基于RNAi抗PRSV番木瓜株系的培育及其分子特征驗(yàn)證

黃靜 賈瑞宗 孔華 郭靜遠(yuǎn) 王緒朋 郭安平

摘 要 根據(jù)RNAi原理構(gòu)建的抗海南番木瓜環(huán)斑病毒（PRSV）植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS，通過(guò)基因槍法將載體導(dǎo)入番木瓜的愈傷組織中，經(jīng)卡那霉素抗性篩選后再分化成為植株。描述轉(zhuǎn)化植株的分子特征同時(shí)進(jìn)行抗病毒試驗(yàn)分析其抗病性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)基因株系474為單拷貝插入的雜合子，插入位點(diǎn)在第7號(hào)染色體supercontig_61的717 141位置；抗病毒試驗(yàn)中，在接種病毒后28 d內(nèi)非轉(zhuǎn)基因株系1280有高濃度的病毒積累并很快表現(xiàn)出明顯的病癥，而轉(zhuǎn)基因株系474基本無(wú)病毒積累且無(wú)發(fā)病癥狀。表明轉(zhuǎn)基因株系474具有較好的PRSV抗性，有待于進(jìn)一步田間試驗(yàn)。

關(guān)鍵詞 番木瓜環(huán)斑病毒；番木瓜；RNAi

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract RNAi-mediated virus resistance strategy was used to develop PRSV resistance papaya lines. A plant expression vector pCAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS was constructed. The vector was transferred into papaya callus by particle bombardment， selected on kanamycin media. Transformation papaya lines were validated by PCR， RT-PCR， ddPCR， etc. The transgenic lines were further challenged with viral inoculation. The results showed that transgenic line 474 was single copy insertion and insertion site was located in papaya chromosome 7 supercontig_61 at 717 141 bp； non-transgenic line 1280 accumulated higher concentration of virus and developed symptoms， while transgenic line 474 was almost no virus accumulation. Transgenic line 474 was resistance to PRSV， which needed field test.

Key words Papaya ringspot virus（PRSV）； papaya； RNAi

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.03.021

番木瓜（Carica papaya L.）廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，由于其產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富和無(wú)季節(jié)性等特點(diǎn)，被認(rèn)為是重要的熱帶水果之一[1-2]。番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）是危害番木瓜生產(chǎn)的致命性病原，并制約番木瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。番木瓜環(huán)斑病毒為馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的單分體正鏈RNA病毒，主要經(jīng)蚜蟲(chóng)以非持久方式傳播[3]。

通過(guò)番木瓜的基因組分析發(fā)現(xiàn)，番木瓜因缺乏抗病的相關(guān)基因而比其他植物更易感病[4]。一些常規(guī)的抗病毒育種策略往往收效甚微，目前對(duì)于PRSV的防治以基因工程育種為主。實(shí)際利用的番木瓜抗病毒基因多數(shù)是來(lái)自病毒本身，如病毒的外殼蛋白基因、復(fù)制酶基因、核酶基因、運(yùn)動(dòng)蛋白基因等，其中外殼蛋白基因[5]和復(fù)制酶基因[6]運(yùn)用的較為成功。

夏威夷轉(zhuǎn)基因番木瓜抗病毒的策略是根據(jù)“致病菌衍生的抗病性”（PDR）原理，采用病毒來(lái)源的基因序列，通過(guò)基因槍法將其轉(zhuǎn)入不抗病的番木瓜品種中[5]。RNAi（RNA interference）即RNA干擾，亦稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）或共抑制，是植物抵抗外來(lái)核酸（轉(zhuǎn)座子、轉(zhuǎn)基因或病毒）入侵，并保護(hù)自身基因組完整性的一種防御機(jī)制，被認(rèn)為是RNA介導(dǎo)的病毒抗性，雙鏈RNA分子被認(rèn)為是最適宜的RNA沉默啟動(dòng)因子。構(gòu)建反向重復(fù)（IR）序列能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因植物的抗性[7]，一般來(lái)說(shuō)轉(zhuǎn)病毒單鏈正義或者反義基因只有20%左右轉(zhuǎn)基因植株對(duì)病毒產(chǎn)生抗性，但是轉(zhuǎn)入能夠產(chǎn)生dsRNA的IR序列卻有高達(dá)90%的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)病毒產(chǎn)生抗性[8]。

