解淀粉芽胞桿菌的GFP標記及定殖能力

薛松 汪軍 王國芬 楊臘英 丁兆建 周游 黃俊生

摘 要 采用改良的海藻糖電轉化法獲得GFP標記菌株X5-GFP、BQA2-GFP，顯微鏡觀察標記菌株在土壤和水培中的番茄根際的定殖情況。結果表明：標記菌株單獨或與青枯菌先后加入進行處理，番茄根際標記菌株的種群數量變化趨勢都是一致的。在土壤番茄根際中，X5-GFP單獨處理后當天的菌量為1.05×106 CFU/g，隨之菌量逐漸下降；處理30 d后，為1.50×103 CFU/g；而BQA2-GFP單獨處理后當天菌量為1.68×106 CFU/g，隨之菌量也逐漸下降；處理30 d后，為2.50×103 CFU/g；在水培番茄根際中，X5-GFP單獨處理后當天的菌量為2.70×105 CFU/g，隨之菌量逐漸下降；處理30 d后，為1.00×103 CFU/g；而BQA2-GFP單獨處理后當天菌量為3.60×105 CFU/g，隨之菌量同樣逐漸下降；處理30 d后，為1.50×103 CFU/g。這表明解淀粉芽胞桿菌X5、BQA2均在番茄根際有較強的定殖能力。

關鍵詞 解淀粉芽胞桿菌；綠色熒光蛋白；定殖

中圖分類號 S432 文獻標識碼 A

Abstract In this study， green fluorescent protein tagged strains X5 and BQA2 were obtained by improvement in electroporation transformation efficiency of gene for Bacillus amyloliquefaciens with trehalose. X5-GFP and BQA2-GFP colonization in the rhizosphere of tomato were observed by microscope. The experimental results indicated that changing tendency of population quantity in marking strains of tomato rhizosphere was consistent after dealing with individual marking strains or adding Ralstonia solanacearum successively. In the soil， the population of X5-GFP on the roots of tomato reached 1.05×106 CFU/g after inoculating X5-GFP alone， and then decreased 30 days later， eventually remained at 1.50×103 CFU/g. The population of BQA2-GFP on the roots of tomato reached 1.68×106 CFU/g after inoculating BQA2-GFP alone， and then decreased 30 days later， eventually remained at 2.50×103 CFU/g. In Hydroponics， the population of X5-GFP on the roots of tomato reached 2.70×105 CFU/g after inoculating X5-GFP alone， and then decreased 30 days later， eventually remained at 1.00×103 CFU/g. The population of BQA2-GFP on the roots of tomato reached 3.60×105 CFU/g after inoculating BQA2-GFP alone， and then decreased 30 days later， eventually remained at 1.50×103 CFU/g. The results showed that B. amyloliquefaciens X5 and B. amyloliquefaciens BQA2 displayed good colonization ability in the rhizosphere of tomato.

