生姜活性提取物對(duì)銅綠假單胞菌的抑制機(jī)理研究

楊楠　王靜　余友恒

摘要[目的]探究生姜的活性提取物對(duì)銅綠假單胞菌抑制作用的機(jī)理。[方法]采用有機(jī)溶劑浸提法提取生姜中的活性物質(zhì)，探討生姜在不同條件下的活性提取物對(duì)銅綠假單胞菌的抑制效果及抑菌機(jī)理。[結(jié)果]生姜提取物對(duì)銅綠假單胞菌有明顯的抑制作用，且生姜提取物的穩(wěn)定性較好，不同因素處理下仍具有較強(qiáng)的抑菌性。通過(guò)對(duì)微生物的生長(zhǎng)曲線和電導(dǎo)率的測(cè)定，進(jìn)一步證明生姜的活性提取物抑制了銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)。[結(jié)論]生姜的活性提取物對(duì)銅綠假單胞菌有較好的抑制作用。

關(guān)鍵詞生姜；活性提取物；銅綠假單胞菌；抑菌作用；機(jī)理

中圖分類號(hào)S632.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）20-0095-03

Abstract[Objective] The research aimed to study the mechanism of the inhibitory effect of the active extract of Zingiber officinale Roscoe on Pseudomonas aeruginosa. [Method] The effective components of Zingiber officinale Roscoe were extracted by organic solvent extraction，the antibacterial activities and mechanism of Zingiber officinale Roscoe against Pseudomonas aeruginosa in different condition were discussed.[Result]The active extract of Zingiber officinale Roscoe had obvious inhibitory effect on Pseudomonas aeruginosa，and the stability of extract was good.The inhibitory effects of Zingiber officinale Roscoe still had a strong antiseptic power after various treatments.Through the determination of bacterial growth curve and electric conductivity， it was further proved that the active extract of Zingiber officinale Roscoe inhibited the growth of Pseudomonas aeruginosa.[Conclusion] Zingiber officinale Roscoe had better antibacterial effect on Pseudomonas aeruginosa.

Key wordsZingiber officinale Roscoe； Active extracts；Pseudomonas aeruginosa；Antimicrobial activity；Mechanism

姜是姜科植物姜（Zingiber officinale Roscoe）的根莖，是日常生活中常見(jiàn)的香辛調(diào)味料。生姜是一種廣泛應(yīng)用的藥食兩用植物，作為傳統(tǒng)中藥廣泛應(yīng)用于臨床?，F(xiàn)代研究表明，生姜具有抗氧化、抗炎、保護(hù)心血管、降血糖、降低膽固醇以及抗腫瘤的作用[1]。對(duì)于生姜的化學(xué)成分研究已有報(bào)道[2-5]，姜的化學(xué)成分復(fù)雜，已發(fā)現(xiàn)的有100多種，可歸屬為揮發(fā)油、姜辣素、二苯基庚烷三大類。姜辣素和二苯基庚烷具有較強(qiáng)的防腐及抗氧化作用，有研究表明，生姜提取物對(duì)多種微生物有明顯抑制作用[6-8]。這些研究對(duì)于食品行業(yè)中天然防腐劑的開(kāi)發(fā)具有重要意義。筆者以水產(chǎn)品中典型的腐敗菌銅綠假單胞菌為檢驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)測(cè)定不同溫度、有機(jī)試劑及pH對(duì)生姜提取物穩(wěn)定性的影響來(lái)探討生姜抑菌作用的穩(wěn)定性，并通過(guò)測(cè)定生姜提取物處理過(guò)的銅綠假單胞菌前后的生長(zhǎng)曲線及電導(dǎo)率來(lái)初探生姜提取物的抑菌機(jī)理。