PRSV存在地理分化，各地的病毒分子差異較大。由于存在序列同源依賴性，因而限制了轉(zhuǎn)夏威夷PRSV外殼蛋白（CP）基因番木瓜在夏威夷以外地區(qū)的應(yīng)用[9]。轉(zhuǎn)夏威夷或臺(tái)灣PRSV外殼蛋白基因的品種只對(duì)夏威夷或臺(tái)灣的PRSV株系具有抗性，不抗海南的PRSV株系[10]。目前，中國(guó)還缺乏表現(xiàn)良好的具有廣譜抗性的番木瓜品種，也因此番木瓜產(chǎn)業(yè)受到環(huán)斑病的嚴(yán)重威脅。

為了培育出對(duì)海南地區(qū)PRSV種群具特異抗性的番木瓜新品種，前期已對(duì)海南昌江、樂(lè)東、澄邁、文昌和三亞5個(gè)主要番木瓜產(chǎn)區(qū)的病毒病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查取樣，獲取了海南PRSV代表分離物以及海南PRSV CP基因的保守區(qū)域。利用CP基因保守區(qū)域構(gòu)建RNAi發(fā)夾結(jié)構(gòu)，將發(fā)夾結(jié)構(gòu)導(dǎo)入pCAMBIA2300-35S-OCS植物表達(dá)載體并酶切驗(yàn)證[11]，本研究對(duì)轉(zhuǎn)入以海南PRSV代表分離物CP基因保守區(qū)域構(gòu)建的反向重復(fù)序列番木瓜進(jìn)行了分子特征的描述以及抗病性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

番木瓜品種SunRise和SunUp分別為來(lái)自夏威夷的非轉(zhuǎn)基因及商品化轉(zhuǎn)病毒CP基因的番木瓜，番木瓜品種SunRise的種子和經(jīng)過(guò)片段化處理之后的番木瓜品種SunUp的DNA均由夏威夷農(nóng)業(yè)研究中心朱蕓博士提供。轉(zhuǎn)化受體材料來(lái)源于番木瓜品種SunRise愈傷組織亦由夏威夷農(nóng)業(yè)研究中心朱蕓博士提供。

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司，pMD18克隆載體購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司，植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存[11]，采自海南的PRSV HainanⅠ、HainanⅡ和HainanⅢ 3個(gè)分離物由本實(shí)驗(yàn)室保存。

PCR試劑盒購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均購(gòu)于Omega公司，RNA提取試劑盒購(gòu)于Qiagen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Promega公司，熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司，所有實(shí)驗(yàn)用到的酶全部購(gòu)于Thermoscientific公司，其他常用試劑為分析純。引物序列見(jiàn)表1，合成以及DNA測(cè)序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株篩選 參照Kung等[12]方法誘導(dǎo)番木瓜胚性愈傷組織。參考Fitch等[13]的方法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化采用PDS 1000型基因槍（Bio-Rad，Hercules，Calif.；http：//www.bio-rad.com）。用卡那霉素（100 mg/L）抗性篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)1～2個(gè)月，成苗后再進(jìn)行外源基因PCR檢測(cè)。將檢測(cè)為陽(yáng)性的植株生根處理后移栽到土壤中，置于溫室中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化流程圖見(jiàn)圖1。

1.2.2 PRSV分離與接種 海南PRSV HainanⅠ、Ⅱ和Ⅲ這3個(gè)類型的病毒分離物保存于實(shí)驗(yàn)室。接種前將病毒接種到番木瓜上活化[14]，表現(xiàn)出病癥的番木瓜葉片制備病毒接種液。參考魏亞軍[15]接種PRSV的方法并做了適當(dāng)?shù)男薷?。取同時(shí)含有海南PRSV的HainanⅠ、Ⅱ和Ⅲ 3個(gè)類型病毒的番木瓜葉樣適量，按照1 ∶ 10（w/V）的比例加入磷酸緩沖液，充分研磨。將勻漿液加入到1.5 mL離心管中，在4 ℃條件下5 000 r/min，冷凍離心10 min。冰上放置，取上清液作為病毒接種液。PRSV接種液-20 ℃保存并在48 h內(nèi)使用，提取接種液中的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用qPCR方法測(cè)定接種液里的PRSV含量。

