TAIL—PCR研究進展及其在畜牧獸醫(yī)中的應用

馬玲 王志強 覃紹敏 吳健敏

摘要：熱不對稱交錯PCR（TAIL-PCR）是一種以PCR為基礎的染色體步移，主要用于分離已知基因的側翼序列，具有簡便、快速、高效、特異性強等特點。文章從TAIL-PCR的原理、優(yōu)勢及局限性、反應體系優(yōu)化等方面對TAIL-PCR的研究進展進行綜述，其中在畜牧獸醫(yī)中主要用于已知基因側翼克隆和轉基因動物模型外源基因插入位點確定。但由于基因組DNA的龐大和復雜性，使得從基因組中克隆獲得目的基因仍存在諸多限制因素，如特異性引物錯配和隨機引物結合位點不確定，易造成非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生；模板GC含量異?；虼嬖诟叨戎貜托蛄袝r，即使使用多種簡并引物也難以獲得陽性產(chǎn)物。因此，應根據(jù)實際情況對TAIL-PCR進行靈活調(diào)整。當模板較復雜時，可借鑒連接介導PCR原理，給引物加上接頭，提高擴增反應的特異性；當模板較簡單或序列較清晰時，可根據(jù)模板特點（如高GC含量）或已知模板序列設計引物、調(diào)整反應條件，增加操作的簡便性；還可參考Suppression-PCR原理，選擇引物和反應條件，獲得較長的擴增片段。此外，TAIL-PCR可與多種技術聯(lián)合使用，促使其在畜牧獸醫(yī)中獲得更廣泛深入的應用。

關鍵詞： TAIL-PCR；染色體步移；研究進展；應用

中圖分類號： Q813 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）05-0926-07

Advances in TAIL-PCR and its application in animal

husbandry and veterinary

MA Ling 1， WANG Zhi-qiang 2，3， QIN Shao-min1， WU Jian-min1 *

（1 Guangxi Veterinary Research Institute / Guangxi Key Laboratory of Animal Epidemic Etiology and Diagnostic， Nanning 530001， China； 2 State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresearches， Nanning 530004， China； 3 College of Life Science and Technology， Guangxi University， Nanning 530004， China）

Abstract：Simple， rapid， high efficient and specific， thermal asymmetric interlaced PCR（TAIL-PCR）， a kind of chromosome walking based on PCR， was mainly used to isolate the flanking sequences of target DNA segments. The principle， advantage， disadvantage and reaction system optimization of TAIL-PCR as well as some critical problem were summarized. In animal husbandry and veterinary medicine， TAIL-PCR was mainly used to isolate exogenous gene insertion sites and clone flanking sequences of the known genes in transgenic animals. Being limited by the complexity of genome DNA， there were so many limited factors preventing cloning target genes from genome， such as amplification of nonspecific products caused by mismatch of specific primers and arbitrary primers， and the difficulties in obtaining positive products even using multiple degenerate primers caused by abnormal template GC content and highly repeated sequences. So the adjustments should be made depend on actual situation. When the templates were complex， adapter could be added to the primers to improve the specificity based on the principle of LM-PCR； while when the template were simple or the sequence were clear， primers could be designed and reaction conditions could be set based on the characters of the templates（high GC content） or known template sequence， which made it easier to operate； and the suitable primers and reaction conditions could be chosen to get longer amplification products based on the principle of Suppression-PCR. Moreover， TAIL-PCR could be used with other technologies to facilitate its application in animal husbandry and veterinary.

Key words： TAIL-PCR； chromosome walking； research progress； application

0 引言

獲得較完整基因序列是研究基因結構、功能和表達調(diào)控的必要條件，確定外源基因的插入位點是建立轉基因動植物模型和插入突變體后的首要步驟，掌握反轉錄病毒科病毒在宿主基因組中的整合位點是研究病毒致病機理的根本前提，而開展這些研究均需要從已知基因序列出發(fā)，通過染色體步移逐步獲得其上、下游未知序列或與其有線性關系的目標序列。近年來，PCR和生物信息學的發(fā)展促使染色體步移變得越來越簡單、快捷，相繼出現(xiàn)了多種以PCR為基礎的染色體步移技術，包括反向PCR、連接介導PCR、抑制PCR、鍋柄PCR、高通量染色體步移等（李付鵬等，2010；雷明等，2016；彭雷等，2016），但這些方法大多存在操作繁瑣、試驗周期較長的缺陷，而且有的依賴于酶切和連接，受酶切位點、連接效率影響較明顯，有的則因基因組DNA結構限制了反應效率。熱不對稱交錯PCR（Thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-

