辣木組織培養(yǎng)技術(shù)初步研究

陸滟靈　安冰

摘要[目的]初步研究辣木組織培養(yǎng)技術(shù)。[方法]以辣木種子為外植體，通過組織培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽，形成完整的組培再生植株，并研究辣木誘導(dǎo)、增殖和生根的適宜培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。[結(jié)果]最佳外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0.80 mg/L + NAA0.40 mg/L+益培靈0.10 g/L，萌芽率為95%；最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA0.30 mg/L+NAA0.02 mg/L+益培靈0.05 g/L，增殖個數(shù)為6.4個；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.30 mg/L+ABT1號 0.015 mg/L+益培靈0.03 g/L，生根率可達(dá)95%，根長為5.21 cm。[結(jié)論]辣木組培快繁技術(shù)有助于解決良種缺乏的問題，并為種質(zhì)資源開發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞辣木；外植體； 組織培養(yǎng)

中圖分類號S792.99文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）33-0140-02

Preliminary Study of Tissue Culture Technology of Moringa oleifera Lam.

LU Yanling ， AN Bing*

（Guangxi Paiyangshan State Forest Farm，Ningming，Guangxi 532500）

Abstract[Objective]To preliminarily study the tissue culture technology of Moringa oleifera Lam..[Method]Seeds of M. oleifera Lam. were used as explants to induce adventitious buds and form a complete tissue culture plant by tissue culture technology.The suitable medium and culture condition for induction， multiplication and rooting of M. oleifera Lam. were studied.[Result]The most suitable culture combination for explants induction was 1/2MS+6-BA0.80 mg/L+NAA0.40 mg/L+Yipeiling 0.10 g/L，the germination rate was 95%.The best culture combination for multiplication was MS+6-BA0.30 mg/L+NAA0.02 mg/L+Yipeiling 0.05 g/L，the number of multiplication was 6.4. The best rooting medium was 1/2MS+IBA0.30 mg/L+ABT1 0.015 mg/L+Yipeiling 0.03 g/L，the rooting rate could reach 95% and the root length was 5.21 cm.[Conclusion]Rapid propagation technology of M. oleifera Lam. can help to solve the lack of seeds and provide technical support for development and utilization of germplasm resources.

Key wordsMoringa oleifera Lam.； Explant； Tissue culture

辣木（Moringa oleifera Lam.）又稱鼓槌樹（Drumstick tree），原產(chǎn)于印度北部，是多年生熱帶落葉喬木，其適應(yīng)力強(qiáng)，耐干旱、貧瘠和病蟲害，能適應(yīng)砂土、黏土和微堿性土壤，被譽(yù)為“奇跡之樹”[1-2]。辣木葉片、種子、果莢、根系、莖桿和幼苗均可食用，營養(yǎng)豐富而全面，是目前已發(fā)現(xiàn)的最好的植物蛋白、葉酸、泛酸、鈣鐵硒等多種營養(yǎng)來源，含多種礦物質(zhì)和維生素，可作為蔬菜食用，也可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健等領(lǐng)域[3]，美國Discovery頻道曾在“另類醫(yī)學(xué)指南”系列報道中指出辣木含有豐富的營養(yǎng)素，被廣泛應(yīng)用于改善各種疾病，成效顯著。

目前辣木繁殖方式以播種為主，扦插為輔，但僅依靠播種和扦插，種質(zhì)混雜，質(zhì)量參差不齊，不能滿足優(yōu)良品系大規(guī)模產(chǎn)業(yè)需求[4]。辣木組培快繁技術(shù)有助于解決良種缺乏的問題，并為種質(zhì)資源開發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

組培由于條件可控，不受季節(jié)限制可全年生產(chǎn)，利用組培技術(shù)，可實現(xiàn)優(yōu)良無性系或單株迅速推廣，不改變其遺傳性，保持原有優(yōu)良性狀不變。通過組織培養(yǎng)技術(shù)有望建立“種質(zhì)銀行”或“基因庫”，便于種植保存和交流，加速優(yōu)良品種的推廣，縮短育種周期，獲得常規(guī)育種難以或無法得到的新基因型，創(chuàng)造新的物種或品種。辣木組培可保持單株優(yōu)良特性，達(dá)到優(yōu)良遺傳材料的快速繁殖（良種快繁）、脫毒良種苗和無病毒苗的大量繁殖、特殊育種材料的快速繁殖、基因工程植株的快速繁殖和離體種子的快速繁殖等[5]。該試驗通過組織培養(yǎng)手段，以印度辣木種子為材料，對外植體誘導(dǎo)及無菌組織培養(yǎng)體系進(jìn)行嘗試，初步建立無菌組培體系，并獲得辣木誘導(dǎo)、增殖和生根的適宜培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。

