二穗短柄草鈣依賴型蛋白激酶基因BdCDPK14克隆及表達(dá)分析

韋淑亞 趙旭東 楊廣笑 何光源

摘要：【目的】克隆分析二穗短柄草鈣依賴型蛋白激酶（CDPK）基因BdCDPK14，并檢測其在干旱脅迫下的表達(dá)量，為揭示鈣依賴型蛋白激酶的抗旱調(diào)控機(jī)制打下基礎(chǔ)?！痉椒ā扛鶕?jù)NCBI檢索結(jié)果設(shè)計(jì)特異引物，以二穗短柄草cDNA為模板，采用PCR擴(kuò)增二穗短柄草CDPK基因家族成員BdCDPK14，利用在線分析軟件對(duì)BdCDPK14基因編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并采用RT-PCR檢測PEG-6000干旱脅迫下的BdCDPK14基因表達(dá)量?！窘Y(jié)果】從二穗短柄草葉片中克隆獲得的BdCDPK14基因（GenBank登錄號(hào)XM_003564390）片段長度1750 bp，其開放閱讀框（ORF）1545 bp，編碼514個(gè)氨基酸，其編碼蛋白分子量56.78 kD，理論等電點(diǎn)5.45，脂肪指數(shù)78.21，不穩(wěn)定指數(shù)38.66，屬于穩(wěn)定蛋白。BdCDPK14蛋白與小麥TaCPK13蛋白（ABY59018）的親緣關(guān)系最近，含有4個(gè)EF-hands結(jié)構(gòu)、蛋白酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域、脂多糖激酶家族、ATP結(jié)合區(qū)域、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶激活區(qū)和預(yù)測跨膜區(qū)等結(jié)構(gòu)域，主要由無規(guī)卷曲和α-螺旋構(gòu)成，位于葉綠體和細(xì)胞質(zhì)膜上。在PEG-6000干旱脅迫下，BdCDPK14基因在脅迫3 h內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量無明顯變化，脅迫6 h后相對(duì)表達(dá)量開始升高，至脅迫12 h時(shí)的相對(duì)表達(dá)量最高?！窘Y(jié)論】克隆獲得的BdCDPK14基因?yàn)槎攵瘫軨DPK基因家族成員之一，參與其抗干旱脅迫反應(yīng)，可作為候選基因用于二穗短柄草抗旱機(jī)制研究。

關(guān)鍵詞： 二穗短柄草；BdCDPK14基因；克??；生物信息學(xué)分析；干旱脅迫；表達(dá)

中圖分類號(hào)： Q949.714.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）05-0761-07

0 引言

【研究意義】二穗短柄草（Brachypodium distachyon）是一種溫帶禾本科植物，是用于研究小麥、水稻作物新型模式植物的理想植株，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。鈣依賴型蛋白激酶（CDPK）為單肽鏈，在結(jié)構(gòu)上具有明顯的特征，從N端到C端存在4個(gè)功能區(qū)（可變區(qū)、催化區(qū)、連接區(qū)和調(diào)控區(qū)），是鈣離子（Ca2+）信號(hào)通路中的重要成員，在植物抗逆境脅迫中發(fā)揮重要作用（陳飛等，2013；韋淑亞等，2013）。因此，克隆研究二穗短柄草CDPK相關(guān)基因，對(duì)揭示其在作物抗干旱中的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】自CDPK首次在大豆中得到純化和鑒定（Harmon et al.，1987）以來，陸續(xù)在水稻、擬南芥、楊樹、小麥等物種中發(fā)現(xiàn)CDPKs成員（Kong et al.，2013；Zuo et al.，2013）。CDPKs是一個(gè)基因家族，至今擬南芥中有34個(gè)、水稻中有29個(gè)、玉米中有40個(gè)、大麥中有27個(gè)CDPKs基因已被鑒定（Cheng et al.，2002；Asano et al.，2005；Fedorowicz- Strońska et al.，2016）。植物CDPKs在與Ca2+結(jié)合后被激活，通過磷酸化下游的底物而啟動(dòng)植物體內(nèi)的一系列生理生化反應(yīng)，包括植物生長發(fā)育、調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)、調(diào)節(jié)碳氮和能量代謝、光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物的耐鹽抗旱性及超敏反應(yīng)等（Romeis et al.，2001；Krupa et al.，2006；Wei et al.，2014）。過表達(dá)OsCPK9基因的轉(zhuǎn)基因水稻可顯著提高對(duì)干旱的耐受性，其原因是OsCPK9轉(zhuǎn)基因植株對(duì)脫落酸更敏感，而OsCPK9基因干擾轉(zhuǎn)基因植株對(duì)脫落酸的敏感性無明顯變化，說明OsCPK9基因通過調(diào)控依賴ABA信號(hào)的傳導(dǎo)途徑增強(qiáng)植物對(duì)干旱脅迫的耐受性（Wei et al.，2014）。此外，擬南芥過表達(dá)CPK10基因能提高其對(duì)干旱脅迫的耐受性，作用機(jī)理是CPK10基因通過依賴ABA和Ca2+調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)而提高對(duì)干旱脅迫的耐受性（Zou et al.，2010）；玉米過表達(dá)ZmCPK12基因也可提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)鹽和干旱的耐受性（Wang and Song，2013）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】CDPKs在擬南芥、水稻和玉米等植物中參與抗干旱脅迫的研究已有報(bào)道，但針對(duì)新型禾本科植物二穗短柄草CDPKs基因（BdCDPKs）的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過克隆BdCDPK14基因，利用蛋白在線分析軟件對(duì)其編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析和結(jié)構(gòu)功能預(yù)測，并比對(duì)分析干旱脅迫下BdCDPK14基因的表達(dá)情況，為揭示CDPKs的抗旱調(diào)控機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

