利用不同分子標(biāo)記分析煙草種質(zhì)資源多態(tài)性

馮吉　程玲　孫光偉　陳振國　蔡長春

摘要 [目的]研究煙草種質(zhì)資源的遺傳多樣性及親緣關(guān)系。[方法]利用SSR、EST-SSR和InDel這3種分子標(biāo)記對53份不同類型的煙草材料進(jìn)行區(qū)別與鑒定。[結(jié)果]53份煙草材料可分為2大類群，2個亞類；與EST-SSR和SSR分子標(biāo)記相比，InDel分子標(biāo)記以其擴(kuò)增譜帶少、特異性強(qiáng)，易于識別和統(tǒng)計，更適合用于煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性分析與研究。[結(jié)論]該研究能夠較好地揭示煙草栽培品種類型間的遺傳多樣性與親緣關(guān)系，可為煙草種質(zhì)鑒定和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 煙草；分子標(biāo)記；遺傳多樣性

中圖分類號 S188 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）29-0139-05

Analysis of Genetic Diversity in Tobacco Germplasms （Nicotiana tabacum L.） Using Different Molecular Markers

FENG Ji， CHENG Ling， SUN Guangwei， CAI Changchun* et al

（Tobacco Research Institute of Hubei Province， Wuhan， Hubei 430030）

Abstract [Objective]To research genetic diversity and relationship in tobacco germplasms.[Method] 53 tobacco materials were distinguished and identified by SSR， ESTSSR and InDel. [Result]53 tobacco materials could be classified into two groups and two subgroups.Compared with the ESTSSR and SSR molecular marker， it was less amplification band， strong specificity， easy identification and statistics for InDel marker. Therefore， InDel molecular marker was more suitable for genetic diversity analysis and research of tobacco germplasm.

[Conclusion]The study is useful in revealing the genetic diversity and relationships among tobacco materials， and providing a scientific basis for the germplasm identification and genetic linkage mapping.

Key words Tobacco；Molecular markers；Genetic diversity

基金項(xiàng)目 中國煙草總公司湖北省公司重點(diǎn)項(xiàng)目（027Y2016-002）。

作者簡介 馮吉（1981—），男，湖北武漢人，農(nóng)藝師，博士，從事分子生物學(xué)、生物信息學(xué)研究。

*通訊作者，副研究員，博士，從事分子生物學(xué)研究。

收稿日期 2017-08-11

烤煙是我國主要的經(jīng)濟(jì)作物之一，其種植面積較大，是卷煙工業(yè)重要的基礎(chǔ)原料 [1]。但是用于煙草品系選育的材料遺傳背景狹窄，且育種周期長和工作效率低制約著傳統(tǒng)育種工作的進(jìn)度，造成我國目前煙草育種創(chuàng)新能力較差[2]。因此，拓寬煙草栽培品種遺傳背景和優(yōu)化煙草育種選擇程序是今后高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗煙草新品種育種工作的關(guān)鍵。分子生物學(xué)的發(fā)展及分子標(biāo)記技術(shù)的建立為煙草育種工作提供了可量化、不受環(huán)境影響的標(biāo)準(zhǔn)方法，越來越多地被應(yīng)用到煙草種質(zhì)鑒定工作中。SSR、TRAP、AFLP等分子標(biāo)記具有結(jié)果可靠、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富、操作簡單等特點(diǎn)，已被應(yīng)用

于煙草種質(zhì)鑒定中[2-7]。該研究利用已公布的煙草SSR標(biāo)

記，EST-SSR標(biāo)記以及自主開發(fā)的InDel標(biāo)記對53份煙草種質(zhì)資源的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，為煙草種質(zhì)資源鑒定和遺傳育種研究提供新的分子標(biāo)記，并為拓寬煙草育種遺傳基礎(chǔ)以及煙草種質(zhì)資源的研究和利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 不同分子標(biāo)記