1材料與方法

1.1材料以辣木種子為材料，原產(chǎn)地為印度。

1.2方法

1.2.1外植體的取材與滅菌。選擇飽滿無皺縮的辣木種子作為外植體，去除紙質(zhì)白翼，材料用飽和洗衣粉溶液刷洗干凈后備用。外植體滅菌采用2個處理：M1為75%乙醇30 s+1‰氯化汞10 min；M2為15%新潔爾滅30 min+15%次氯酸鈉15 min，統(tǒng)計不同處理的污染率、灼傷率、萌芽率。

1.2.2辣木組織培養(yǎng)體系的建立。

1.2.2.1外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)。將滅菌后的材料接種到培養(yǎng)基上，至于光強(qiáng)3 000 lx、溫度25 ℃誘導(dǎo)不定芽，外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用4個處理，Y1為MS+6-BA0.80 mg/L+NAA 0.40 mg/L+益培靈0.10 g/L；Y2為MS+6-BA1.00 mg/L+NAA0.50 mg/L+益培靈0.10 g/L；Y3 為1/2MS+6-BA 0.80 mg/L+NAA0.40 mg/L+益培靈0.10 g/L；Y4為1/2MS+6-BA 1.00 mg/L+NAA0.50 mg/L+益培靈0.10 g/L，統(tǒng)計不同處理的保存率、萌芽數(shù)、萌芽率。

1.2.2.2增殖培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)基采用3個處理：Z1為MS+6-BA0.70 mg/L+NAA0.06 mg/L+益培靈0.05 g/L；Z2為MS+6-BA0.50 mg/L+NAA0.04 mg/L+益培靈0.05 g/L；Z3 為MS+6-BA0.30 mg/L+NAA0.02 mg/L+益培靈0.05 g/L。培養(yǎng)條件：溫度24～26 ℃，光照12～14 h/d，光強(qiáng)2 500～3 000 lx，統(tǒng)計不同處理的增殖個數(shù)、莖芽長度。

1.2.2.3生根培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基采用3個處理：S1為 1/2MS+IBA0.40 mg/L+ABT1號 0.020 mg/L+益培靈0.03 g/L；S2為1/2MS+IBA0.30 mg/L+ABT1號0.015 mg/L+益培靈0.03 g/L；S3為1/2MS+IBA0.20 mg/L+ABT1號0010 mg/L+益培靈0.03 g/L。培養(yǎng)條件：溫度24～26 ℃，光照12～14 h/d，光強(qiáng)3 000～3 500 lx，統(tǒng)計不同處理的苗高、根長、生根率。

以上所有培養(yǎng)基均加入30 g/L蔗糖和6 g/L瓊脂。培養(yǎng)基中所使用的益培靈，是一種新型組織培養(yǎng)專用防污染殺菌劑，其作用機(jī)理是穿透微生物的細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，與核酸堿基結(jié)合，干擾復(fù)制或通過斷開微生物關(guān)鍵蛋白質(zhì)的鍵而起殺菌作用，購自上海稼豐園藝用品有限公司。

2結(jié)果與分析

2.1外植體的取材與滅菌

由表1可知，處理M1比處理M2污染率低22百分點、萌芽率高27百分點、灼傷率低14百分點，滅菌后的外植體生長良好、萌發(fā)正常，有明顯優(yōu)勢，但有褐化現(xiàn)象。這說明75%乙醇+1‰氯化汞可以有效降低外植體的污染率，但對外植體有一定傷害作用，易出現(xiàn)褐化，因此無菌水清洗時，一定要清洗徹底。如果褐化情況嚴(yán)重，可以嘗試在1‰氯化汞滅菌時，將10 min滅菌過程分為2次5 min滅菌，中間用無菌水清洗數(shù)次，這樣對褐化、灼傷現(xiàn)象有較明顯的抑制作用，且對滅菌效果影響不大。

2.2辣木組織培養(yǎng)體系的建立

2.2.1外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)。由表2可知，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的激素溶度配比以處理Y3效果最佳，萌芽率高，生長快且芽長勢良好。在保存率相差不大的情況下，處理Y1、Y2和Y4的萌芽率較Y3分別低28百分點、20百分點和14百分點，說明在基礎(chǔ)培養(yǎng)基相同的情況下，激素配比6-BA0.80 mg/L+NAA0.40 mg/L更為適宜；在相同激素配比下，1/2MS較MS更適宜；最佳培養(yǎng)基配比為1/2MS+6-BA0.80 mg/L+NAA0.40 mg/L+益培靈0.10 g/L。當(dāng)激素濃度過高時，辣木容易出現(xiàn)大團(tuán)愈傷組織，不易萌芽，且出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，即使萌芽較多，也容易成為無效芽。