二穗短柄草二倍體近交系Bd21種子由華中科技大學(xué)中英聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室保存提供，大腸桿菌（Escherichia coli）Top10菌株、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及質(zhì)粒小量提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，pMD18-T載體和PrimeStar HS DNA Polymerase購自TaKaRa公司，植物總RNA提取試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司、2×Es Taq Master Mix（含染料）購自北京康為世紀(jì)生物有限公司、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 干旱脅迫處理 挑選優(yōu)良的二穗短柄草Bd21種子置于鋪有無菌水浸濕濾紙的干凈培養(yǎng)皿中，22 ℃暗培養(yǎng)1周左右，待種子發(fā)芽后移種至花盆，置于人工氣候室中培養(yǎng)4周左右，挑取生長狀況良好且長勢(shì)一致的植株，用20% PEG-6000向幼苗葉片噴灑及根部澆灌模擬干旱脅迫，以未經(jīng)PEG-6000干旱脅迫為對(duì)照。干旱脅迫處理0、1、3、6和12 h后，分別剪取二穗短柄草幼苗葉片放入2.0 mL無菌離心管中，液氮迅速冷凍后存放于-80 ℃冰箱中，供RNA提取使用。

1. 2. 2 總RNA提取及cDNA合成 二穗短柄草葉片總RNA提取按照植物RNA提取試劑盒說明進(jìn)行操作。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后的完整RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，備用。

1. 2. 3 引物合成及半定量RT-PCR 從數(shù)據(jù)庫NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）獲得目的基因BdCDPK14（GenBank登錄號(hào)XM_003564390）的全長cDNA序列信息，根據(jù)序列信息，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，BdCDPK14基因全長引物序列（F：5'-CT

TGCGTTGCGTGCCGACCAG-3'，R：5'-GGCCTCTTT

CCTTCCTTCCCT-3'）、actin基因（內(nèi)參基因）引物（F：5'-CCCGATGGACAGGTTATCACTA-3'，R：5'-ATAG

AGCCACCAATCCAAACAC-3'）和BdCDPK14基因半定量RT-PCR特異性引物（F：5'-CTACACCGCGTTCC

AGTACTTCGAC-3'，R：5'-CTGGCTGCTCGCCTCCT

CGGTT-3'）均由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。全長基因PCR擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃ 10 s，66 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。半定量RT-PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行28個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。重復(fù)3次。用1.2%瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物，并送至武漢擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1. 2. 4 BdCDPK14蛋白進(jìn)化分析 利用NCBI數(shù)據(jù)庫信息進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，并使用DNAMAN對(duì)BdCDPK14與其他物種中同源性較高的CDPKs進(jìn)行多序列比對(duì)分析。為進(jìn)一步研究BdCDPK14與其他同源CDPKs間的進(jìn)化關(guān)系，以MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 2. 5 BdCDPK14蛋白序列生物信息分析 利用生物軟件和在線工具對(duì)BdCDPK14蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，主要包括理化性質(zhì)、疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、三級(jí)結(jié)構(gòu)等。其中，蛋白生理生化信息分析使用http：//web.expasy.org/protparam/，分析蛋白疏水性使用Hphob./Kyte & Doolittle法：http：//web.expasy.org/

protscale/），二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測（PSIPRED v3.3）http：//

bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/，保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測http：//

plantsp.genomics.purdue.edu/index.html，三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測http：//swissmodel.expasy.org/。用TargetP和WoLFPSort對(duì)BdCDPK14基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 BdCDPK14基因克隆結(jié)果

以二穗短柄草Bd21幼苗mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示獲得約1750 bp的目的條帶（圖1），與BdCDPK14基因（GenBank登錄號(hào)XM_ 003564390）的預(yù)期擴(kuò)增一致，可以用于后續(xù)研究。