1.1.1 EST-SSR引物對序列。選取多態(tài)性較好的16對引物對[8]，引物對序列見表1。

1.1.2 SSR引物對序列。選取多態(tài)性較好的20對引物對[9]，引物對序列見表2。

1.1.3 InDel引物對序列。隨機(jī)選擇并開發(fā)出45對引物對，引物對序列見表3。

1.2 材料

試驗(yàn)材料以烤煙為主，并適當(dāng)選取其他材料，共計53份。其中烤煙33份，白肋煙15份，曬煙3份，香料煙2

1.3 方法

1.3.1 CTAB小樣法提取DNA。

選取53份煙草種質(zhì)資源材料的鮮嫩葉片，DNA提取方法參考CTAB 方法[2-7]。

1.3.2 PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系含模板DNA 2 μL，BioTeke的2×power Taq PCR MasterMix（PR1701）5 μL，正向和反向引物（50 ng/μL）各1.5 μL，總體積10 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火溫度（50～62 ℃）30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。在TP600梯度PCR儀（TaKaRa，日本）上進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.3.3 多態(tài)性引物的篩選。

對53份煙草材料初步篩選InDel，EST-SSR和SSR引物對；選擇電泳條帶清晰且穩(wěn)定、多態(tài)性豐富的引物對進(jìn)行DNA擴(kuò)增。

1.3.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物均用聚丙烯酰胺凝膠（6%）進(jìn)行電泳分離，電泳所用儀器為Sequi-Gen sequencing cell（BioRad，USA），緩沖液為0.5×TBE。電泳時先用恒定功率100 W 預(yù)電泳30 min 左右（玻璃板面溫度約為50 ℃），上樣后，用恒定功率80 W 電泳1.0～1.5 h，快速顯影方法進(jìn)行電泳后的染色與顯影。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理。

統(tǒng)計數(shù)據(jù)時，InDel，EST-SSR和SSR多態(tài)性定義為在擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳帶型的某一相同遷移位置上，品種某一條帶的有或無，每1個多態(tài)性條帶記作1個等位基因（假定相同遷移率的條帶均來自同一位點(diǎn)上的同一等位基因）。將電泳圖譜上清晰出現(xiàn)的條帶記為“1”，同一位置無帶記為“0”，不清楚難以判斷的帶記為“.”或“-”，獲得“0”和“1”組成的數(shù)字矩陣。

1.3.6 遺傳多樣性分析和聚類樹的繪制。

將53個煙草種質(zhì)資源材料的分子標(biāo)記數(shù)據(jù)按要求制成表格，并采用聚類軟件NTSYS計算遺傳相似性系數(shù)，然后根據(jù)遺傳相似性系數(shù)進(jìn)行類平均法（UPGMA，unweighted pair group method arithmetic averages）聚類，形成數(shù)字矩陣，繪出聚類樹，形成種質(zhì)資源的分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 InDel分子標(biāo)記的開發(fā)

利用B37（紅）和B37（白）的重測序數(shù)據(jù)[9]，與已發(fā)表的K326和TN90數(shù)據(jù)[10-11]進(jìn)行生物信息分析，預(yù)測得到353 349個InDel位點(diǎn)。通過InDel標(biāo)記建立矩陣，利用矩陣分析樣本之間的多態(tài)性，參考前人研究篩選參數(shù)[12]：插入/缺失堿基數(shù)為5～15 bp、插入/缺失變異率（變異率=同類插入/缺失占重測序總樣品量的百分比）為30%～70%的InDel位點(diǎn)，最終隨機(jī)選擇并設(shè)計出具有代表性InDel引物45對。

2.2 煙草InDel，EST-SSR和SSR的多態(tài)性檢測

2.2.1 InDel分子標(biāo)記的多態(tài)性檢測。

用45對InDel引物對53份煙草種質(zhì)資源材料進(jìn)行多態(tài)性檢測，其中只有20對InDel引物多態(tài)性檢測能力較強(qiáng)，多態(tài)性比例為44.44%。利用這20對InDel引物在53份煙草材料中發(fā)現(xiàn)清晰、穩(wěn)定并可重復(fù)的40個多態(tài)性位點(diǎn)，每對引物能得到2條多態(tài)性條帶。部分InDel引物對煙草材料的擴(kuò)增電泳圖譜見圖1。

2.2.2 EST-SSR分子標(biāo)記的多態(tài)性檢測。

用16對EST-SSR引物對53份煙草種質(zhì)資源材料進(jìn)行多態(tài)性檢測，其中只有9對EST-SSR引物多態(tài)性檢測能力較強(qiáng)，多態(tài)性比例為56.25%。利用這9對EST-SSR引物在53份煙草材料中發(fā)現(xiàn)清晰、穩(wěn)定并可重復(fù)的33個多態(tài)性位點(diǎn)，每對引物能得到2～6條多態(tài)性條帶，平均為4條。部分EST-SSR引物對煙草材料的擴(kuò)增電泳圖譜見圖2。