選取4～6葉期的苗，在葉正面撒上少量石英砂，滴加10 μL接種液由葉脈向葉尖順勢(shì)輕輕摩擦均勻涂布葉片表面。接種結(jié)束后，立即用蒸餾水沖洗接種葉表面。轉(zhuǎn)基因株系為實(shí)驗(yàn)組，非轉(zhuǎn)基因株系為對(duì)照組，同時(shí)設(shè)置不接種任何液體（CK）和接種PBS緩沖液的2種對(duì)照處理，每種處理設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。將接種后的植株置于溫室中培養(yǎng)，每隔4 d觀察記錄發(fā)病情況同時(shí)取新生幼葉用來(lái)檢測(cè)病毒量。由于PRSV在番木瓜上是系統(tǒng)性感病，排除其他因素對(duì)于病毒量的影響，故取新生幼葉檢測(cè)病毒量。采用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）和qPCR檢測(cè)接種病毒后天數(shù)（Day After Inoculation，DAI）在第0、4、8、12、16、20、24、28天的病毒積累量。

1.2.3 PCR篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗 用轉(zhuǎn)化事件特異PCR進(jìn)行陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗的篩選。使用的引物分別是目標(biāo)基因CP引物（CP1/CP2）、轉(zhuǎn)化事件特異性引物（35S-F/CP2）和內(nèi)參引物（PapainF/R）（表1）。PCR擴(kuò)增條件是：94 ℃，3 min預(yù)變性；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。這3對(duì)引物擴(kuò)增條件一致，只有35S-F/CP2引物擴(kuò)增是延伸時(shí)間為1 min，其余條件不變。反應(yīng)結(jié)束后，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 微滴數(shù)字PCR（ddPCR）分析插入的拷貝數(shù)

參考姜羽等[16]用ddPCR分析轉(zhuǎn)基因的外源基因拷貝數(shù)的方法，分析陽(yáng)性植株的插入的拷貝數(shù)。本實(shí)驗(yàn)采用QX100TM Droplet DigitalTM PCR系統(tǒng)（Bio-Rad，美國(guó)，包括微滴生成儀和微滴讀取儀），按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行相關(guān)操作，擴(kuò)增程序設(shè)置如下：95 ℃，5 min預(yù)變性；95 ℃變性20 s，58 ℃退火30 s，共45個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行在98 ℃條件下10 min熱失活。每個(gè)模板重復(fù)3個(gè)平行檢測(cè)。使用軟件Quanta Soft V1.3.2.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，獲得轉(zhuǎn)化陽(yáng)性植株絕對(duì)定量結(jié)果。

1.2.5 hiTAIL-PCR驗(yàn)證插入位點(diǎn) hiTAIL-PCR參考Liu等[17]描述的方法（引物見(jiàn)表1），驗(yàn)證陽(yáng)性植株的插入位點(diǎn)。第一輪和第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)，將條帶割膠回收后連接到pMD18克隆載體上，最后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，每個(gè)挑選3個(gè)重復(fù)陽(yáng)性菌送到生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在Phytozome v11.0（https：//phytozome.jgi.doe.gov）網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，以確定插入的位點(diǎn)信息。

1.2.6 PRSV的抗性檢測(cè) 用RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）試劑盒提取8個(gè)時(shí)間段采集的番木瓜幼葉樣本的RNA以及PRSV接種液的RNA后，使用ImProm-II Reverse Transcription System（Promega） 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。由于轉(zhuǎn)化事件是CP基因片段，因此用RT-PCR和qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因番木瓜的PRSV積累量時(shí)使用的是HC-Pro特異引物（表1）。

RT-PCR按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將RNA、引物和水的混合物在70 ℃下變性5 min，立即在冰上靜置5 min，短暫離心用來(lái)配置反應(yīng)體系。反應(yīng)條件是25 ℃，5 min；42 ℃，60 min；70 ℃，15 min，4 ℃保存。