2. 2 BdCDPK14蛋白結(jié)構(gòu)及生物信息學(xué)分析結(jié)果

2. 2. 1 BdCDPK14基因編碼蛋白的同源性分析結(jié)果

將小麥TaCPK13（ABY59018），水稻OsCPK2（NP_

001044575）、OsCPK14（EEE64198）、OsCPK25（NP_00

1065691）和OsCPK26（ABA95733），擬南芥AtCPK17（NP_196779）和AtCPK34（NP_197437），楊樹PtCDPK29

（XP_002299975）和PtCDPK30（XP_002313265）與BdCDPK14蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)分析，結(jié)果如圖2所示，深藍(lán)色區(qū)域代表目的蛋白與同源蛋白完全相同的氨基酸序列，粉色和淺藍(lán)色區(qū)域代表相似的氨基酸序列。通過箭頭和橫線標(biāo)示出N端可變區(qū)、蛋白激酶區(qū)、自抑制區(qū)、EF-hands、類似鈣調(diào)素結(jié)構(gòu)域。采用MEGA 5.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BdCDPK14蛋白與小麥TaCPK13的親緣關(guān)系最近（圖3）。綜上所述，擴(kuò)增獲得的BdCDPK14基因的確是二穗短柄草CDPK基因家族成員之一，且與禾谷類小麥CDPKs有較高的同源性。

2. 2. 2 BdCDPK14蛋白理化性質(zhì)及疏水性分析結(jié)果

采用在線軟件（http：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)BdCDPK14基因編碼蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，BdCDPK14基因的開放閱讀框（ORF）1545 bp，共編碼514個(gè)氨基酸。其中，含谷氨酸殘基（Glu）43個(gè)，含量最高（8.4%）；色氨酸殘基（Trp）4個(gè)，含量最低（0.8%）；不含吡咯賴氨酸殘基（Pyl）和硒半胱氨酸殘基（Sec）。BdCDPK14蛋白的氨基酸殘基組成及百分比詳見表1。

BdCDPK14蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量56.78 kD，分子式C2489H3964N694O775S24，總原子數(shù)7946，理論等電點(diǎn)5.45，脂肪指數(shù)78.21，不穩(wěn)定指數(shù)38.66，屬于穩(wěn)定蛋白。按照Hphob./Kyte & Doolittle法分析該蛋白的疏水性，其總平均親水性系數(shù)為-0.451，為親水蛋白，蛋白序列的親/疏水性分析結(jié)果如圖4所示。

2. 2. 3 BdCDPK14蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析結(jié)果 采用在線工具（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）對(duì)BdCDPK14蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，如圖5所示。圖中紅色表示α-螺旋，黃色表示β-折疊，直線表示無規(guī)卷曲，藍(lán)色代表可信度。預(yù)測結(jié)果顯示，BdCDPK14蛋白所含的二級(jí)結(jié)構(gòu)類型中無規(guī)卷曲和α-螺旋含量較高，是該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要元件。

2. 2. 4 BdCDPK14蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果 采用在線工具（http：//plantsp.genomics.purdue.edu/index.html）對(duì)BdCDPK14蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，BdCDPK14蛋白含有4個(gè)EF-hands結(jié)構(gòu)、蛋白酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域、脂多糖激酶家族、ATP結(jié)合區(qū)域、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶激活區(qū)和預(yù)測跨膜區(qū)等結(jié)構(gòu)域，各結(jié)構(gòu)域的分布情況及對(duì)應(yīng)的蛋白序列如圖6所示。

2. 2. 5 BdCDPK14蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果 采用在線工具（http：//swissmodel.expasy.org/）對(duì)BdCDPK14蛋白同源建模，預(yù)測其三級(jí)結(jié)構(gòu)，BdCDPK14蛋白以弓漿蟲一種CDPK突變體為模板，建立的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型如圖7所示。該蛋白主要由無規(guī)卷曲和α-螺旋構(gòu)成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果基本一致。

2. 2. 6 BdCDPK14基因編碼蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果 采用TargetP和WoLFPSort對(duì)BdCDPK14基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，BdCDPK14蛋白主要位于葉綠體和細(xì)胞質(zhì)膜上，位于細(xì)胞核、液泡或作為細(xì)胞骨架的可能性較小，即該蛋白可能主要在胞質(zhì)膜和葉綠體中發(fā)揮作用。

2. 3 BdCDPK14基因表達(dá)分析結(jié)果

對(duì)干旱脅迫下BdCDPK14基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖8所示。BdCDPK14基因在脅迫3 h內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量無明顯變化，脅迫6 h后相對(duì)表達(dá)量開始升高，至脅迫12 h時(shí)的相對(duì)表達(dá)量最高。BdCDPK14基因的表達(dá)受干旱脅迫誘導(dǎo)，因此推測BdCDPK14基因參與二穗短柄草的抗干旱脅迫反應(yīng)。