2.2.3 SSR分子標(biāo)記的多態(tài)性檢測。

用20對SSR引物對53份煙草種質(zhì)資源材料進(jìn)行多態(tài)性檢測，其中只有15對SSR引物多態(tài)性檢測能力較強(qiáng)，多態(tài)性比例為75.00%。利用這15對SSR引物在53份煙草材料中發(fā)現(xiàn)清晰、穩(wěn)定并可重復(fù)的70個多態(tài)性位點(diǎn)，每對引物能得到2～9條多態(tài)性條帶，平均為5條。部分SSR引物對煙草材料的擴(kuò)增電泳圖譜見圖3。

2.3 煙草遺傳多樣性分析和聚類樹的繪制

利用NTSYS軟件計算種質(zhì)資源的遺傳相似性系數(shù)。53份材料的遺傳相似性系數(shù)為0.37～0.97，平均為0.75。說明53份煙草種質(zhì)資源的遺傳多樣性較低，遺傳背景變異較少?；谶z傳相似性系數(shù)，進(jìn)一步對53份材料進(jìn)行聚類分析，繪制了UPGMA聚類圖（圖4）。在遺傳相似性系數(shù)為0.48時，53份材料被分為2類群。其中第一類群為所有晾曬煙材料（包含白肋

煙、曬煙和香料煙）和部分烤煙材料，第二類群為烤煙材料。

第一類群在遺傳相似性系數(shù)為0.53 處，又可分為2亞類。第1亞類為大部分的白肋煙材料和部分烤煙材料，第2亞類為全部曬煙、香料煙、部分烤煙以及部分白肋煙材料。

以上結(jié)果可以說明：分子標(biāo)記技術(shù)在煙草資源遺傳親緣關(guān)系分析中的高效性；晾曬煙種質(zhì)資源材料與烤煙種質(zhì)資源材料遺傳親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，而不同晾曬煙種質(zhì)資源材料之間（包含白肋煙、曬煙、香料煙）的遺傳親緣關(guān)系很近。

3 結(jié)論與討論

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展及分子標(biāo)記技術(shù)的建立，越來越多的分子標(biāo)記被應(yīng)用到煙草種質(zhì)鑒定、遺傳圖譜的構(gòu)建、抗病性研究等工作中[2-7，9]。該研究中SSR、EST-SSR和InDel這3種分子標(biāo)記多態(tài)性豐富，穩(wěn)定性強(qiáng)，試驗(yàn)條件較易掌握，都是很好的煙草遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記方法。但是與EST-SSR和SSR分子標(biāo)記相比，InDel分子標(biāo)記以其擴(kuò)增譜帶少、特異性強(qiáng)，易于識別和統(tǒng)計，因而更適合用于煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性分析與研究。

遺傳多樣性對物種的生存和發(fā)展起著決定性的作用，遺傳多樣性高，對環(huán)境變化的適應(yīng)能力強(qiáng)，容易擴(kuò)展其分布范圍并孕育成新的品種，因此對遺傳多樣性的研究，可以探討物種之間的親緣關(guān)系，同時還有助于充分發(fā)現(xiàn)和利用各種基因資源，挖掘重要經(jīng)濟(jì)性狀的變異并加以科學(xué)利用和開發(fā)。煙草傳入我國已有400 多年時間，雖然經(jīng)過400多年的人工馴化和培養(yǎng)以及不斷地從國外引進(jìn)已經(jīng)形成的品種資源，但是近年煙草育種中廣泛使用的主體親本只有少數(shù)幾種，導(dǎo)致我國育成煙草品種遺傳基礎(chǔ)日益狹窄[13-14]，該研究結(jié)果也從分子水平上印證了我國煙草育種資源的匱乏。該研究還發(fā)現(xiàn)相同栽培類型的煙草明顯地聚為一類，說明煙草經(jīng)過各自的生態(tài)環(huán)境和人為利用目的不同的長期選擇而逐漸形成了不同的栽培類型，類型間的差別更多的是因特定生態(tài)條件下次生代謝的不同而形成。同時，還發(fā)現(xiàn)個別煙草材料偏離原有類型，與其他類型聚為一類，原因一可能是與其血緣關(guān)系有關(guān)，二可能是與分子標(biāo)記的偏好有關(guān)。

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