PCR病毒檢測(cè)的擴(kuò)增條件是94 ℃ ，3 min預(yù)變性；94 ℃變性30 s，60℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 再延伸10 min。qPCR反應(yīng)程序如下：95 ℃，5 min預(yù)變性；95℃變性 20 s，58 ℃退火30 s，共45個(gè)循環(huán)，在退火步驟中采集熒光信號(hào)。每個(gè)模板重復(fù)3個(gè)平行擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后使用SDS 2.4軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，獲得實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR篩選分析

用于PCR檢測(cè)的這3對(duì)引物CP1/CP2、35S-F/CP2和PapainF/R擴(kuò)增片段大小分別是544、大約760和198 bp。陽(yáng)性對(duì)照SunUp轉(zhuǎn)入的是PRSV的 CP基因全長(zhǎng)[18]。圖2是PCR篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化事件的部分結(jié)果，其中1280株系為非轉(zhuǎn)化株系，其檢測(cè)結(jié)果與陰性對(duì)照SR結(jié)果一致，電泳結(jié)果表明CP基因引物的檢測(cè)結(jié)果與組合引物結(jié)果一致，與陽(yáng)性對(duì)照的結(jié)果相符，可判定474、242、422、537為陽(yáng)性植株。

2.2 ddPCR定量結(jié)果分析

微滴生成是ddPCR記錄信號(hào)的關(guān)鍵步驟，只有當(dāng)微滴數(shù)大于10 000時(shí)，DNA分子的分布符合泊松分布的統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，系統(tǒng)可以對(duì)陽(yáng)性和陰性微滴進(jìn)行計(jì)數(shù)[19]。ddPCR擴(kuò)增微滴形成由圖3-A可見(jiàn)，反應(yīng)中形成的微滴數(shù)處于15 000～30 000之間，均大于10 000，滿足ddPCR微滴的分析要求。ddPCR系統(tǒng)生成的陰性微滴和陽(yáng)性微滴區(qū)分明顯，系統(tǒng)可準(zhǔn)確判讀出陽(yáng)性微滴和陰性微滴數(shù)目。數(shù)據(jù)表明，實(shí)驗(yàn)建立的ddPCR體系微滴生成穩(wěn)定，重復(fù)性良好，能夠用于轉(zhuǎn)基因生物外源基因拷貝數(shù)的分析。

根據(jù)軟件讀取的外源基因和內(nèi)參基因的濃度，通過(guò)公式：外源基因拷貝數(shù)=外源基因濃度/內(nèi)參基因濃度，計(jì)算得出轉(zhuǎn)基因番木瓜474和陽(yáng)性對(duì)照SunUp的外源基因（CP）的拷貝數(shù)。ddPCR分析顯示，轉(zhuǎn)基因番木瓜474含有1.0拷貝的CP基因，SunUp則含有2.4拷貝的CP基因，見(jiàn)圖3-B。由于SunUp是（CP/CP）純合子，結(jié)果和以前的報(bào)道一致[18]。

2.3 hiTAIL-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化插入的位點(diǎn)

474樣品的hiTAIL-PCR第一輪和第二輪電泳結(jié)果如圖4-A，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析（Carica papaya ASGPB v4.0， https：//phytozome.jgi.doe.gov），發(fā)現(xiàn)比對(duì)上7號(hào)染色體的supercontig_61，Score=1 314 bits（663），Expect=0.0，Identities=669/671（99%）插入位點(diǎn)在717 141的位置（圖4-B）。轉(zhuǎn)基因植株474中，外源基因未插入到番木瓜編碼基因中，插入位點(diǎn)上游+1.2 kb 處有evm.TU.supercontig_61.23；上游+3.9 kb處有evm.TU.supercontig_61.22；上游 +10.4 kb處有evm.TU.supercontig_61.21；上游+174.2 kb處有evm.TU.supercontig_61.20。下游-2.6 kb有evm.TU.supercontig_61.24這是一個(gè)編碼反轉(zhuǎn)錄酶（RNA-dependent DNA polymerase，RVT_2）的基因；下游