3 討論

逆境脅迫會(huì)引起植物細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化，植物中的CDPKs（Ca2+結(jié)合蛋白）會(huì)識(shí)別這些復(fù)雜的Ca2+信號(hào)，并將Ca2+信號(hào)進(jìn)一步向下游級(jí)聯(lián)放大和傳遞，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)磷酸化和脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，以提高植物對(duì)逆境脅迫的耐受性（姜珊珊等，2013）。CDPK作為Ca2+信號(hào)通路中的重要成員，在信號(hào)通路中占據(jù)關(guān)鍵位置。二穗短柄草具有遺傳背景簡單、基因組?。s272 Mb）、染色體基數(shù)5條及遺傳資源豐富等優(yōu)點(diǎn)，已成為禾本科植物功能基因組分析的重要工具。每個(gè)CDPK家族成員從肽鏈的N端到C端均由一個(gè)同源性最低的N末端可變區(qū)、一個(gè)同源性較高的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域（催化區(qū)）、一個(gè)最保守的自我抑制區(qū)（連接區(qū)）和保守性最差的鈣調(diào)素樣結(jié)構(gòu)域（調(diào)控區(qū)）等4個(gè)功能區(qū)組成（Harmon et al.，2000）。本研究從二穗短柄草中成功克隆獲得BdCDPK14基因，該基因編碼的氨基酸序列具有CDPK的基本特征，與其他物種中的CDPK家族成員具有較高的一致性，其中與小麥TaCPK13蛋白的親緣關(guān)系最近。CDPKs的N端可變區(qū)包含豆蔻?；妥貦磅；奈稽c(diǎn)，可能負(fù)責(zé)與膜結(jié)合，在細(xì)胞定位方面發(fā)揮著重要作用（Li et al.，2008）。以TargetP和WoLFPSort兩種軟件預(yù)測BdCDPK14基因編碼蛋白，發(fā)現(xiàn)BdCDPK14蛋白主要在胞質(zhì)膜和葉綠體中發(fā)揮作用，與ACPK1定位在細(xì)胞膜和葉綠體上（Chehab et al.，2004）的結(jié)果一致。

CDPK對(duì)植物非生物脅迫呈正調(diào)節(jié)作用，被認(rèn)為是抗性育種的候選基因（Asano et al.，2012；Zhao et al.，2015）。水稻OsCDPK7基因能夠被高鹽和低溫脅迫誘導(dǎo)，過表達(dá)的OsCDPK7基因通過調(diào)控脅迫相關(guān)基因的表達(dá)而增強(qiáng)植物對(duì)高鹽和干旱的耐受性，但過表達(dá)OsCDPK7基因能否增強(qiáng)植物對(duì)低溫的耐受性有待進(jìn)一步探究（Saijo et al.，2000）；水稻OsCPK9基因也能被干旱脅迫誘導(dǎo)，過表達(dá)OsCPK9基因通過增強(qiáng)氣孔關(guān)閉、調(diào)節(jié)滲透平衡和依賴ABA的信號(hào)傳導(dǎo)途徑提高植物對(duì)干旱脅迫的耐受性（Wei et al.，2014）；胡楊PeCPK10基因的過表達(dá)能促使氣孔關(guān)閉而顯著提高植物對(duì)干旱的耐受性，組成型表達(dá)PeCPK10基因則顯著增強(qiáng)ABA/非生物脅迫相關(guān)基因的表達(dá)（Chen et al.，2013）?？梢?，CDPK家族基因在植物對(duì)非生物逆境脅迫應(yīng)答的信號(hào)傳導(dǎo)過程中扮演著重要角色。植物響應(yīng)脅迫應(yīng)答的信號(hào)通路極其復(fù)雜，各種通路正在不斷地被研究完善。Wang等（2016）將CDPK的研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向其作用底物，發(fā)現(xiàn)水稻OsCDPK14能磷酸化下游底物OsDi19-4，而被磷酸化后的OsDi19-4參與了ABA相關(guān)基因的調(diào)控表達(dá)。本研究利用20% PEG-6000對(duì)二穗短柄草進(jìn)行干旱脅迫，并檢測BdCDPK14基因的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BdCDPK14基因可被干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，說明BdCDPK14可能是二穗短柄草對(duì)干旱脅迫應(yīng)答的正調(diào)控因子。該結(jié)論為進(jìn)一步鑒定BdCDPK14蛋白基因在非生物逆境脅迫中的功能、參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及BdCDPK14與下游蛋白互作模式研究打下了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

克隆獲得的BdCDPK14基因?yàn)槎攵瘫軨DPK基因家族成員之一，參與其抗干旱脅迫反應(yīng)，可作為候選基因用于二穗短柄草抗旱機(jī)制研究。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）