PCR）具有簡便、快速、高效、特異性強等特點，已廣泛應用于多個學科研究領域（Liu and Whittier，1995；鄭岑等，2009；陳笑蕓等，2013），成功獲得多種動植物和微生物基因啟動子序列、基因全長，并用于轉基因動植物外源基因插入位點側翼序列的克隆。為此，本文基于TAIL-PCR的原理和特點，總結近年來該方法的研究進展，以期為TAIL-PCR的推廣應用提供參考。

1 TAIL-PCR原理

1. 1 基本原理

TAIL-PCR原理是根據(jù)已知序列和物種保守氨基酸設計3個高DNA熔解溫度（Melting temperature，Tm）的嵌套式特異性引物（Specific primer，SP1/2/3）和多個低Tm的隨機簡并引物（Arbitrary primer，AD），然后以基因組DNA為模板，設計3輪半巢式PCR擴增反應（李付鵬等，2010）。由于引物對的Tm存在明顯差別，TAIL-PCR通常被設計成熱不對稱的多級反應（Liu and Whittier，1995）。其中，第1輪擴增包括5個使SP與已知序列基因退火并延伸的高嚴謹性循環(huán)、1個使AD與未知序列模板退火并延伸的低嚴謹性循環(huán)及促使2種引物退火并延伸的10個較低嚴謹性循環(huán)和12個熱不對稱交錯循環(huán)（圖1）；第2和3輪擴增則分別包括10個熱不對稱交錯循環(huán)和20個較低嚴謹性循環(huán)。

第1輪擴增以SP1和AD為引物，可獲得三類產(chǎn)物：SP1和AD（I類）、SP1（II類）、AD（III類）擴增產(chǎn)物。第2輪擴增以SP2和AD為引物，以1000倍稀釋的第1輪擴增產(chǎn)物為模板，起始的高嚴謹性循環(huán)更有利于I類產(chǎn)物的大量擴增；在隨后的循環(huán)中，由于缺少SP2結合位點和模板量較少，II類、III類產(chǎn)物也相對較少。第3輪擴增以SP3和AD為引物，20個較低嚴謹性循環(huán)雖然有利于2種引物退火，但不足以使模板量較少的II類、III類產(chǎn)物擴增到可見程度，從而進一步特異性擴增I類產(chǎn)物。通過上述反應，特異性擴增產(chǎn)物占有絕對比例，可通過膠回收或直接測序獲得目的基因的序列而獲得已知基因的側翼序列。

1. 2 引物設計

根據(jù)TAIL-PCR的原理可發(fā)現(xiàn)，引物錯配可直接導致非特異性（II類、III類）產(chǎn)物的擴增。因此，引物設計是TAIL-PCR的關鍵，要求即使在低嚴謹性循環(huán)中也不能產(chǎn)生引物二聚體。

除Tm較高（58～68 ℃）外，3個SP間應相距100 bp以上，以便于通過電泳區(qū)分各級反應產(chǎn)物，進而初步判斷反應特異性。SP錯配可導致II類產(chǎn)物擴增（鄭岑等，2009），尤其當SP的3'端GC含量較高時，因此設計SP時需注意3'端GC含量。通過TAIL-PCR的反應流程（圖1）可知，第1輪擴增對整個流程影響較大，是控制特異性擴增的關鍵，如TAIL-PCR最終未能獲得滿意結果，可重新設計SP1用于試驗。