-96.8 kb處有evm.TU.supercontig_61.25。

為了驗(yàn)證插入的真實(shí)性，根據(jù)插入位點(diǎn)上下游片段設(shè)計(jì)引物進(jìn)行驗(yàn)證。在supercontig_61上的717141位點(diǎn)的上游和下游各約200 bp處，利用NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）設(shè)計(jì)引物474-61F/R，擴(kuò)增片段大小為192 bp。在反應(yīng)體系中加入474-61F/R+CP2，如果存在CP基因插入時(shí)，CP基因的一條引物和設(shè)計(jì)引物組合擴(kuò)增出的片段大小應(yīng)該為1.2 kb左右（CP正向插入+35S啟動(dòng)子+右邊界+基因組的擴(kuò)增右翼）。474樣品的電泳結(jié)果（圖4-C）有2條帶其中一條帶大小與陰性對(duì)照一致192 bp，另一條帶約1.2 kb這大小符合有CP基因插入的預(yù)測(cè)，根據(jù)結(jié)果可判斷474樣品為雜合子。

2.4 轉(zhuǎn)基因番木瓜對(duì)PRSV的抗性評(píng)價(jià)

在接種病毒后28 d內(nèi)，1280株系和474株系抗病性差異明顯。3株接種病毒的1280植株表現(xiàn)一致，均感病具體表現(xiàn)為在12 DAI時(shí)表現(xiàn)出病癥，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，病癥日益明顯，在24 DAI時(shí)出現(xiàn)病癥典型；同時(shí)接種病毒的3株474植株整個(gè)過(guò)程均無(wú)病癥，表型正常，見(jiàn)圖5-A。對(duì)在8個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集的樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)病毒積累量，電泳結(jié)果見(jiàn)圖5-B。在相同模板量下，非轉(zhuǎn)基因1280株系凝膠檢測(cè)灰度程指數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，即隨著時(shí)間的延長(zhǎng)感染病毒量逐漸遞增，轉(zhuǎn)基因474株系基本沒(méi)有變化，即幾乎沒(méi)有病毒的感染（圖5-C）。

2.5 熒光定量PCR檢測(cè)病毒積累

采用相對(duì)熒光定量PCR 2-△△Ct[20]處理數(shù)據(jù)，△△Ct=（CtPRSV樣品-Ctpapain樣品）-（CtPRSV校準(zhǔn)-Ctpapain校準(zhǔn)），結(jié)果見(jiàn)圖5-D。對(duì)照組非轉(zhuǎn)基因1280株系樣品和實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)基因474株系樣品在不同時(shí)期中PRSV HC-Pro基因的轉(zhuǎn)錄水平存在顯著差異，1280樣品中HC-Pro表達(dá)量比474樣品高。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，1280植株HC-Pro表達(dá)量逐漸增多且變化顯著，而474植株HC-Pro只有少量的表達(dá)且無(wú)明顯變化，1280株系和474株系HC-Pro表達(dá)量存在顯著差異。因此，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的病毒積累量有顯著差異，實(shí)驗(yàn)組雖然有極少量病毒但是無(wú)癥狀，對(duì)照組變化明顯，有大量病毒積累并表現(xiàn)出病癥。

3 討論

番木瓜病毒病是限制番木瓜生產(chǎn)的主要因素。為了調(diào)查海南番木瓜發(fā)病情況，進(jìn)行環(huán)海南島采集番木瓜樣品，發(fā)現(xiàn)由于PRSV肆虐，海南的一些番木瓜種植區(qū)已經(jīng)出現(xiàn)了絕產(chǎn)絕收的現(xiàn)象。海南PRSV具有極高的突變率，已報(bào)道海南PRSV HainanⅠ，HainanⅡ和HainanⅢ這3個(gè)分離物在海南不同區(qū)域間分布不同[21]，通過(guò)分析海南這3個(gè)分離物找到它們的共同保守區(qū)域片斷，采用RNAi原理構(gòu)建植物表達(dá)載體。有研究表明，基因沉默效果與表達(dá)載體構(gòu)建有關(guān)。構(gòu)建發(fā)夾結(jié)構(gòu)目標(biāo)基因片斷長(zhǎng)度小于200 bp或者大于600 bp 的效果不好；在200～600 bp之間的轉(zhuǎn)化后干擾效率最高[22]，本實(shí)驗(yàn)選擇的CP基因片段大小為544 bp，在此范圍內(nèi)。