Key words Bacillus amyloliquefaciens； green fluorescent protein； colonization

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.03.026

由于人們對糧食質量安全要求的提高，綠色環(huán)保糧食已經受到人們的青睞。在生產綠色環(huán)保糧食過程中，生物防治由于其環(huán)保、低毒等優(yōu)點受到了廣泛的關注[1]。據報道，生防菌在植物上的定殖能力和病害防治效果緊密相關[2-3]，有關研究也成為目前生防菌研究領域的熱點之一[4-5]。很多標記方法被開發(fā)用于標記目標微生物，使其與其它微生物區(qū)別開來，以闡明生防菌的定殖能力?？股貥擞涀鳛樽钤缡褂玫臉擞浄椒?，主要有硫酸鏈霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氨芐青霉素等標記法[6-7]，但抗生素標記法不能區(qū)別出對標記抗生素有同樣抗性的其它微生物。隨著標記基因技術的不斷進步，由于綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein， GFP）具有易于檢測、靈敏度高、穩(wěn)定性較好、構建載體方便、對宿主細胞無毒害作用、不受假陽性干擾、廣譜性等優(yōu)點，現已成為探究目標微生物與寄主植物相互作用的重要工具[8]。劉郵洲等[9]將GFP轉到枯草芽胞桿菌PTS-394中，標記菌株PTS-GFP與野生菌株PTS-394在生長性狀和平板抑菌效果等方面基本相同。楊秀榮等[10]用GFP標記生防細菌 B579，結果表明標記菌株B579-gfp可在黃瓜根部大量定殖并形成生物膜狀。Cao等[11]發(fā)現枯草芽胞桿菌SQR 9能使黃瓜枯萎病的發(fā)病率降低49%～61%，同時發(fā)現GFP轉化的枯草芽胞桿菌SQR 9在黃瓜根部的定殖數量能達到106 CFU/g，這說明枯草芽胞桿菌SQR 9能很好的防控黃瓜枯萎病。Gao等[12]用GFP標記Bacillus subtilis 168和它的2株衍生菌OKB105、OKBHF（菌株OKB105和OKBHF能產生脂肽物質），將他們接種至番茄根部，結果發(fā)現OKB105、OKBHF這2個菌株在番茄根部的定殖數量是B. subtilis 168菌株定殖數量的2～3倍。這說明枯草芽胞桿菌可能通過脂肽物質的產生來提高定殖效率，從而促進植物生長。Yuan等[13]發(fā)現解淀粉芽胞桿菌YL-25能有效防控香蕉枯萎病的發(fā)生，同時也能促進植物生長。

在前期，本實驗室從香蕉根際分離到2株解淀粉芽胞桿菌X5和BQA2，它們對番茄青枯病菌（Ralstonia solanacearum）和香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）具有較強的拮抗作用。為了深入研究解淀粉芽胞桿菌X5和BQA2在植物上的定殖能力，本研究對他們進行GFP標記，并通過顯微鏡觀察X5-GFP和BQA2-GFP在番茄根部定殖數量的變化，為將來開發(fā)利用解淀粉芽胞桿菌X5和BQA2作為生防菌奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）X5和BQA2及番茄青枯病菌（Ralstonia solanacearum）R4、香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum）FOC-B2均由中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所微生物資源研究與利用研究室提供。

TTC瓊脂培養(yǎng)基：0.1%酸水解酪蛋白1 g、蛋白胨10 g、葡萄糖5 g、瓊脂17 g、蒸餾水1 000 mL（1%氯化三苯基四氮唑鹽酸鹽（TTC）在使用前待滅菌的基礎培養(yǎng)基冷卻至55 ℃時再加入）。PDA培養(yǎng)基： 馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL。LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL。電擊洗液：海藻糖0.5 mol/L、山梨醇0.5 mol/L、甘露醇0.5 mol/L、甘油10%?；謴鸵海悍謩e含0.5 mol/L海藻糖、0.5 mol/L山梨醇、0.38 mol/L甘露醇的LB。

番茄品種：櫻桃番茄京丹1號品種，由中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所微生物資源研究與利用研究室提供。

試劑：海藻糖從北京索萊寶科技有限公司購買，Taq DNA聚合酶從寶生物工程（大連）有限公司購買。帶有綠色熒光蛋白標記的表達載體P101-P4322由中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所微生物資源研究與利用研究室提供。引物合成和基因測序由上海生工生物工程技術服務有限公司來完成。

1.2 方法

1.2.1 解淀粉芽胞桿菌X5和BQA2的盆栽實驗

將長出20片真葉的番茄苗移栽至裝有滅菌土壤的盆缽中，每盆1株，設置8個重復。本實驗共設置3個處理組：（1）加入5 mL解淀粉芽胞桿菌X5菌液（菌液濃度為108 CFU/mL）和5 mL青枯菌R4菌液（菌液濃度為108 CFU/mL）；（2）加入5 mL解淀粉芽胞桿菌BQA2菌液（菌液濃度為108 CFU/mL）和5 mL青枯菌R4菌液（菌液濃度為108 CFU/mL）；（3）加入5 mL的滅菌水和5 mL青枯菌R4菌液（菌液濃度為108 CFU/mL）；

