超聲輔助復(fù)配酶法制備黃姜中薯蕷皂素

肖婉娜 李欣 賴家良 賴航通 李子文 韓褒

摘要[目的]探討超聲輔助酶法水解黃姜生產(chǎn)薯蕷皂素工藝。[方法]通過正交試驗(yàn)優(yōu)化纖維素酶和蝸牛酶組成的復(fù)配酶水解黃姜，建立高效液相色譜法定量薯蕷皂素，計(jì)算得率。[結(jié)果]酶解溫度對薯蕷皂素得率的影響最大；最佳酶水解條件是酶解時(shí)間為48 h，酶添加量為物料的8%，酶解pH為6.0，酶解溫度為50 ℃，薯蕷皂素的得率為0.524 9%。采用超聲破碎輔助復(fù)配酶解法，薯蕷皂素的得率為0.630 9%。[結(jié)論]利用超聲輔助纖維素酶和蝸牛酶提取黃姜中薯蕷皂素比直接酶解法得率提高了25%，接近酸解法的得率，應(yīng)用潛力大。

關(guān)鍵詞黃姜；薯蕷皂素；超聲波輔助提?。晃伵Ｃ?；纖維素酶

中圖分類號S284.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2017）16-0121-05

Preparation Technology of Diosgenin of Dioscorea zingiberensis C.H.Wright by Ultrasonicassisted Coenzyme Hydrolysis

XIAO Wanna，LI Xin*，LAI Jialiang et al（Guangdong Polytechnic of Science And Trade，Guangzhou，Guangdong 510430）

Abstract[Objective]The research aimed to explore the preparation technology of diosgenin of Dioscorea zingiberensis by ultrasonicassisted coenzyme hydrolysis.[Method]The orthogonal experiment was carried out to optimize the cellulase and snail enzyme composition of the enzyme to hydrolyze the turmeric，and established HPLC method to determine the yield of diosgenin.[Result]The key factor affected extraction of diosgenin was enzymolysis temperature.The optimal condition for enzymatic hydrolysis were as follows：enzymolysis time of 48 h，enzyme dosage of 8%，enzymatic hydrolysis of pH 6.0，and enzymolysis temperature of 50 ℃.Thus，the yield of diosgenin prepared under those condition was up to 0.524 9%.Interestingly，the yield of diosgenin obtained by ultrasonic assisted coenzymatic hydrolysis was 0.630 9%.[Conclusion]The yield of diosgenin obtained by ultrasonic assisted coenzymatic hydrolysis increased by 25% compared with that obtained by the direct enzymatic hydrolysis，which was close to that obtained by the acidic hydrolysis.Thus，it plays a potential role in preparing diosgenin of Dioscorea zingiberensis.

Key wordsDioscorea zingiberensis C.H.Wright；Digestion；Ultrasonicassisted extraction；Snailase；Cellulase

黃姜，學(xué)名盾葉薯蕷（Dioscorea zingiberensis C.H.Wright），是我國傳統(tǒng)中藥材，常以根莖入藥。薯蕷皂素，又稱薯蕷皂苷元，是薯蕷屬植物薯蕷皂苷的水解產(chǎn)物，是合成腎上腺皮質(zhì)激素、性激素和蛋白質(zhì)同化激素等甾體激素藥物的原料[1]。薯蕷皂素在植物體內(nèi)是以薯蕷皂苷配基形式存在、通過皂苷鍵與不同的糖基側(cè)鏈相連，進(jìn)而與植物細(xì)胞壁緊密連接。黃姜的根莖中薯蕷皂素通過糖苷鍵與糖類結(jié)合形成薯蕷皂苷存在于植物細(xì)胞壁中，甾體皂苷常被淀粉和纖維素包裹。工業(yè)上普遍采用無機(jī)酸水解工藝提取黃姜中薯蕷皂素，該法工藝簡單、操作簡便，但廢水量極大，酸性強(qiáng)、環(huán)境污染嚴(yán)重，廢渣中的淀粉和纖維素類物質(zhì)因混有酸而難以利用，造成資源浪費(fèi)，嚴(yán)重制約了薯蕷皂素產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2-6]。

目前，國內(nèi)對薯蕷皂素的酶和微生物轉(zhuǎn)化法研究較多。微生物發(fā)酵法具有污染小、成本低的特點(diǎn)，缺點(diǎn)是薯蕷皂素轉(zhuǎn)化率低。而酶水解斷裂糖苷鍵專一性強(qiáng)，缺點(diǎn)是多數(shù)酶的成本較高，限制了其廣泛應(yīng)用[7-9]。鑒于此，筆者探討采用廉價(jià)的纖維素酶和蝸牛酶復(fù)配水解黃姜超聲波輔助提取薯蕷皂素的新工藝，以期為薯蕷皂素的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1原料。新鮮盾葉薯蕷，野生，產(chǎn)地四川廣元。