AD的Tm需比SP低10 ℃以上，且使用5個簡并堿基（簡并度128～256），同時設4種3'序列：AGA/AGG/

GAA/GGA，以增加AD在已知基因側翼序列中的結合位點，便于目的基因的擴增。一般情況下，TAIL-PCR的成功率為60.0%～80.0%，擴增片段0.3～1.0 kb，甚至2.0 kb，若僅獲得250 bp以下的擴增產(chǎn)物，則需更換AD。此外，不同AD在不同物種中的應用效果也有差異，可同時采用多個AD進行擴增篩選（陳笑蕓等，2013）。

1. 3 反應條件

在TAIL-PCR中，高、較低和低嚴謹性循環(huán)的退火溫度分別設為63、44和30 ℃。其中，高嚴謹性循環(huán)中的退火溫度可比SP的Tm高1～5 ℃，以提高反應特異性。為減少錯配，可使用較低濃度的SP（0.15～0.20 μmol/L），但AD使用濃度宜高（3.00～5.00 μmol/L），以滿足結合效率；使用含有次黃嘌呤的AD時，用量減半。此外，如需直接測序TAIL-PCR擴增產(chǎn)物，第2、3輪擴增中添加25 μmol/L dNTP可滿足擴增要求。在TAIL-PCR中，低嚴謹性循環(huán)和簡并引物的使用可提高引物正確結合的概率。

2 TAIL-PCR優(yōu)勢及局限性

與反向PCR、連接介導PCR等相比，TAIL-PCR無需進行酶切、連接、加尾等模板前期處理，也不需要Southern blotting、引物標記等后期處理，操作簡便，同時避免了酶切、連接對反應效率的影響和連接過程可能出現(xiàn)的嵌合體；對模板的含量和純度也沒有更高要求，操作過程基本與PCR類似，可實現(xiàn)大量樣品的自動化加樣、擴增；擴增產(chǎn)物特異性較強，可直接用于雜交探針和序列測定（鄭岑等，2009；Chen et al.，2016）。在適用性方面，TAIL-PCR可用于包括哺乳動物基因組在內(nèi)各種復雜、簡單樣品的檢測，整個反應流程可在24 h內(nèi)完成，極大節(jié)省了時間，成功率在60.0%～

80.0%。

TAIL-PCR由三級連續(xù)擴增反應組成，第1輪擴增的產(chǎn)物對后續(xù)反應有較大影響，因此試驗前須優(yōu)化各反應條件，且TAIL-PCR的引物設計和反應條件相對復雜，給其推廣應用帶來了困難。如同一簡并引物在不同物種中的擴增效果明顯不同，需同時采用多個通用引物平行擴增以獲得理想的結果；而第1輪擴增中II、III類產(chǎn)物可能會導致擴增失敗或僅獲得小片段的擴增產(chǎn)物（Liu and Chen，2007；陳笑蕓等，2013）。分子生物學的發(fā)展對染色體步移技術提出了更高要求，包括希望獲得更長的側翼基因序列、進一步縮短反應時間、從含量較低或較高GC含量樣品中擴增出目的基因等，因此需要圍繞TAIL-PCR開展多方面的優(yōu)化設計，通過與生物信息學等方法聯(lián)用，提高反應成功率，擴大推廣應用面。

3 TAIL-PCR反應體系優(yōu)化

3. 1 引物篩選優(yōu)化

為提高反應效率、獲得更長的基因片段，Liu和Chen（2007）改進優(yōu)化TAIL-PCR反應體系，以LAD代替AD，并根據(jù)LAD的5'端序列合成引物AC1，同時參照Suppression-PCR原理抑制500 bp以下片段的擴增，最終建立了高效TAIL-PCR（High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR，hiTAIL-PCR）。hiTAIL-PCR的擴增產(chǎn)物以1.0～3.0 kb為主，遠大于TAIL-PCR的0.3～1.0 kb。Liu和Chen（2007）研究證實，hiTAIL-PCR的成功率可達93.3%，且大多數(shù)目的基因通過兩輪PCR即可獲得，有效節(jié)省了反應時間。此外，在第1輪擴增中如將兩種LAD混合使用，可使成功率提高到97.4%。