分別在移栽后7、15、30 d調查番茄苗的發(fā)病情況。病情指數分級標準：0級為番茄苗無萎蔫癥狀；1級為番茄苗葉片≤25%萎蔫；2級為番茄苗葉片26%～50%萎蔫；3級為番茄苗葉片51%～75%萎蔫；4級為番茄苗葉片76%～100%萎蔫或者死亡。

病情指數=×100

防治效果=×100%

1.2.2 解淀粉芽胞桿菌X5和BQA2的GFP標記

從解淀粉芽胞桿菌X5、BQA2的平板中挑取單菌落，接接至LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、170 r/min過夜培養(yǎng)，待菌液OD600為2.0時停止培養(yǎng)，將菌液冰浴10 min后，再于4 ℃、5 000 r/min離心6 min。用預冷的電擊洗液沖洗菌體之后，在4 ℃、5 000 r/min離心10 min，共洗滌4次。最后用500 μL電擊洗液懸浮菌體，則得到X5和BQA2的感受態(tài)細胞。

電轉化時取60 μL的感受態(tài)細胞與1 μL質粒（190.6 ng/μL）混勻后轉入到冰置電擊杯（1 mm電擊縫隙）中，冰浴8 min后進行電擊，電擊條件是2.6 kV/mm，電擊1次，電擊時間為4.5 ms。電擊后立即加入1 mL恢復液（LB含0.5 mol/L海藻糖、0.5 mol/L山梨醇、0.38 mol/L甘露醇），于37 ℃、100 r/min孵育3 h后，涂布于含有20 μg/mL四環(huán)素的LB平板上，過夜37 ℃倒置培養(yǎng)觀察轉化子。利用primer5.0軟件設計gfp基因的特異性引物，W3：ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGG，W16：AAAGAATTCCTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATG。

1.2.3 X5-GFP和BQA2-GFP生長特性 將X5-GFP和BQA2-GFP的單菌落接種至30 mL含40 μg/mL四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、170 r/min培養(yǎng)過夜。取100 μL培養(yǎng)過夜的菌液接種至60 mL含40 μg/mL四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、170 r/min培養(yǎng)過夜。用野生菌株 X5、BQA2作為對照，在相同的處理下進行培養(yǎng)，每2 h測量菌液OD600值1次，從而得到X5、BQA2和X5-GFP、BQA2-GFP 的生長特性。

1.2.4 X5-GFP和BQA2-GFP的平板拮抗性能

從TTC瓊脂平板挑取青枯病菌的菌落接種至LB中，于28 ℃、190 r/min速度培養(yǎng)過夜，用無菌水稀釋至菌含量達108 CFU/mL，取稀釋后的青枯病菌液100 μL涂布至TTC瓊脂平板，用牙簽挑取X5-GFP和X5點到直徑方向左右兩側（距平板邊緣20 mm），在28 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，每次處理3個重復。設清水對照。而BQA2-GFP和BQA2作相同處理。待對照平板青枯菌長滿平板時，調查抑菌圈直徑。

挑取香蕉枯萎病菌接種至PDA液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、190 r/min速度培養(yǎng)過夜，用無菌水稀釋菌液濃度至108 CFU/mL。取稀釋后的香蕉枯萎病菌液100 μL涂布至PDA瓊脂平板，用孔徑6 mm的滅菌打孔器在直徑方向左右兩側（距平板邊緣20 mm）處各打一個孔，分別滴加X5-GFP和X5菌液20 μL，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，每次處理3個重復。設清水對照。而BQA2-GFP和BQA2作相同處理。等到對照平板香蕉枯萎病菌長滿平板的時候，測量抑菌圈的直徑。