在本研究中，利用海南PRSV代表分離物共同保守區(qū)域CP基因片段構(gòu)建反向重復(fù)序列植物表達(dá)載體，采用基因槍法將載體導(dǎo)入番木瓜的愈傷組織中，經(jīng)卡那霉素抗性篩選進(jìn)而再分化成為植株。轉(zhuǎn)化苗經(jīng)過(guò)PCR篩選、ddPCR分析插入拷貝數(shù)、hiTAIL-PCR驗(yàn)證特異插入位點(diǎn)以及抗病毒試驗(yàn)。PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的474樣品ddPCR分析結(jié)果為單拷貝插入，hiTAIL-PCR顯示插入位點(diǎn)在第7號(hào)染色體supercontig_61的717 141位置，設(shè)計(jì)特異引物驗(yàn)證插入位點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)474株系為雜合子。轉(zhuǎn)基因474植株和非轉(zhuǎn)基因1280植株通過(guò)摩擦接種PRSV的抗病毒試驗(yàn)表明，474植株對(duì)PRSV的侵染產(chǎn)生了抗性，認(rèn)為這是由于轉(zhuǎn)基因番木瓜474株系體內(nèi)導(dǎo)入了由反向重復(fù)載體轉(zhuǎn)錄形成的dsRNA啟動(dòng)了RNA沉默機(jī)制的結(jié)果，即轉(zhuǎn)入CP基因反向重復(fù)載體能夠形成dsRNA，從而有效抑制了PRSV對(duì)番木瓜的侵染；PRSV在番木瓜中是系統(tǒng)侵染，非轉(zhuǎn)基因番木瓜1280株系中病毒可以由接種葉片擴(kuò)散到新生幼葉；而在轉(zhuǎn)基因番木瓜葉片上接種病毒，植株無(wú)病癥。圖5-D顯示，轉(zhuǎn)基因植株中存在病毒HC-Pro基因的極少量（不到2 dRn）表達(dá)，隨著時(shí)間的推移表達(dá)量無(wú)明顯變化，表明病毒少量存在轉(zhuǎn)基因植株中不擴(kuò)增更不發(fā)病；但圖5-B顯示，轉(zhuǎn)基因植株中RT-PCR檢測(cè)不到病毒基因表達(dá)，這是由于病毒量極少擴(kuò)增條帶不被識(shí)別，因此檢測(cè)不到病毒表達(dá)。

利用來(lái)源植物病毒本身的基因或核苷酸序列導(dǎo)入植物來(lái)得到抗病毒的工程株成為增強(qiáng)抗病性的主要措施之一，由RNA介導(dǎo)抗性使含單拷貝的轉(zhuǎn)基因植株能產(chǎn)生高度抗病性；短片斷核苷酸序列也可以起到抗病作用；入侵病毒的RNA能迅速被降解、不需表達(dá)蛋白質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)使抗病毒策略具有潛在的應(yīng)用價(jià)值并能引起廣泛關(guān)注和深入研究[23]。魏軍亞等[14]研究同源CP基因區(qū)段dsRNA對(duì)PRSV侵染的干擾作用，發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)表達(dá)的dsRNA能夠特異地干擾PRSV侵染；張帆等[24]將PRSV CP基因的dsRNA載體pHG12-CPIR轉(zhuǎn)入番木瓜中，檢測(cè)結(jié)果顯示PRSV在野生型中有大量積累，而在轉(zhuǎn)基因植株中沒(méi)有積累；Wang等[25]證實(shí)表達(dá)病原dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物能夠?qū)ο鄳?yīng)的病毒侵染產(chǎn)生抗性，結(jié)果表明在植物細(xì)胞中表達(dá)dsRNA能夠引起導(dǎo)入序列的植物的基因沉默。本實(shí)驗(yàn)采用RNA介導(dǎo)抗性，轉(zhuǎn)入以海南PRSV代表分離物CP基因保守區(qū)域構(gòu)建的反向重復(fù)序列，若要獲得廣譜抗PRSV的植株，有待于進(jìn)一步田間試驗(yàn)。

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