1.1.2藥品與試劑。薯蕷皂素標(biāo)準(zhǔn)品、中溫淀粉酶、糖化酶購自上海阿拉丁生化科技公司；甲醇、乙腈購自德國默克公司；石油醚（90～120 ℃）、磷酸氫二鈉、冰乙酸購自天津富宇精細(xì)化工公司；纖維素酶購自上海金穗生物科技有限公司；β-葡萄糖苷酶購自國藥集團(tuán)；蝸牛酶購自合肥志宏生物技術(shù)有限公司，其他試劑均為分析純試劑。

1.1.3主要儀器設(shè)備。

高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）、水浴恒溫振蕩器（鞏義市予華儀器公司）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器公司）、小型臺(tái)式離心機(jī)（德國Sigma公司）、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、電子天平（梅特勒-托利多公司）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1原料的處理。將新鮮黃姜清洗去除泥沙切片，50 ℃烘干后打粉，過100目篩，備用。

1.2.2酸解法制備薯蕷皂素。

稱取黃姜粉末1 g置于100 mL燒杯中，加入50 mL 2 mol/L硫酸溶液，90 ℃水浴酸解6 h，水解液于9 000 r/min離心10 min，離心2次，棄上清液，渣用100 mL石油醚90 ℃回流6 h，減壓濃縮，將粗皂素80 ℃烘干，用甲醇定容至10 mL，0.45 μm濾膜過濾后作為供試品溶液備用。

1.2.3薯蕷皂素的定量方法——高效液相色譜法。

1.2.3.1對照品溶液的配制。準(zhǔn)確稱取9.4 mg薯蕷皂素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至10 mL。

1.2.3.2流動(dòng)相的選擇。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選取以下流動(dòng)相進(jìn)行采集：甲醇-水（80∶20）、甲醇-水（90∶10）、乙腈-水（80∶20）。

1.2.3.3波長的選擇。色譜柱WondaSil C18（5 μm，4.6 mm×150 mm），紫外檢測波長分別選用200、203、206、208和 210 nm，流動(dòng)相為乙腈-水（80∶20），流速1 mL/min。

1.2.3.4色譜柱的選擇。選擇WondaSil C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）柱、WondaSil C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）柱和NuAnalybacal Uranus C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）柱3種色譜柱，紫外波長為203 nm，流動(dòng)相為乙腈-水（80∶20），流速1 mL/min。

1.2.3.5方法學(xué)考察。將薯蕷皂素對照品溶液稀釋成4.7、47.0、94.0、235.0、470.0、705.0、940.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣測定。以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察線性關(guān)系；吸取薯蕷皂素對照品溶液6份，分別測量峰面積，考察精密度；樣品溶液于1、2、4、8、12、24 h分別測定1次，測量峰面積，考察穩(wěn)定性；取對照品溶液6份，用已知薯蕷皂素含量的樣品溶液定容，測量峰面積，計(jì)算回收率。

1.2.4酶解法制備薯蕷皂素。

1.2.4.1酶的篩選。稱取黃姜粉，加水90 ℃糊化1 h，冷卻，或不糊化處理，分別添加淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖酶、蝸牛酶的1種或多種復(fù)配水解，水解結(jié)束后離心，棄上清液，渣用石油醚90 ℃回流提取6 h，減壓濃縮、殘?jiān)眉状级ㄈ荩M(jìn)行液相色譜法檢測，比較薯蕷皂素的得率，確定最優(yōu)酶組合。

1.2.4.2酶解法單因素試驗(yàn)。根據(jù)“1.2.4.1”確定最優(yōu)酶組合，進(jìn)行蝸牛酶單因素試驗(yàn)，纖維素酶統(tǒng)一添加量為物料的4%，pH 5.0，溫度50 ℃，反應(yīng)48 h后滅活得預(yù)處理液。預(yù)處理液6份分別添加蝸牛酶量占物料的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，50 ℃振蕩水解1、6、12、24、48、72 h，測薯蕷皂素得率，考察水解時(shí)間對薯蕷皂素的影響；預(yù)處理液5份，添加蝸牛酶量占物料的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、2%、4%、8%、10%，50 ℃振蕩水浴48 h，測薯蕷皂素得率，考察酶添加量對薯蕷皂素得率的影響；預(yù)處理液5份，pH分別調(diào)為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，添加蝸牛酶量占物料的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，50 ℃振蕩水解48 h，測薯蕷皂素得率，考察酶反應(yīng)pH對薯蕷皂素得率的影響；預(yù)處理液6份，添加蝸牛酶量占物料的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，分別于35、40、45、50、55、60 ℃的恒溫振蕩水浴鍋中水解48 h，測薯蕷皂素得率，考察酶水解溫度對薯蕷皂素得率的影響。