2.2.2增殖培養(yǎng)。由表3可知，增殖培養(yǎng)基以處理Z3效果最佳，增殖個數(shù)為6.4個，莖芽可伸長7.8 cm，芽生長旺盛，莖粗壯，葉片展開良好；處理Z1激素濃度偏高，增殖個數(shù)較處理Z3低51.6%，莖芽伸長低42.3%，生長較弱，基部易形成愈傷團(tuán)塊，芽點密集但不易伸長，且出現(xiàn)黃葉或落葉；處理Z2激素濃度稍好，增殖個數(shù)較處理Z3低20.3%，莖芽伸長低20.5%，莖葉細(xì)長，長勢較弱。

2.2.3生根培養(yǎng)。由表4可知，以處理S2生根效果最佳，接種25 d后，辣木苗根系發(fā)達(dá)，根長5.21 cm，苗木生長旺盛，移栽后成活率可達(dá)95%；處理S1激素濃度過高，苗高和根長分別較處理S2低29.2%和32.5%，生根率低，且根基部出現(xiàn)膨大或褐化現(xiàn)象，苗木生長緩慢細(xì)弱，部分苗木不生根，長勢弱，移栽后成活率低；處理S3激素濃度偏低，苗高和根長分別較處理S2低18.4%和23.2%，生根率較低，根系較弱，移栽后成活率不高，抗性差。

3結(jié)論與討論

該研究結(jié)果表明，辣木種子使用乙醇和氯化汞滅菌1次的效果最好，但容易灼傷種子，引起褐化，降低發(fā)芽率。新潔爾滅和次氯酸鈉污染率次之，基本無灼傷，但污染率高，這與類似研究得出的結(jié)果相一致[6]。在實際操作時，辣木種子比較輕，容易漂浮起來，滅菌不徹底，可以用紗布包起來滅菌，滅菌過程結(jié)束后，晾干再接種。不同濃度激素對外植體誘導(dǎo)有顯著影響，處理Y3為最佳培養(yǎng)基配比，接種4～6 d時開始萌動，下胚軸基部有白色疏松的愈傷組織，8 d左右出現(xiàn)綠色凸起，10～12 d誘導(dǎo)出不定芽。從試驗中發(fā)現(xiàn)，激素濃度過高，愈傷組織易膨大、畸形并難誘導(dǎo)出芽；激素濃度過低，又影響芽的萌動。試驗結(jié)果表明，在誘導(dǎo)階段，1/2MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，明顯優(yōu)于MS培養(yǎng)基，說明在一定濃度范圍內(nèi)，辣木對培養(yǎng)基的吸收利用量是一定的，濃度過高反而會抑制苗木的生長。當(dāng)辣木莖段進(jìn)行初代培養(yǎng)誘導(dǎo)出的芽伸長至 3～5 cm時，將其切下接種在辣木增殖培養(yǎng)基中，定期觀察其增殖情況。培養(yǎng)時，要注意掌握好暗培養(yǎng)、弱光培養(yǎng)及自然光培養(yǎng)的時間，才能夠獲得生長健壯、增殖個數(shù)適宜的芽，建立有效的無菌芽繁殖體系。增殖培養(yǎng)基中，激素6-BA和NAA的濃度配比非常重要，直接影響著增殖個數(shù)和有效芽的質(zhì)量。在生根培養(yǎng)試驗中，處理S2為最佳配方，接種6 d后芽基部開始形成根原基凸起，8～10 d出現(xiàn)小根，15～20 d長出茁壯的根系。由于組培苗是在無菌、恒溫等人工控制的環(huán)境下生長，因此煉苗過程非常重要。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基有效保證了辣木的生存和生理活動所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)及能量，在適當(dāng)植物生長調(diào)節(jié)劑配比下，誘導(dǎo)細(xì)胞分裂分化，愈傷組織進(jìn)一步發(fā)育成根莖葉，形成完整的植株，也正是組織培養(yǎng)的難點所在，除此之外，在培養(yǎng)時，還要注意溫度、濕度和光照等培養(yǎng)條件，尋找最佳的培育條件，從而建立高效的無菌組培體系[7-8]。在植物組培快繁過程中，培養(yǎng)基、接種器具、超凈工作臺、接種室滅菌不規(guī)范等均可導(dǎo)致污染的發(fā)生，而植物本身在莖葉表面容易滋生大量的微生物，甚至一些菌絲體侵入表皮的薄壁組織，不能被一般的表面滅菌方法所清除，隨著材料帶入培養(yǎng)過程，引起內(nèi)生菌污染[9]。該試驗采用了益培靈這種新型組織培養(yǎng)專用防污染殺菌劑，可有效減輕微生物污染，提高成活率和成功率[10]。在后續(xù)試驗中，使用和篩選新型組織培養(yǎng)專用防污染殺菌劑，對減輕微生物造成的污染，提高培養(yǎng)成功率和培養(yǎng)物的成活率，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益等都有重要意義。目前世界上還有很多辣木資源未被合理利用，可以收集不同辣木品系，建立辣木種質(zhì)資源體系，加速優(yōu)良無性系的選育推廣[11]。

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