與hiTAIL-PCR相似，Wang等（2011b）在TAIL-PCR基礎上，于AD的5'端添加31 bp基因片段（Fusion primer），以此作為第1輪PCR擴增的引物，相當于給擴增產(chǎn)物連上“接頭”，在第2、3輪擴增中分別根據(jù)“接頭”序列設計FSP1、FSP2引物與特異性引物配對擴增，增強反應特異性，成功率超過85.0%。此外，該方法在反應條件上也進行優(yōu)化，僅在第1輪擴增中使用超級循環(huán)，使整個反應可在4 h內(nèi)完成，極大節(jié)省了反應時間，并獲得2.0 kb以上的片段。優(yōu)化后的TAIL-PCR通用性良好，可從7種薔薇科植物中擴增獲得21個目的基因片段、從玫瑰中擴增獲得4個MYB基因片段、從矮牽牛的MADS-Box轉錄因子家族中擴增獲得3個啟動子序列，以及日本落葉松TCTP基因的5'側翼啟動子區(qū)序列（Zhang et al.，2013）和沙雷氏菌ChrT基因5'和3'側翼序列（Deng et al.，2015）。

TAIL-PCR擴增產(chǎn)物通常需要克隆才能獲得目的基因序列，為控制克隆時擴增產(chǎn)物插入載體的方向，Tan等（2005）建立了SiteFinding-PCR，即設計2種SiteFinder引物（5'端為含Not I酶切位點和6個N的基因片段，3'端分別為GCCT/GCGC），并根據(jù)SiteFinder 5'端設計部分序列重復的巢式引物SFP1和SFP2。在其反應程序中，首先采用SiteFinder進行1個反應的單引物擴增，然后在體系中加入特異性引物和SFP1，進行30個循環(huán)的二溫式PCR擴增，兩輪擴增結束后以Not I酶切擴增產(chǎn)物，連接至經(jīng)Not I和EcoR V雙酶切的pBlueScript SK（+）載體上，最后以M13R和特異性引物配對，PCR篩選目標產(chǎn)物。采用優(yōu)化后的TAIL-PCR，Tan等（2005）在噬藍藻體中擴增獲得4617 bp的目的片段、從15種擬南芥的變異體中擴增獲得14個T-DNA插入位點（未優(yōu)化的TAIL-PCR僅擴增獲得9個）。該方法首先根據(jù)Suppression-PCR原理，使非目的基因擴增產(chǎn)物形成莖環(huán)結構而抑制其擴增；其次是進一步簡化PCR反應條件，縮短反應時間，并通過酶切位點控制基因片段插入載體的方向，以便于PCR鑒定，是一種簡便、快捷擴增大片段側翼序列的方法。

但SiterFinder中6個N的使用增加了自我配對的風險，為此，Luo等（2011）設計了11條CLP簡并引物，僅使用4個N，并將3'端的堿基增加到7個。這7個堿基中，有的含有6 bp的酶切位點，有的是2個3 bp的重復序列，有的則是4 bp的酶切位點及1個嘌呤堿和1個嘧啶堿。此外，在第1輪擴增中只添加特異性引物進行30個循環(huán)的普通反應，快速冷卻后加入CLP，進行1個變性溫度80 ℃、退火溫度43 ℃的循環(huán)，此舉可增加CLP結合到新合成單鏈DNA上的機會；在第2輪擴增中，以特異性引物和根據(jù)CLP 5'端序列合成的引物RL進行二溫式PCR擴增。采用優(yōu)化后的TAIL-PCR，分別擴增獲得創(chuàng)傷弧菌rpoB基因的3044和4055 bp片段、溶藻弧菌轉座酶基因的3820 bp片段、霍亂弧菌sto基因的1632 bp片段。該方法較TAIL-PCR和SiteFinding-PCR更簡便快速，且特異性強，但由于沒有任何一條CLP可同時擴增出上述基因片段，即要求在擴增不同樣品基因時需分別設計引物。此外，Wu等（2015）設計22條簡并引物從T-DNA插入突變體庫中擴增T-DNA插入位點，結果證實使用較多的AD可將TAIL-PCR成功率從39.0%提升至69.0%，對于仍難以擴增的樣品，可結合高通量測序獲得其插入位點的側翼序列。