1.2.4.3酶解法正交試驗(yàn)。根據(jù)“1.2.4.2”的單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇4因素3水平L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.2.4.4超聲輔助酶解制備薯蕷皂素。將黃姜粉加水進(jìn)行超聲破碎后再加酶水解，超聲條件為570 W，45 min，70 ℃。

2結(jié)果與分析

2.1薯蕷皂素的定量方法——高效液相色譜法

2.1.1流動(dòng)相的選擇。

考察不同比例甲醇-水等度洗脫對分離效果的影響，結(jié)果表明，甲醇比例越高，極性強(qiáng)的皂苷重疊得越嚴(yán)重，分離度越低；甲醇比例調(diào)低，分離度改善，但皂素峰出峰時(shí)間超過30 min，試劑消耗太多（圖1a、b）。采用乙腈-水（80∶20）溶液作為流動(dòng)相，皂苷分離良好，皂素出峰也快，峰型較尖銳（圖1c）。同時(shí)，由于薯蕷皂苷為末端吸收，而乙腈的截止波長為190 nm[10]，在試驗(yàn)波長203 nm下有吸收，但低于甲醇的截止波長（205 nm），檢測靈敏度更高，因此，選用乙腈-水（80∶20）為流動(dòng)相。

2.1.2波長的選擇?？疾鞕z測波長對峰面積和分離度的影響，結(jié)果顯示，薯蕷皂素在200、203、206、208、210 nm處均有吸收，而在203 nm處響應(yīng)值最高，故選取203 nm作為檢測波長。

2.1.3色譜柱的選擇?？疾觳煌盍虾椭L色譜柱的分離效果，在乙腈-水（80∶20）等度洗脫下，薯蕷皂素從WondaSil C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）柱、WondaSil C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）柱和NuAnalybacal Uranus C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）柱中的出峰時(shí)間分別為12.989、21.991和23.415 min（圖2）。弱極性的薯蕷皂素在NuAnalybacal Uranus C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）柱中響應(yīng)值最低，可能是柱子的填料對薯蕷皂素保留能力較強(qiáng)，用乙腈-水作為流動(dòng)相無法將薯蕷皂素完全洗脫出。綜合考量，選擇WondaSil C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）柱為分離定量色譜柱。

2.1.4方法學(xué)考察。從圖3可看出，薯蕷皂素標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為y=7.530 9x-51.292（R2=0.998 7），表明該方法在4.7～940.0 μg/mL線性良好。

由于樣品溶液中含有多種組分，采用反相高效液相色譜法測定薯蕷皂素比分光光度計(jì)法干擾少[10-11]。方法精密度試驗(yàn)RSD值為1.29%，穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD值為0.95%，平均回收率為97.81%，該方法精密度良好，測定樣品溶液穩(wěn)定，回收率高。

45卷16期肖婉娜等超聲輔助復(fù)配酶法制備黃姜中薯蕷皂素

2.2酶解法轉(zhuǎn)化制備薯蕷皂素

2.2.1酶的篩選。試驗(yàn)表明，不糊化的薯蕷皂素的得率比糊化的高（表1）?？赡艿脑蚴俏锪辖?jīng)過糊化后體積膨大、黏度上升，后期水解又產(chǎn)生了大量的糖，這些糖和添加的酶互相粘連，對酶反應(yīng)起了抑制作用。淀粉酶組合糖化酶或纖維素酶水解糊化后的黃姜粉末，未檢測到薯蕷皂素。蝸牛酶和纖維素酶組合對不糊化黃姜粉的水解效果最佳（表1）。目前僅少數(shù)幾種酶如淀粉酶、糖苷酶、纖維素酶等用于水解薯蕷皂苷[12-15]，蝸牛酶和β-葡萄糖苷酶均有切割皂苷中游離端的葡萄糖、鼠李糖等糖基作用，并且蝸牛酶屬于價(jià)格適中的酶種之一，已廣泛應(yīng)用于輕工紡織、食品工業(yè)等領(lǐng)域[16]，蝸牛酶具備水解生產(chǎn)薯蕷皂苷的應(yīng)用潛力。因此確定復(fù)合酶組合為纖維素酶和蝸牛酶。

2.2.2酶解法單因素試驗(yàn)。薯蕷皂素的得率隨反應(yīng)時(shí)間的增加而增加，48 h達(dá)到最大值，之后，呈平穩(wěn)下降趨勢（圖4）。

