枯草芽孢桿菌subtilisstr.168雙精氨酸途徑分泌蛋白預(yù)測及功能分析

朱德全 韓誠武 尹紅

摘要[目的]對枯草芽孢桿菌subtilis str.168雙精氨酸轉(zhuǎn)運途徑（Tat）分泌蛋白進行預(yù)測和功能分析。[方法]從NCBI中選取枯草芽孢桿菌subtilis str.168基因組注釋的蛋白質(zhì)氨基酸序列，然后用SignalP 4.0、LipoP、TatP、TMHMM 2.0軟件分析該基因組中雙精氨酸途徑的分泌蛋白，同時采用COG功能數(shù)據(jù)庫對預(yù)測的分泌蛋白進行功能注釋和聚類分析。[結(jié)果]通過分析發(fā)現(xiàn)108個有motif沒有酶切位點的Tat信號肽蛋白、25個有酶切位點沒有motif的Tat信號肽蛋白、124個既有酶切位點也有motif的Tat信號肽蛋白，其中105個蛋白歸為Tat途徑的分泌蛋白。[結(jié)論]對枯草芽孢桿菌Tat途徑分泌蛋白的基因組預(yù)測和功能分析，將為分析該菌胞外蛋白的分泌機制打下基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞枯草芽孢桿菌；分泌蛋白；雙精氨酸分泌途徑；功能分析

中圖分類號S188文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）30-0128-03

Abstract[Objective]Prediction and functional analysis of secreted proteins of TwinArginine Translocation （Tat） pathway Bacillus subtilis str.168 were conducted. [Method]The genome sequences of B.subtilis subsp. subtilis str. 168 were used to predict to secretory proteins of Tat pathway and functional analysis. SignalP 4.0， LipoP， TatP， TMHMM 2.0 were used to predict secretory protein of Tat pathway. Function of secretory proteins was also analyzed by COG （Cluster of Orthologous Groups of proteins） database. [Result]There were 108 Tat signal peptides proteins containing motif without cleavage site of enzyme， 25 proteins containing cleavage site of enzyme without motif， 124 proteins containing cleavage site of enzyme and motif.105 proteins were classified as proteins secreted by Tat pathway in these proteins. [Conclusion]These results will lay the foundation for analyzing the secretion mechanism of extracellular protein in B. subtilis.

Key words Bacillus subtilis；Secreted proteins；Tat secretion pathway；Function analysis

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為革蘭氏陽性菌，它們對外界有害因子抵抗力強，能抑制有害菌的生長繁殖，且保濕性強，為土壤的保護膜，可以防止肥分及水分流失，并能產(chǎn)生多種生理活性物質(zhì)及其他容易被環(huán)境利用的養(yǎng)分[1]，適用于有機肥、堆肥的制作。在環(huán)境和水體凈化、防治水稻稻瘟病以及醫(yī)療中發(fā)揮重要作用。2006年NCBI數(shù)據(jù)庫上收集的芽孢桿菌種名有182個，有的分類系統(tǒng)將芽孢桿菌分為20多個屬。

細菌的分泌蛋白在介導(dǎo)菌體與宿主細胞黏附定殖、與外界環(huán)境相互作用方面扮演重要的作用[2]。細菌蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)合成后，通過不同的途徑跨膜分泌到細胞外。雙精氨酸轉(zhuǎn)運（ Twinarginine translocation，Tat）途徑是另外一個蛋白分泌跨膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，該系統(tǒng)的特征是在分泌蛋白的信號肽中含有一個高度保守的雙精氨酸基序[3]。Tat途徑的優(yōu)點是它只分泌已正確折疊的蛋白，從而保證了分泌產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)上的正確性[4]。該研究從NCBI中選取枯草芽孢桿菌subtilis str.168基因組注釋的蛋白質(zhì)氨基酸序列，然后用SignalP 4.0、LipoP1.0、TatP、TMHMM 2.0軟件分析該基因組中的Tat分泌蛋白及其功能，有助于分析芽孢桿菌對外界環(huán)境產(chǎn)生相應(yīng)環(huán)境效應(yīng)的機理，為今后對其功能的具體研究以及對環(huán)境管理保護提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