可見，TAIL-PCR引物的篩選優(yōu)化主要是通過設計較長或較多的簡并引物，但簡并引物的設計需要參考生物密碼子的偏好性。Terauchi和Kahl（2000）、Qiu等（2008）使用商品化的RAPD為簡并引物，通過調(diào)整反應條件，成功分離獲得山藥Pal和Pgi的5'區(qū)域及小麥X基因5'端未知1077 bp的側翼序列。TAIL-PCR中AD的3'端是3～4個確定序列的堿基，是決定擴增能否進行的關鍵。在已知基因序列中尋找與AD 3'端3～4個堿基完全相同的基因序列不難，李道恒等（2013）利用該原則，以已知基因序列為基礎，設計可同時作為特異引物和簡并引物的引物，并通過單引物擴增獲得轉基因水稻的2個插入位點，同時將反應條件修改為5個低特異性反應及30個較高特異性反應，極大簡化了引物設計、節(jié)省了反應時間。 此外，在簡并引物設計方面，Hecht等（2010）、Teixeira等（2011）、Guimaro等（2014）依據(jù)克氏錐蟲感染人體后基因組主要插入人類染色體還原轉座酶LINE-1的特點，分別針對插入基因和被插入基因的保守區(qū)域設計特異引物取代AD，有效減少了簡并堿基的使用，且將第3輪擴增簡化為普通PCR。

3. 2 反應條件優(yōu)化

雖然經(jīng)典TAIL-PCR可滿足許多樣品的擴增要求，但特定條件下，優(yōu)化反應條件可獲得更理想的效果。在Liu和Whittier（1995）建立的TAIL-PCR中，低嚴謹性循環(huán)的退火溫度為30 ℃，保持3 min后緩慢升至72 ℃，但在實際應用中較多選用25 ℃為退火溫度（王寶維等，2010；Wada et al.，2014），也有研究將其調(diào)整為28 ℃（孫科軍等，2012），或選擇快速升溫至72 ℃（孔慶然等，2009；Huang et al.，2010）。潘華奇等（2009）在克隆鴨腸炎病毒時，為充分變性而將變性溫度升高至98 ℃。He等（2010）在擴增豬APC10基因時，去除第1輪擴增中的10個低特異性循環(huán)?？梢?，各種反應條件的優(yōu)化均與物種基因組的復雜性、引物的簡并和特異性等有關。

TAIL-PCR的AD中GC含量低于50%，且Tm較低，對擴增高GC含量的樣品非常不利。為此，Zhou等（2010）建立了GC TAIL-PCR，即根據(jù)放線菌屬GC含量在51%～70%及其木聚糖酶CDS中密碼子第3位通常是G/C的特點，設計12條GC含量在50%～85%的GCAD及6條特異性引物；其擴增程序則根據(jù)GCAD Tm較高的特點，分別將高、低和較低特異性反應中退火溫度升高至70、30和50 ℃，并使用GC Buffer，擴增出常規(guī)AD無法擴增的木聚糖酶1089 bp的基因片段和4個高GC含量的基因片段。這為擴增高GC含量的基因片段提供了技術支撐。

為提高反應特異性，Lin等（2014）通過分析已知基因和基因組的序列特征，選用EcoR I和Hind III酶切基因組為模板，優(yōu)化后的TAIL-PCR能從轉基因山羊中擴增獲得4個IGF-1的插入位點，與經(jīng)典TAIL-PCR相比，其成功率明顯提高。在從大量、復雜的環(huán)境樣品中擴增含量極低的基因時，Huang等（2010）將第1輪擴增拆分為兩步：先用特異性引物進行80個循環(huán)的單引物擴增，增加目的基因的拷貝數(shù)，然后加入簡并引物完成后續(xù)擴增，通過此法成功從波爾山羊和荷斯坦奶牛的瘤胃液及紙漿廠的廢水中擴增獲得GH10、GH11和PTP-like植酸酶基因。

