLR呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明隨著葉片致密度和葉片厚度的增加，角質(zhì)層厚度增加。VD與LT和MTR顯著的負(fù)相關(guān)，與MLR顯著的正相關(guān)，說(shuō)明隨著葉片厚度和柵欄組織比例的增加，單位葉片面積的葉脈變短。

2.2 不同抗旱指標(biāo)下小粒咖啡抗旱性排序

運(yùn)用隸屬函數(shù)法對(duì)7個(gè)小?？Х鹊目购敌赃M(jìn)行了排序（表3），均值越大，表明抗旱性越強(qiáng)。其中德熱169在CT，MTR和SD抗旱性?xún)?yōu)勢(shì)強(qiáng)于其它品種，抗旱性強(qiáng)。P7963和矮卡分別在ST和LT上的表現(xiàn)出抗旱性?xún)?yōu)勢(shì)，抗旱性較強(qiáng)。而CCCA24只有LT較有抗旱性?xún)?yōu)勢(shì)，其它指標(biāo)均表現(xiàn)出較弱的抗旱性。德熱296，P2和鐵畢卡分別在SPI，MLR，ST和VD上表現(xiàn)出抗旱優(yōu)勢(shì)，但其它指標(biāo)抗旱性相對(duì)較弱。

2.3 主成分分析和小?？Х瓤购敌跃C合排序

由表2可以看出，多數(shù)指標(biāo)相關(guān)性達(dá)到顯著相關(guān)性關(guān)系，過(guò)多地選入密切相關(guān)的指標(biāo)，不利于揭示類(lèi)型特征，選擇彼此獨(dú)立的有代表性的指標(biāo)才能獲得最優(yōu)的方案。因此，為了更全面地評(píng)價(jià)小?？Х鹊目购敌?，對(duì)9個(gè)葉片解剖指標(biāo)進(jìn)行主成分分析。各指標(biāo)在主成分中的載荷值越大，表明其對(duì)該主成分的貢獻(xiàn)越大，典型性越強(qiáng)。由表4可以看出，前2個(gè)主成分能夠解釋9個(gè)葉片解剖性狀總變異的63%，其中第一主成分對(duì)總變異的貢獻(xiàn)率為39%，第二主成分的貢獻(xiàn)率為24%。對(duì)第一主成分貢獻(xiàn)較大的性狀是MTR，PT和MLR，反映了葉片解剖結(jié)構(gòu)中柵欄組織厚度和分配比例的信息；對(duì)第二主成分貢獻(xiàn)較大的性狀是SPI和SD，反映了氣孔的分布信息。第三主成分中，ST因子載荷最高，反映了葉片海綿組織的狀況。前3個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為80.695%，基本能代表出7個(gè)小粒咖啡品種9個(gè)抗旱性解剖結(jié)構(gòu)性狀的重要信息。

將各因子載荷換算為規(guī)格化特征向量后，可以得到反映綜合抗旱性的3個(gè)主成分表達(dá)式：

F1=-0.103x1+0.430x2-0.356x3-0.055x4+0.428x5+0.199x6+0.482x7+0.155x8-0.174x9；F2=0.382x1-0.246x2+0.362x3+0.470x4+0.267x5+0.136x6-0.073x7+0.517x8-0.208x9；F3=0.508x1+0.204x2-0.305x3+0.424x4-0.194x5+0.331x6+0.072x7-0.406x8-0.198x9。

將7個(gè)品種的小?？Х鹊?個(gè)葉片解剖指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化值x1～x9分別代入3個(gè)表達(dá)式得出不同小粒咖啡的抗旱性綜合得分（表5）。結(jié)果表明，德熱169，P7963和矮卡綜合得分分別為0.994、0.806、0.662，抗旱能力強(qiáng)；CCCA24和P2綜合得分分別為-1.824和-0.388，抗旱能力較弱，且低于其它小?？Х绕贩N。