1.2.5 X5-GFP和BQA2-GFP質粒的穩(wěn)定性測試

將X5-GFP的單菌落接種至含40 μg/mL四環(huán)素和不含四環(huán)素的20 mL液體LB培養(yǎng)基當中，于37 ℃、170 r/min培養(yǎng)過夜記為0代，隔24 h后取100 μL的過夜培養(yǎng)的菌液分別接種至含40 μg/mL四環(huán)素和不含四環(huán)素的液體LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min連續(xù)培養(yǎng)10代。每培養(yǎng)24 h后取100 μL傳代菌液涂布到不含四環(huán)素的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜后取20個單菌落接種至含有40 μg/mL四環(huán)素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后在熒光顯微鏡下統(tǒng)計發(fā)光的菌落數。而BQA2-GFP作相同處理。計算標記菌株質粒的穩(wěn)定性[14]：質粒的穩(wěn)定性=發(fā)光菌落數/20。

1.2.6 X5-GFP和BQA2-GFP番茄根際的定殖情況

將長出8片真葉的番茄苗種植至裝有滅菌土的盆缽中，每盆種植1株，設置9個重復。青枯菌R4接種前需要刺傷番茄的根部[15]。本實驗共設置3個處理組：（1）加入X5-GFP菌液3 mL；（2）先加入X5-GFP菌液3 mL，隔1 d后加入青枯菌液1 mL；（3）先加入青枯菌液1 mL，隔1 d后再加入X5-GFP菌液3 mL。BQA2-GFP同樣設上述的3個處理組。

加入X5-GFP菌液4 h后取1 g番茄根，將其磨碎后，取100 μL涂板37 ℃培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計菌落數，即為第0天X5-GFP的定殖量。隨后第2，4，6，8，10，15，30天分別取樣測定。同時，顯微鏡觀察標記菌株在番茄根際的定殖情況。BQA2-GFP定殖量的測定方法和上述方法相同。

將長出8片真葉的番茄苗種植至裝有60 mL滅菌水的錐形瓶中，每盆種植1株，設置9個重復。青枯菌R4接種前同樣需要刺傷番茄的根部[15]。處理組的設置和標記菌株定殖數量測定與觀察和上述方法相同。

1.3 數據處理

采用EXCEL2013軟件對X5、BQA2和X5-GFP、BQA2-GFP的OD600值進行處理。

2 結果與分析

2.1 解淀粉芽胞桿菌X5和BQA2的盆栽防效

解淀粉芽胞桿菌X5和BQA2的盆栽防治效果見表1。由表1可知，解淀粉芽胞桿菌X5和BQA2的盆栽防治效果分別為61.8%和80.9%，兩者都能較好的抑制青枯病的發(fā)生，經比較，解淀粉芽胞桿菌BQA2的盆栽防治效果更好。

2.2 解淀粉芽胞桿菌X5和BQA2的GFP標記

將重組質粒P101-P4322電擊轉入野生型菌株X5和BQA2中，結果發(fā)現，用熒光顯微鏡觀察標記菌株發(fā)出的綠色熒光（圖1）。

2.3 X5-GFP、BQA2-GFP的生長特性

X5和X5-GFP的生長曲線相似（圖2）。菌株的對數生長期的在培養(yǎng)后2 h，穩(wěn)定生長期是在6 h后，隨后一直較為穩(wěn)定。這表明野生菌株X5進行GFP標記后，質粒P101-P4322未對菌株X5的生長產生明顯影響。

BQA2和BQA2-GFP的生長曲線也是相似（圖3）。菌株的對數生長期是在培養(yǎng)后2 h，穩(wěn)定生長期是在培養(yǎng)10 h后，隨后也是一直較為穩(wěn)定。這同樣表明野生菌株BQA2進行GFP標記后，質粒P101-P4322未對菌株BQA2的生長產生明顯影響。