3. 3 與其他方法聯(lián)合使用

TAIL-PCR可通過已知基因擴增其未知的側翼序列，因此已知基因序列獲得是TAIL-PCR的基礎。Wang等（2011a）在擴增冬蟲夏草的微衛(wèi)星標記時，先應用ISSR-PCR擴增獲得基因序列，再據(jù)此設計引物，通過TAIL-PCR獲得完整基因序列，從48份樣品中擴增出30個微衛(wèi)星標記，可用于冬蟲夏草群體遺傳學和保護生物學研究。Bushley等（2013）先通過簡并PCR擴增冬蟲夏草DNA裂解酶基因、MAT1-1-1的α-box和MAT1-1-3的HMG-box，然后通過TAIL-PCR和Long-rang PCR擴增獲得各基因間的未知區(qū)域序列，并將基因片段連接起來，最終獲得冬蟲夏草MAT1-1的基因座。Wada等（2014）通過Exon Array在急性T淋巴細胞白血病細胞系T-ALL中查找到3個融合基因，然后結合EST數(shù)據(jù)庫在24個乳腺癌細胞系和20個胰腺癌細胞系中搜索到7個可能的融合基因，最終通過TAIL-PCR進行驗證，證實了其中3個融合基因。

在擴增雙拷貝基因及其側翼序列時，Zhang等（2012）先用Southern blotting選擇EcoR I酶切基因組，然后以反向PCR將雙拷貝的側翼序列區(qū)分開，根據(jù)反向PCR結果，采用TAIL-PCR擴增未知的側翼序列，成功獲得棉花可育胞質(zhì)和不可育胞質(zhì)線粒體雙拷貝atpA基因的所有EcoR I（2.2～5.1 kb）和Hind III（8.5～

11.7 kb）限制片段。在進行較長片段的染色體步移時，Chen等（2016）、Zha等（2016）采用3'-RACE獲得目的基因的部分序列，結合EST或GenBank數(shù)據(jù)庫設計SP，分別通過多次TAIL-PCR、hiTAIL-PCR向5端方向進行染色體步移，直至獲得武昌魚PHD1、PHD3的5'端啟動子和露珠杜鵑花蜜中幾丁質(zhì)酶Rhchi2和Rhchi3的cDNA全長序列。

綜上所述，生物信息學和分子生物技術的發(fā)展使得PCR擴增未知基因變得越來越高效、簡便。根據(jù)基因保守區(qū)采用簡并PCR、基因數(shù)據(jù)庫查找及其他方法可快速獲得基因片段，用作TAIL-PCR的基礎。

4 TAIL-PCR在畜牧獸醫(yī)中的應用現(xiàn)狀及發(fā)展前景

4. 1 TAIL-PCR在畜牧獸醫(yī)中的應用現(xiàn)狀

目前，TAIL-PCR在畜牧獸醫(yī)中主要用于已知基因側翼克隆和轉基因動物模型外源基因插入位點確定。潘華奇等（2009）采用包括TAIL-PCR在內(nèi)的多種PCR克隆鴨腸炎病毒gB基因；劉峰源等（2009）根據(jù)GenBank中鴨腸炎病毒UL45基因設計特異性引物，以TAIL-PCR擴增獲得gC基因全長和UL43基因部分序列，并進一步證實鴨腸炎病毒的系統(tǒng)發(fā)育分類。在病原基因分離方面，馬春驥等（2011）利用同源克隆和TAIL-PCR擴增獲得綿羊肺炎支原體Y98株熱休克蛋白Hsp70長2481 bp的基因序列，其中包含1815 bp的開放閱讀框，為綿羊肺炎支原體的抗原、Hsp70功能研究打下了基礎。在微生物基因克隆方面，王寶維等（2010）采用TAIL-PCR擴增獲得鵝源草酸青霉F64 CBHI基因序列全長，且從草酸青霉中克隆出一種新的膨脹素樣蛋白POSWOI全長基因（Kang et al.，2013），為纖維素類生物質(zhì)的高效生物轉化開辟了新途徑。