下載美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）GenBank公布的芽孢桿菌細菌基因組序列，GenBank的登錄號是NC_000964.3。

1.2方法

1.2.1Tat途徑分泌蛋白的分析和統(tǒng)計。

采用SignalP 4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）和LipoP1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/）軟件分析該菌株的Sec途徑分泌信號肽的蛋白。利用TatP軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TatP）預(yù)測Tat途徑分泌信號肽的蛋白。同時利用軟件TMHMM 2.0 （http：//genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測分析蛋白的跨膜螺數(shù)。只有TatP軟件預(yù)測為陽性，同時SignalP 4.0和LipoP1.0預(yù)測為陰性，并且跨膜螺旋數(shù)≤1才被歸類為Tat途徑的分泌蛋白。

1.2.2Tat途徑分泌蛋白功能分析。

統(tǒng)計Tat途徑分泌蛋白，同時采用COG功能數(shù)據(jù)庫（http：//eggnog.embl.de/）對分析得到的分泌蛋白質(zhì)進行功能注釋和聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.1芽孢桿菌Tat途徑分泌蛋白分析

先后使用4種軟件對枯草芽孢桿菌subtilis str.168基因組4 157個蛋白進行Tat途徑分泌蛋白的預(yù)測分析[5]。由表1可知，沒有酶切位點的Tat信號肽的蛋白有108個，有酶切位點沒有motif的Tat信號肽蛋白有25個，有酶切位點也有motif的Tat信號肽蛋白有124個，其中有酶切位點也有motif的Tat信號肽蛋白中跨膜螺旋數(shù)≤1的Tat途徑分泌蛋白為105個。同時對它們的基因編號、蛋白名稱、蛋白長度、COG功能以及酶切位點進行分析，結(jié)果見表2。

2.2芽孢桿菌基因組Tat途徑分泌蛋白功能分析

分析結(jié)果表明有酶切位點也有motif的Tat途徑分泌蛋白個數(shù)為105個，其中具有COG功能注釋的蛋白有96個。這些有功能注釋的Tat途徑分泌蛋白，主要與氨基酸代謝和轉(zhuǎn)運，蛋白質(zhì)翻譯后修飾，能源產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換，核糖體的結(jié)構(gòu)和生源有關(guān)[6]。

3討論

分泌蛋白是微生物吸收營養(yǎng)物質(zhì)、適應(yīng)外界環(huán)境并與宿主發(fā)生相互作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。盡管Sec途徑是細菌中蛋白分泌跨膜轉(zhuǎn)運的主要途徑，但是Tat途徑只轉(zhuǎn)運折疊正確的蛋白質(zhì)，產(chǎn)物更加穩(wěn)定[5]，具有較強的現(xiàn)實意義，目前一些具有工業(yè)價值的重組蛋白已通過Tat途徑實現(xiàn)有效的分泌表達[7]。

芽孢桿菌是較早完成分泌蛋白預(yù)測的細菌，總共發(fā)現(xiàn)301個分泌蛋白，占基因組總數(shù)的7.3%。芽孢桿菌的分泌蛋白類型和數(shù)量都比較多，可能與適應(yīng)土壤微生物環(huán)境有關(guān)[6，8]。對枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168基因組Tat途徑分泌蛋白的預(yù)測和功能分析有助于了解該菌株適應(yīng)外界環(huán)境的分子機制，也為該菌株目標(biāo)蛋白的高效表達提供新的途徑。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過Tat途徑分泌的含有信號肽蛋白有258個，約占全部基因的10.1%，但既有酶切位點又含motif的蛋白為124個，占基因組編碼蛋白的3.0%，這與其他菌株的比例相似。

對Tat途徑分泌蛋白的功能分析發(fā)現(xiàn)，這一途徑分泌蛋白的功能主要與氨基酸運輸和代謝，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯后的修改，能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換，核糖體的結(jié)構(gòu)和生源有關(guān)。這將有利于該菌株適應(yīng)外部環(huán)境。

參考文獻

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