1材料與方法

1.1材料與試劑

生姜（新鮮生姜購(gòu)于遼寧大連市場(chǎng)）；銅綠假單胞菌（來(lái)自大連民族大學(xué)食品安全實(shí)驗(yàn)室）；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂，均為生化試劑；NaCl（AR級(jí)）、HCl（AR級(jí)）、NaOH（AR級(jí)）、無(wú)水乙醇（AR級(jí)）、甲醇（AR級(jí)）、丙酮（AR級(jí)）、乙腈（AR級(jí)）。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基按參考文獻(xiàn)[9]自制。

1.2儀器與設(shè)備

CJ-1680超凈工作臺(tái)、HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋、JA-2003型電子天平、ZK-027型恒溫干燥箱、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、XA-1型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、立式壓力蒸汽滅菌器、UV-2550紫外分光光度計(jì)、搖床以及實(shí)驗(yàn)室其他常規(guī)儀器。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1生姜活性物質(zhì)的提取。

生姜，洗凈，用刀切成5 mm左右薄片，放入恒溫干燥箱中。在80 ℃下烘干6～8 h，再用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)將姜粉碎。參考范紫煊[10]的方法，稱取100 g 姜粉，以1∶2∶8的比例放入姜粉、無(wú)水乙醇和無(wú)菌水進(jìn)行浸泡，充分?jǐn)噭?，置于水浴鍋上，溫度?0 ℃，浸泡6 h以上。浸泡后，趁熱緩慢分離出上清液，進(jìn)行抽濾。將抽濾液裝入圓底燒瓶，并連接好減壓回收裝置，將圓底燒瓶置于恒溫水浴鍋中，減壓回收乙醇。最初瓶?jī)?nèi)劇烈沸騰，等到蒸餾緩慢進(jìn)行，冷凝液也漸漸減少，則停止加熱，取下圓底燒瓶。將生姜提取物用保鮮膜包裹，防止其成分的揮發(fā)。

1.3.2抑菌效力試驗(yàn)。采用牛津杯法[11]，即將適量銅綠假單胞菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，過(guò)夜振搖培養(yǎng)（37 ℃，100 r/min）；再將50 μL過(guò)夜培養(yǎng)物接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，振搖培養(yǎng)（37 ℃，100 r/min）6 h，得到銅綠假單胞菌。

融化后的牛肉膏蛋白胨營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，冷卻凝固后加入菌懸液，用玻璃涂布棒均勻涂在培養(yǎng)基表面，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)15 min，使瓊脂表面干燥待用。用無(wú)菌鑷子將牛津杯（直徑9 mm）置于含菌培養(yǎng)皿（每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)2個(gè)牛津杯）中，每個(gè)牛津杯內(nèi)加樣150 μL，以生理鹽水（以CK表示）為陰性對(duì)照。將培養(yǎng)皿置于37 ℃培養(yǎng)24 h，取出后測(cè)其抑菌圈直徑大小。以上操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

1.3.3不同濃度生姜活性提取物對(duì)抑菌效果的影響。

根據(jù)抑菌圈測(cè)定結(jié)果，采用瓊脂打孔法測(cè)定樣品MIC。于超凈工作臺(tái)內(nèi)，向每個(gè)滅菌培養(yǎng)皿中傾注10～15 mL的高壓滅菌過(guò)的牛肉膏蛋白胨進(jìn)行鋪底，每個(gè)培養(yǎng)皿厚度均勻，待瓊脂冷卻凝固后，備用。吸取200～300 μL銅綠假單胞菌菌液加入到冷卻后的培養(yǎng)基中，用鑷子夾取牛津杯放在制好的抑菌圈培養(yǎng)皿內(nèi)，并在培養(yǎng)皿上做好標(biāo)記。每個(gè)牛津杯內(nèi)分別加樣150 μL，同時(shí)設(shè)立滅菌水為空白對(duì)照。將培養(yǎng)皿移入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在接下來(lái)的6～12 h內(nèi)觀察菌體的生長(zhǎng)情況。重復(fù)3個(gè)平板。