2.4 X5-GFP和BQA2-GFP的平板拮抗

與野生菌株x5和BQA2相比， X5-GFP和BQA2-GFP對番茄青枯病菌和香蕉枯萎病菌的平板抑菌活性無明顯差別（圖4）。X5和X5-GFP對番茄青枯病菌的抑菌圈的直徑為1.5 cm；X5和X5-GFP對香蕉枯萎病菌的抑菌圈的直徑為1.9 cm；BQA2對番茄青枯病菌的抑菌圈的直徑為1.7 cm；BQA2-GFP對番茄青枯病菌的抑菌圈的直徑為1.5 cm；BQA2對香蕉枯萎病菌的抑菌圈直徑為1.6 cm；BQA2-GFP對香蕉枯萎病菌的抑菌圈直徑為1.5 cm。

2.5 X5-GFP和BQA2-GFP的質粒穩(wěn)定性

菌株X5-GFP在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)4代后，質粒的穩(wěn)定性是100%，培養(yǎng)8代后質粒的穩(wěn)定性是95%，培養(yǎng)10代以后為90%；而菌株BQA2-GFP連續(xù)培養(yǎng)4代后，質粒的穩(wěn)定性是95%，培養(yǎng)8代質粒的穩(wěn)定性是85%，培養(yǎng)10代后為80%。在含四環(huán)素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)時， X5-GFP、BQA2-GFP在培養(yǎng)10代后的質粒穩(wěn)定性均為95%。結果表明，質粒P101-P4322在X5-GFP和BQA2-GFP中能夠穩(wěn)定遺傳，并且隨著連續(xù)的培養(yǎng)質粒P101-P4322的穩(wěn)定性而降低。

2.6 X5-GFP和BQA2-GFP在番茄根際的定殖情況

X5-GFP在番茄根際的定殖情況見圖5和圖6。BQA2-GFP在番茄根際的定殖情況見圖7和圖8。X5-GFP和BQA2-GFP在處理當天都能大量定殖在番茄根際；隨后標記菌株數量逐漸下降，處理30 d后，標記菌株仍有不少的菌體定殖在番茄根際。

在土壤番茄根際中，X5-GFP單獨處理后，當天的菌量為1.05×106 CFU/g；隨之菌量逐漸下降，4 d后，菌量達1.82×104 CFU/g；6 d后，菌量達1.26×104 CFU/g；8 d后為9.00×103 CFU/g；15 d后菌量為2.50×103 CFU/g；30 d后為1.50×103 CFU/g。先接種X5-GFP后接種青枯菌的處理組，當天的菌量為9.55×105 CFU/g；處理6 d，為4.27×103 CFU/g；15 d后菌量為2.00×103 CFU/g；處理30 d，為1.00×103 CFU/g；而先接種青枯菌后接種X5-GFP的處理組，當天的菌量為9.33×105 CFU/g；處理6 d，為3.89×103 CFU/g；處理30 d，為5.00×102 CFU/g。與先加入青枯病菌R4再加入X5-GFP的處理組相比，在0～6 d內，先加X5-GFP再加入青枯病菌R4的處理組，X5-GFP在番茄根部的定殖數量更高。

在水培番茄根際中，X5-GFP單獨處理后當天初始菌量為2.70×105 CFU/g；隨之菌量逐漸下降，4 d后，菌量為1.00×104 CFU/g；6 d后，菌量為7.94×103 CFU/g；8 d后菌量為7.00×103 CFU/g；15 d后菌量為2.00×103 CFU/g；30 d后菌量為為1.00×103 CFU/g。先接種X5-GFP后接種青枯菌的處理組，當天的菌量為2.19×105 CFU/g；處理4 d，菌量為8.91×103 CFU/g；處理30 d，菌量為5.00×102 CFU/g。而先接種青枯菌后接種X5-GFP的處理組，當天的菌量為2.04×105 CFU/g；處理4 d，菌量為7.94×103 CFU/g；處理30 d，菌量為5.00×102 CFU/g。與先加入青枯病菌R4再加入X5-GFP的處理組相比，在0～4 d內，先加X5-GFP再加青枯病菌R4的處理組，X5-GFP在番茄根部的定殖數量更高。