3 討論

發(fā)達(dá)的柵欄組織可避免干旱地區(qū)和旱季強(qiáng)烈光照對(duì)葉肉細(xì)胞中光合器官的損傷，柵欄組織越厚，柵欄組織與葉厚度的比值越大，則植物利用光能的效率越高。矮卡、德熱169和P7963的PT和MTR顯著高于其它4個(gè)品種，并在第一主成分中載荷最大，這和張義等[12]評(píng)價(jià)西寧園林植物抗旱性，王勇[24]等評(píng)價(jià)黃花蒿干旱耐受選擇的指標(biāo)相同，說(shuō)明PT和MTR是評(píng)價(jià)植物抗旱性的重要指標(biāo)。此外，小?？Х仍诳諝釩O2濃度和飽和光的條件下，其最大瞬時(shí)光合速率保持在4～11 μmol CO2/（m2·s），是樹(shù)木中光合較低的一種常綠灌木[25]。但是根據(jù)小?？Х裙夂纤俾屎桶gCO2濃度擬合曲線，預(yù)測(cè)小?？Х热~片的最大光合速率可超過(guò)20 μmol CO2/（m2·s）[25]。Batista[26]認(rèn)為，小粒咖啡較低的光合速率，源于CO2在葉片中擴(kuò)散阻力較大。矮卡和德熱169葉肉柵欄組織較厚，且海綿組織相對(duì)減少，該特征有助于縮短 CO2從氣孔下室到光合作用場(chǎng)所的傳導(dǎo)距離，從而提高植物對(duì)水分的利用率，表現(xiàn)出較高的綜合抗旱適應(yīng)性。

在干旱環(huán)境下生長(zhǎng)的植物，葉片經(jīng)常表現(xiàn)出較高的氣孔密度，而在潮濕或者光照較弱的環(huán)境下，植物傾向于擁有較大的氣孔[27]。葉脈密度和氣孔密度在應(yīng)對(duì)濕度和光照的變化時(shí)表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)[28]。在本研究中，德熱296的SD值分別高于綜合抗旱性較強(qiáng)的矮卡44.45%，去掉表皮細(xì)胞大小的影響后，其SPI仍高于矮卡66.14%，VD差異不顯著。高的氣孔密度一方面使得單位葉片表面保衛(wèi)細(xì)胞/表皮細(xì)胞的比例增加，另一方面單位面積的氣孔更小，從而使得氣孔可以較快速地應(yīng)對(duì)環(huán)境因子變化[29]。且隸屬函數(shù)分析也表明，德熱296的SPI具有較強(qiáng)的抗旱性?xún)?yōu)勢(shì)。

4 結(jié)論

總的說(shuō)來(lái)，7個(gè)品種的小?？Х热~片解剖結(jié)構(gòu)特征差異顯著，隸屬函數(shù)值也表明不同品種抗旱性?xún)?yōu)勢(shì)指標(biāo)不同。因此，7個(gè)品種的小粒咖啡在干旱條件的適應(yīng)能力和抗旱機(jī)制不同。通過(guò)主成分分析法可知，PT、MTR是反映小?？Х瓤购的芰^為敏感的葉片解剖性狀，德熱169綜合抗旱能力最強(qiáng)。植物的抗旱性除了受到葉片形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)的影響，還與葉片內(nèi)部生理生化活動(dòng)和自身發(fā)育進(jìn)程相關(guān)，也受到生境中環(huán)境條件的影響。本研究?jī)H從葉片解剖水平對(duì)7個(gè)品種小粒咖啡的綜合抗旱性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，有一定局限性。在今后的研究中，可從生物量分配、根系特征、細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)和酶活性等多個(gè)抗旱性特征對(duì)多個(gè)品種進(jìn)行深入的比較研究。對(duì)云南干熱地區(qū)的特色經(jīng)濟(jì)作物小?？Х炔煌贩N的葉片解剖優(yōu)勢(shì)抗旱特征及其它抗旱性特征的綜合研究有助于選育抗旱新品質(zhì)，培育新品種，將對(duì)保護(hù)脆弱的山地生態(tài)系統(tǒng)、合理持續(xù)利用植物資源具有重要的理論和指導(dǎo)意義。

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