1.3.4熱穩(wěn)定性試驗(yàn)。

將質(zhì)量濃度為2.00%的生姜活性提取物溶液分成不同的組分，在20、40、60、80、100和120 ℃ 6個(gè)水浴溫度下處理20 min，采用牛津杯法觀察溫度對(duì)生姜活性提取物抑菌活性的影響。重復(fù)3個(gè)平板。

1.3.5不同有機(jī)試劑對(duì)生姜活性提取物抑菌效果的影響。

分別用甲醇、丙酮、乙腈和乙醇處理質(zhì)量濃度為2.00%的生姜活性提取物溶液1 h，同樣采用牛津杯法觀察不同有機(jī)試劑對(duì)生姜活性提取物抑菌活性的影響。重復(fù)3個(gè)平板。

1.3.6不同pH對(duì)生姜活性提取物抑菌效果的影響。

將質(zhì)量濃度為2.00%的生姜活性提取物溶液分成不同的組分，用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)配成6個(gè)pH區(qū)間（3～4、4～5、5～6、6～7、7～8和8～9），采用牛津杯法觀察pH對(duì)生姜活性提取物抑菌活性的影響。重復(fù)3個(gè)平板。

1.3.7細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。

將適量銅綠假單胞菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，過(guò)夜振搖培養(yǎng)（37 ℃，160 r/min）。再將50 μL過(guò)夜培養(yǎng)物接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，振搖培養(yǎng)（37 ℃，100 r/min）12 h，得到銅綠假單胞菌。取少量假單胞菌過(guò)夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，加入生姜提取物使其終濃度為2%，于30 ℃、160 r/min搖床振搖培養(yǎng)。于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h分別取樣，在600 nm處測(cè)定其吸光值。

1.3.8菌液電導(dǎo)率的測(cè)定。

取少量培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的銅綠假單胞菌，向其中加入生姜提取物使其濃度為2.00%，于37 ℃、160 r/min搖床振搖培養(yǎng)。參考李婷婷等[12]的方法，在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h分別取樣測(cè)定培養(yǎng)液的電導(dǎo)率，確定金屬離子滲出的變化趨勢(shì)。

2結(jié)果與分析

2.1抑菌效力試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果表明，生姜提取物對(duì)銅綠假單胞菌有很強(qiáng)的抑制作用。當(dāng)生姜提取物質(zhì)量濃度高于0.25%時(shí)，對(duì)銅綠假單胞菌有抑菌效果，生姜提取物質(zhì)量濃度為0.25%～2.00%時(shí)，抑菌圈直徑逐漸增大；當(dāng)生姜提取物質(zhì)量濃度為4.00%時(shí)，其抑菌效果最明顯，抑菌圈直徑為20.3 mm。

2.2熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

由圖1可知，生姜的活性提取物經(jīng)6種溫度處理15 min后，抑菌效力并未受較大影響。與常溫對(duì)照組相比，40 ℃的抑菌圈達(dá)到最大，表明此溫度下的抑菌效力最好。而隨著溫度的升高，抑菌圈有不同程度的減小，溫度為120 ℃時(shí)，抑菌效力最差。60～120 ℃各個(gè)溫度條件下抑菌圈直徑無(wú)明顯變化，可見(jiàn)不同溫度對(duì)生姜活性提取物的處理不影響其中有效成分的抑菌活性。說(shuō)明生姜活性提取物的熱穩(wěn)定性較好。

2.3有機(jī)試劑對(duì)生姜提取物抑菌效力的影響

由圖2可知，分別經(jīng)甲醇、丙酮、乙腈和乙醇處理過(guò)的生姜活性提取物，除乙醇處理后抑菌圈增大較多，其余3種有機(jī)溶劑的抑菌效力均比較穩(wěn)定?？梢?jiàn)，生姜提取物不受有機(jī)試劑的影響，穩(wěn)定性良好。