在土壤番茄根際中，BQA2-GFP單獨處理后當天初始菌量為1.68×106 CFU/g；隨之菌量也逐漸下降，4 d后，菌量為9.80×104 CFU/g；6 d后，菌量為7.41×104 CFU/g；8 d后菌量為6.60×104 CFU/g；15 d后菌量為5.00×103 CFU/g；處理30 d后菌量為2.50×103 CFU/g。先接種BQA2-GFP后接種青枯菌的處理組，當天的菌量為1.10×106 CFU/g；處理8 d，菌量為6.17×104 CFU/g；處理30 d，菌量為1.51×103 CFU/g。先接種青枯菌后接種BQA2-GFP的處理組，當天的菌量為1.07×106 CFU/g；處理8 d，菌量為4.47×104 CFU/g；處理30 d，菌量為2.00×103 CFU/g。與先加青枯病菌R4再加BQA2-GFP的處理組相比，在0～8 d內，先加BQA2-GFP再加青枯病菌R4的處理組，BQA2-GFP在番茄根部的定殖數量更高。

在水培番茄根際中，BQA2-GFP單獨處理后當天初始菌量為3.60×105 CFU/g；隨之菌量也逐漸下降，4 d后，菌量為3.20×104 CFU/g；6 d后，菌量為2.40×104 CFU/g；8 d后菌量為7.50×103 CFU/g；15 d后菌量為2.50×103 CFU/g；30 d后菌量為1.50×103 CFU/g。先接種BQA2-GFP后接種青枯菌的處理組，當天的菌量為1.66×105 CFU/g；處理6 d，菌量為2.09×104 CFU/g；處理30 d，菌量為1.00×103 CFU/g。先接種青枯菌后接種BQA2-GFP的處理組，當天的菌量為1.51×105 CFU/g；處理6 d，菌量為1.35×104 CFU/g；處理30 d，菌量為1.00×103 CFU/g。與先加青枯病菌R4再加BQA2-GFP的處理組相比，在0～6 d內，先加BQA2-GFP再加青枯病菌R4的處理組，BQA2-GFP在番茄根部的定殖數量更高。

綜上所述，在這3種不同的處理組中，在番茄根際的標記菌株地定殖數量的變化趨向是一致的。與標記菌株和青枯病菌R4混合加入的處理組相比，單獨加入標記菌株的處理組的標記菌株在番茄根部的定殖數量更高。同時，通過統(tǒng)計X5-GFP、BQA2-GFP在番茄根部的定殖數量，這表明X5-GFP、BQA2-GFP在番茄根部都有較好的定殖能力并且比劉郵洲等[9]報道的枯草芽胞桿菌PTS-394定殖能力強，兩者相比較而言，BQA2-GFP在番茄根部的定殖能力略好于X5-GFP。而就土壤和水培的2種不同培養(yǎng)方式而言，土壤中番茄根際的標記菌株的定殖數量多于水培中的番茄根際標記菌株的定殖數量。

3 討論

生防菌的應用已經成為生物防治的一個重要方面，而生防菌在植物根際的定殖能力與抑制植物根際有害微生物的能力緊密相關。目前，世界上已經有很多科研人員對生防菌定殖能力進行了研究[8，16-19]。與其他的標記方法相比，由于GFP標記方法具有易于檢測、靈敏度高、穩(wěn)定性較好、構建載體方便等優(yōu)點受到了科研工作者的廣泛應用。