薯蕷皂素的得率隨著酶用量的增加而增加，當(dāng)添加量占物料的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%時(shí)，薯蕷皂素的得率達(dá)到最大值，隨后穩(wěn)定下降（圖5）。黃姜中皂苷與蝸牛酶的結(jié)合位點(diǎn)有限，當(dāng)這些結(jié)合位點(diǎn)全部被酶占領(lǐng)后，過量的酶環(huán)繞在周圍導(dǎo)致酶和底物的無效吸附，阻礙水解反應(yīng)，從而引起得率下降。

水解液pH為4.0～6.0時(shí)，薯蕷皂素的得率呈上升趨勢；pH為6.0時(shí)達(dá)最大，并穩(wěn)定在6.0～7.0；pH為4.0和8.0時(shí)，薯蕷皂素的得率均低于0.2%（圖6），可見蝸牛酶適合在中性偏酸的pH體系。

水解溫度為35～50 ℃時(shí)，薯蕷皂素的得率隨溫度上升而增加， 50 ℃時(shí)達(dá)到最大值；超過50 ℃，蝸牛酶開始部分失活，產(chǎn)率急劇下降；到60 ℃幾乎完全失活，薯蕷皂苷的得率僅0.03%（圖7）。因此蝸牛酶的作用溫度為35～50 ℃，最適為50 ℃。

2.2.3酶解法正交試驗(yàn)。選擇酶解時(shí)間、酶添加量、酶解pH、酶解溫度4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。從表2可看出，各因素對薯蕷皂素得率的影響從大到小依次為酶解溫度、酶添加量、酶解時(shí)間、酶解pH，最佳組合是A2B2C2D2，即酶解48 h，酶添加量為物料的8%，酶解pH為6.0，水解溫度為50 ℃。

按正交試驗(yàn)確定的最佳條件驗(yàn)證水解薯蕷皂素的得率為0.524 9%，是傳統(tǒng)直接酸水解法（得率0.677 0%） 的77.53%。薯蕷皂苷在強(qiáng)酸的作用下，可以水解出薯蕷皂素、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖等，但酶的轉(zhuǎn)化有專一性，蝸牛酶是一種復(fù)合酶，其所含酶種類未必對皂苷上所有的糖苷鍵均有酶切作用，因此較難實(shí)現(xiàn)對薯蕷皂苷的完全轉(zhuǎn)化[17]。另外，該試驗(yàn)采用的黃姜原料的薯蕷皂素含量低于閆美屹[14]研究的結(jié)論，可能與品種以及采收時(shí)間有關(guān)[18]，需進(jìn)一步研究篩選出薯蕷皂素含量高的黃姜原料。

2.3各種薯蕷皂素提取方法的比較

超聲波輔助酶法提取薯蕷皂素的得率（0.630 9%）高于直接復(fù)合酶水解法（0.524 9%）約25%。超聲波的輻射壓強(qiáng)產(chǎn)生的強(qiáng)烈擊碎效應(yīng)，使黃姜中部分皂苷的結(jié)合狀態(tài)發(fā)生改變，斷裂了纖維素和淀粉與皂苷的連接，使部分被包裹的糖苷鍵裸露出來，酶解反應(yīng)更容易進(jìn)行，水解更充分[18]，另外，超聲破碎技術(shù)將黃姜的細(xì)胞壁擊碎，提高了水解效率，從而該方法的得率與直接酸水解的得率接近。但超聲波輔助酶解技術(shù)比全料酸水解的得率（0.677 0%）略低，可能是前者有部分疏水皂苷沒有提取到，或由于酶的專一性，部分糖苷鍵尚未完全水解，需要應(yīng)用質(zhì)譜或核磁技術(shù)進(jìn)行確定，進(jìn)一步篩選和開發(fā)特異性酶品種或其他轉(zhuǎn)化技術(shù)，是今后的研究方向。

3結(jié)論

該研究利用纖維素酶和蝸牛酶組成的復(fù)配酶制備薯蕷皂素，建立了薯蕷皂素的液相色譜檢測方法，分離柱為WondaSil C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）柱，流動(dòng)相為乙腈-水（80∶20），紫外檢測波長為203 nm。該方法精密度良好，樣品測定穩(wěn)定性好，回收率高。提出了超聲輔助復(fù)配酶解法的清潔生產(chǎn)技術(shù)，在復(fù)配酶解工藝中，酶解溫度對皂素得率的影響最大，最佳酶水解條件是酶解時(shí)間為48 h，酶添加量為物料的8%，酶解pH為6.0，水解溫度為50 ℃，薯蕷皂素的得率為0.524 9%。采用超聲破碎輔助復(fù)配酶解法提取薯蕷皂素，比直接酶解法得率提高了25%，接近酸解法的得率，應(yīng)用潛力大。

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