2.4pH對(duì)生姜提取物抑菌效力的影響由試驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)pH在5～6、6～7、7～8、8～9，生姜活性提取物的抑菌能力具有一定的穩(wěn)定性，抑菌圈直徑保持在14.9～15.3 mm；而在酸性（pH為3.0）條件下，抑菌效力達(dá)到最大，抑菌圈直徑達(dá)15.9 mm，但不排除因過(guò)酸條件下鹽酸抑制銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)。

2.5細(xì)菌生長(zhǎng)曲線

菌液的光密度值（OD值）可以用來(lái)衡量菌液中細(xì)菌數(shù)目的多少，且菌懸液的濃度與其吸光值成正比。因此，OD值變化可以反映生姜提取物對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用。由圖3可知，經(jīng)生姜提取物處理的試驗(yàn)組的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線與正常培養(yǎng)的對(duì)照組存在明顯差異；且對(duì)照組中銅綠假單胞菌在12 h進(jìn)入穩(wěn)定期，而生姜處理組因細(xì)菌受到抑制，其生長(zhǎng)緩慢，在18 h才進(jìn)入穩(wěn)定期，表明生姜提取物能有效抑制銅綠假單胞菌菌體生長(zhǎng)繁殖。

2.6菌液電導(dǎo)率的測(cè)定

細(xì)菌細(xì)胞膜是細(xì)菌的保護(hù)屏障。當(dāng)細(xì)菌遇到不利生長(zhǎng)條件或者抑菌劑作用時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞膜會(huì)遭到破壞，喪失其半透性且流動(dòng)性降低，進(jìn)而菌體的保護(hù)屏障被打破，內(nèi)部電解質(zhì)（如K+）大量滲入至培養(yǎng)液，導(dǎo)致培養(yǎng)液的電導(dǎo)率的改變。因此，菌液電導(dǎo)率的變化反映了細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的變化情況[13]。

由圖4可知，當(dāng)銅綠假單胞菌培養(yǎng)液經(jīng)生姜提取物處理過(guò)后，其電導(dǎo)率明顯高于未處理的對(duì)照組，說(shuō)明在生姜活性提取物的存在下使細(xì)胞膜遭到破壞，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜流動(dòng)性降低，通透性增大，從而大量電解質(zhì)外滲。

3結(jié)論與討論

該試驗(yàn)采用有機(jī)溶劑浸提法提取生姜活性成分，并用涂布平板法來(lái)進(jìn)行銅綠假單胞菌菌落的培養(yǎng)。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生姜活性提取物對(duì)銅綠假單胞菌有明顯的抑制作用，當(dāng)生姜提取物質(zhì)量濃度高于0.25%時(shí)，對(duì)銅綠假單胞菌有抑菌效果，而且經(jīng)溫度、有機(jī)試劑和pH等處理后仍具有抑菌效力，

表明生姜活性提取物具有較好的穩(wěn)定性。

生姜提取物對(duì)銅綠假單胞菌生長(zhǎng)曲線的影響顯示，銅綠假單胞菌生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)，對(duì)照組OD值明顯高于處理組OD值，且對(duì)照組中銅綠假單胞菌在12 h進(jìn)入穩(wěn)定期，而生姜處理組因細(xì)菌受到抑制，生長(zhǎng)緩慢，在18 h才進(jìn)入穩(wěn)定期，表明生姜提取物對(duì)銅綠假單胞菌菌體生長(zhǎng)繁殖有抑制作用。

菌液電導(dǎo)率的結(jié)果顯示，處理組經(jīng)生姜提取物處理過(guò)的銅綠假單胞菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率明顯高于未經(jīng)生姜提取物處理的對(duì)照組，說(shuō)明生姜的活性提取物對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜有破壞作用，使其通透性增大，大量電解質(zhì)外泄。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果初步得出，生姜活性提取物對(duì)銅綠假單胞菌有較強(qiáng)的抑制作用，并且穩(wěn)定性良好。生姜提取液可能通過(guò)破壞銅綠假單胞菌的細(xì)胞壁，改變細(xì)胞膜的通透性，從而抑制其繁殖。

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