本研究采用海藻糖改良的電轉化法進行GFP標記菌株X5-GFP、BQA2-GFP，分別進行了X5-GFP、BQA2-GFP的生長速率、X5-GFP、BQA2-GFP的抑菌活性等實驗，結果表明：X5-GFP、BQA2-GFP和X5、BQA2在生長特性、對青枯病菌R4和香蕉枯萎病菌的平板抑制效果等方面沒有明顯不同。張昕等[20]研究認為無選擇壓力的條件下，隨著傳代次數越來越多，外源質粒的穩(wěn)定性會降低，如菌株ZJY-1G連續(xù)傳10代，質粒保存率是82.1%；連續(xù)傳70代，質粒保存率是9.1%；菌株ZJY-116G連續(xù)傳10代，質粒保存率是69.3%；連續(xù)傳70代，質粒保存率是0。本研究中，X5-GFP在無四環(huán)素選擇壓力的條件下，連續(xù)傳6代后質粒的穩(wěn)定性是95%，連續(xù)培養(yǎng)10代后為90%；X5-GFP在有四環(huán)素選擇壓力的條件下，連續(xù)傳6代后質粒的穩(wěn)定性為100%，連續(xù)培養(yǎng)10代后高達95%；而BQA2-GFP在無四環(huán)素選擇壓力的條件下，連續(xù)傳6代后外源質粒的穩(wěn)定性為90%，連續(xù)傳10代后為80%；BQA2-GFP在有四環(huán)素選擇壓力的條件下，連續(xù)傳6代后質粒的穩(wěn)定性為100%，培養(yǎng)10代后為95%。X5-GFP、BQA2-GFP接種后在番茄根際的定殖數量逐漸下降，這與劉郵洲等[9]的報道一致。但不同的芽胞桿菌在植物根際定殖數量的變化趨勢并不都是一樣的，劉慶豐等[21]報道的枯草芽胞桿菌XF-1能定殖到大白菜的根部，在大白菜的根際定殖數量變化趨向是先降低后上升再降低，最后基本保持穩(wěn)定；而在根內部定殖數量的變化趨向是先上升后降低。本實驗結果發(fā)現，與標記菌株和青枯病菌R4混合加入的處理組相比，單獨加入標記菌株的處理組的標記菌株在番茄根部的定殖數量更高的原因可能是生防菌和青枯菌R4有營養(yǎng)和根際定殖位點的競爭，從而使標記菌株X5-GFP、BQA2-GFP的定殖數量減少。同時生防菌與青枯菌R4的接種順序的不同也會影響生防菌在番茄根際的定殖數量，原因可能是先接種青枯病菌后，它會提前搶占番茄根際的定殖位點提前進入番茄根際及優(yōu)先利用土壤和水中的營養(yǎng)物質來進行繁殖成為優(yōu)勢菌種，從而使得番茄根際的定殖位點和外界環(huán)境中的營養(yǎng)物質減少，進而使得生防菌在番茄根際的定殖數量減少，這需要進一步的驗證。而在土壤中番茄根際的標記菌株的定殖數量多于水培中的番茄根際標記菌株的定殖數量。這可能是由于土壤中能夠為生防菌提供更全面的營養(yǎng)，有利于生防菌的生長和繁殖，從而使其在番茄根際的定殖數量更多。

參考文獻

[1] 梅汝鴻， 徐維敏. 植物微生態(tài)學[M]. 北京： 中國農業(yè)出版社， 1998.

[2] Mazzola M， Cook R J， Thomashow L S. Contribution of phenazine antibiotic biosynthesis to the ecological competence of fluorescent pseudomonas in soil habitats[J]. Applied and Environmental Microbiology， 1992， 58（12）： 2 616-2 624.

[3] Roberts D P， Kobayashi D Y， Dery P D. An image analysis method for determination of spatial colonization patterns of bacteria in plant rhizosphere[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 1999， 51（4）： 653-658.

[4] 李永剛， 宋興舜， 趙雪瑩， 等. 生防枯草芽抱桿菌L1特性的初步研究[J]. 植物保護， 2008， 34（1）： 57-61.