動物體內(nèi)的某些基因通常與疾病發(fā)生和機體生長發(fā)育有密切關系，尤其是基因的啟動子區(qū)域。如甘露聚糖結合凝集素基因是機體天然免疫系統(tǒng)的重要組成，通過激活補體系統(tǒng)參與構成抗感染第一道防線。余鵬等（2011）利用TAIL-PCR擴增獲得綿羊甘露聚糖結合凝集素基因啟動子區(qū)，為研究該基因的表達調(diào)控和啟動子區(qū)甲基化提供了支持；孫科軍等（2012）通過TAIL-PCR和PCR克隆獲得的斑鱖肌肉生長抑制素基因及其啟動子序列，為研究斑鱖肌肉生長和發(fā)育調(diào)控打下了基礎；Zhou等（2014）克隆獲得S100A6啟動子區(qū)的NF-κB結合位點，并證實豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染細胞后可通過多種途徑激活NF-κB通路。

轉基因動物中，外源基因定位和拷貝數(shù)的確定與基因表達、基因穩(wěn)定性、生產(chǎn)性能和安全評價等存在直接關系，也是建立轉基因動物模型后的首要檢測步驟之一?？讘c然等（2009）、Lin等（2014）采用qPCR和TAIL-PCR代替?zhèn)鹘y(tǒng)的Southern blotting分別鑒定外源基因在IGF-1轉基因羊和綠色熒光蛋白轉基因豬中的拷貝數(shù)和整合位點，成功建立了轉基因動物鑒定體系。Wang等（2012）利用TAIL-PCR檢測肝臟特異性表達分泌型IgD轉基因小鼠中目的基因插入位點，但發(fā)現(xiàn)外源基因的插入并未破壞位于小鼠5號染色體上的甲羥戊酸激酶（MVK）基因，即高IgD綜合征發(fā)病機理尚有待進一步探究。除轉基因動物外源基因定位外，也有通過TAIL-PCR確定外源基因在宿主基因組中插入位點的研究。Bi等（2013）和王毅（2013）分別制備鏈霉菌屬噬菌體PhiC31整合酶表達載體，轉染豬腎PK15細胞和山羊胎兒成纖維細胞，然后通過TAIL-PCR篩選定向整合到宿主基因的Pseudo attP位點；Huang等（2014）為鑒定構建的通用型細胞永生化載體元件功能，將細胞永生化載體轉染至HEK293細胞，并通過TAIL-PCR確定該載體是以轉座整合的方式插入宿主基因組中。

4. 2 TAIL-PCR在畜牧獸醫(yī)中的發(fā)展前景

近年來，畜牧獸醫(yī)業(yè)快速發(fā)展，動物品種改良、動物微生物學和病原學、食品安全檢測及利用轉基因動物生產(chǎn)珍貴蛋白、進行基因治療和建立疾病模型等均涉及染色體步移。相對于其他以PCR為基礎的染色體步移技術，TAIL-PCR對DNA的質(zhì)量和用量要求相對較低，同時克服了連接、酶切等的限制，且隨著方法的不斷改進，其操作更簡便、步移長度更長、成功率更高，因此TAIL-PCR在畜牧獸醫(yī)中的應用將進一步擴大。但由于基因組DNA的龐大和復雜性，使得從基因組中克隆目的基因仍存在諸多限制因素，如特異性引物錯配和隨機引物結合位點不確定，易造成非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生；模板GC含量異?；虼嬖诟叨戎貜托蛄袝r，即使使用多種簡并引物也難以獲得陽性產(chǎn)物；此外，復雜的反應條件給TAIL-PCR優(yōu)化也帶來一定困難。因此，應根據(jù)實際情況對TAIL-PCR進行靈活調(diào)整。當模板較復雜時，可借鑒連接介導PCR原理，給引物加上接頭，提高反應的特異性；當模板較簡單或序列較清晰時，可根據(jù)模板特點（如高GC含量）或已知模板序列設計引物、調(diào)整反應條件，增加操作的簡便性；還可參考Suppression-PCR原理，選擇引物和反應條件，獲得較長的擴增片段。此外，隨著生物信息學的發(fā)展及分子生物學技術的改進和新技術的出現(xiàn)，TAIL-PCR可與多種技術聯(lián)合使用，發(fā)揮各自優(yōu)勢，更快速、高效地完成檢測目標，進而促使TAIL-PCR在畜牧獸醫(yī)中獲得更廣泛深入的應用。

參考文獻：

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（責任編輯 蘭宗寶）