[5] 王光華， Raaijmakers J M. 生防細菌產生的拮抗物質及其在生物防治中的作用[J]. 應用生態(tài)學報， 2004， 15（6）： 1 100-1 104.

[6] Nautiyal C S， Johri J K， Singh H B. Survival of the rhizosphere-competent biocontrol strains Pseudomonas fluorescens NBR12650 in the soil and phytosphere[J]. Canadian Journal of Microbiology， 2002， 48（7）： 588-601.

[7] Ramos H J O， Roncatomaccari L D B， Souza E M， et al. Monitoring Azospirillum-wheat interaction using the gfp and gusA genes constitutively expressed from a new broad-host range vector[J]. Journal of Biotechnology， 2002， 97（2）： 243-252.

[8] 田 濤， 王 琦. 綠色熒光蛋白作為分子標記物在微生物學中的應用[J]. 微生物學雜志， 2005， 25（1）： 68-73.

[9] 劉郵洲， 梁雪杰， 喬俊卿， 等. 枯草芽胞桿菌PTS-394的GFP標記及其定殖能力[J]. 植物保護學報， 2014， 41（4）： 416-422.

[10] 楊秀榮， 田 濤， 孫淑琴， 等. GFP標記生防細菌B579及其定殖能力檢測[J]. 植物病理學報， 2013， 43（1）： 82-87.

[11] Cao Y， Zhang Z， Ling N， et al. Bacillus subtilis SQR 9 can control Fusarium wilt in cucumber by colonizing plant roots[J]. Biology and Fertility of Soils， 2011， 47（5）： 495-506.

[12] Gao S， Wu H， Wan g W， et al. Efficient colonization and harpins mediated enhancement in growth and biocontrol of wilt disease in tomato by Bacillus subtilis[J]. Letters in Applied Microbiology， 2013， 57（6）： 526-533.

[13] Yuan J， Yu L， Ling N， et al. Plant-growth-promoting traits and antifungal potential of the Bacillus amyloliquefaciens YL-25[J]. Biocontrol Science and Technology， 2015， 25（3）： 276-290.

[14] 殷幼平， 袁訓娥， 李 強， 等.生防菌枯草芽胞桿菌CQBS03的綠色熒光蛋白基因標記及其在柑橘葉片上的定殖[J]. 中國農業(yè)科學， 2010， 43（17）： 3 555-3 562.

[15] 楊琦鳳， 尹賢貴， 潘光輝， 等. 重慶番茄青枯病病原鑒定及抗源材料篩選[J]. 西南農業(yè)學報， 2004， 17（1）： 57-60.

[16] 彭 祎， 譚悠久， 黃永春. GFP標記的多粘芽孢桿菌1114在番茄根際的定殖[J]. 中國生物防治， 2010， 26（3）： 307-311.

[17] 郝變青， 馬利平， 喬雄梧. GFP標記的植物促生菌B96-Ⅱ-gfp的定殖能力研究[J]. 中國生態(tài)農業(yè)學報， 2010， 18（4） ： 861-865.

[18] 張 彥， 車建美， 劉 波， 等. 蠟樣芽孢桿菌ANTI-8098A在番茄內的定殖和對青枯病的防治研究[J].中國生物防治學報， 2011， 27（2）： 221-227.

[19] 范曉靜， 邱思鑫， 吳小平， 等. 綠色熒光蛋白基因標記內生枯草芽孢桿菌[J]. 應用與環(huán)境生物學報， 2007， 13（4）： 530-534.

[20] 張 昕， 張炳欣， 喻景權， 等. 生防菌ZJY-1及ZJY-116的GFP標記及其在黃瓜根圍的生態(tài)適應性[J]. 應用生態(tài)學報， 2005， 16（11）： 2 144-2 148.

[21] 劉慶豐， 熊國如， 毛自朝， 等. 枯草芽胞桿菌XF-1的根圍定殖能力分析[J]. 植物保護學報， 2012， 39（5）： 425-430.