蟲生廣布擬盤多毛孢侵染對(duì)松突圓蚧海藻糖酶活性、海藻糖、葡萄糖和蛋白質(zhì)含量的影響

王莎莎 何錦華 羅世念 彭鋒 羅林 黃寶靈 呂成群

摘要：【目的】探究蟲生廣布擬盤多毛孢對(duì)松突圓蚧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的影響，為深入研究廣布擬盤多毛孢致死松突圓蚧機(jī)理及開發(fā)利用廣布擬盤多毛孢防治松突圓蚧提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā恳韵x生廣布擬盤多毛孢GXSTYJ03菌株制得濃度為1×107個(gè)孢子/mL的孢子懸浮液感染松突圓蚧，以噴灑無(wú)菌吐溫-80為對(duì)照，逐日測(cè)定松突圓蚧體內(nèi)海藻糖、葡萄糖、蛋白質(zhì)含量及海藻糖酶活性，連續(xù)測(cè)定8 d。【結(jié)果】處理組松突圓蚧海藻糖含量在各時(shí)間點(diǎn)均低于對(duì)照組，且隨處理時(shí)間延長(zhǎng)呈明顯的下降趨勢(shì)，在染菌3 d后顯著低于對(duì)照組（P<0.05，下同）；海藻糖酶活性在各時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組，在染菌后第3 d顯著高于對(duì)照組，5 d后也一直顯著高于對(duì)照組；葡萄糖含量在染菌后1～3 d迅速升高，第3 d時(shí)升至最大值（3.1479 mmol/L），隨后逐漸降低，在第4～6 d時(shí)與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P>0.05），6 d后顯著低于對(duì)照組；蛋白質(zhì)含量在各時(shí)間點(diǎn)均低于對(duì)照組，且在染菌2 d后一直顯著或極顯著（P<0.01）低于對(duì)照組?！窘Y(jié)論】蟲生廣布擬盤多毛孢GXSTYJ03菌株侵染松突圓蚧過程中引起松突圓蚧體內(nèi)海藻糖、葡萄糖和蛋白質(zhì)含量一定程度降低，是致死松突圓蚧的原因之一。

關(guān)鍵詞： 蟲生廣布擬盤多毛孢；松突圓蚧；海藻糖；葡萄糖；海藻糖酶；蛋白質(zhì)

中圖分類號(hào)： S763.306.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）05-0820-05

Influence of Entomogenous Pestalotiopsis disseminata on trehalase activity， trehalose content， glucose content and

protein content in Hemiberlesia pitysophila Takagi

WANG Sha-sha1， HE Jin-hua2， LUO Shi-nian2， PENG Feng 2， LUO Lin 3，

HUANG Bao-ling 1， LYU Cheng-qun1 *

（1 College of Forestry， Guangxi University， Nanning 530004， China； 2 Yulin Forest Pest Control Quarantine Station， Yulin， Guangxi 537000， China； 3 Yuzhou Forest Pest Control Quarantine Station， Yulin， Guangxi 537000， China）

Abstract：【Objective】Influence of Entomogenous Pestalotiopsis disseminata on nutrients metabolism of Hemiberlesia pitysophila Takagi was studied， in order to provide reference for mechanism of Entomogenous P. disseminata causing H. pitysophila Takagi dead and using Entomogenous P. disseminata to control H. pitysophila Takagi. 【Method】Entomogenous P. disseminata GXSTYJ03 strain was utilized to make the spore suspension of 1×107 spores/mL and infected H. pitysophila Takagi. Spraying sterile Tween was taken as control（CK） Contents of trehalose， glucose， protein and trehalase activity in H. pitysophila Takagi were detected for eight consecutive days. 【Result】At all measurement times， trehalose content of treatment group were lower than that of CK group， as treatment time extended， trehalose content of treatment group declined and was significantly lower than that of CK group 3 d after infection（P<0.05， the same below）. At all measurement times， trehalase activity of treatment group were higher than that of CK group， and was significantly higher on day 3 of infection and 5 d after infection. Glucose content increased rapidly 1-3 d after infection and reached the peak（3.1479 mmol/L） on day 3， then declined gradually， and the difference with CK group was insignificant on 4-6 d（P>0.05）， and significantly lower than that of CK group after 6 d. Protein content of treatment group was lower than that of CK group at all measurement times， and was at significant or extremely significant level（P<0.01） 2 d after infection. 【Conclusion】When Entomogenous P. disseminata GXSTYJ03 strain infecting H. pitysophila Takagi， trehalose， glucose and protein content decrease sharply， which is one of the lethal reasons.

Key words： Entomogenous Pestalotiopsis disseminata； Hemiberlesia pitysophila Takagi； trehalose； glucose； trehalase； protein

0 引言

【研究意義】松突圓蚧（Hemiberlesia pitysophila Takagi）又名松櫛盾蚧，屬同翅目（Homoptera）蚧總科（Cocoidea）盾蚧科（Diaspidae）突圓蚧屬（Hemiberlesia Cockerell）昆蟲，是嚴(yán)重危害松屬植物的害蟲（Takagi，1969；Takagi and Tang，1982）。近年來，利用蟲生廣布擬盤多毛孢（Entomogenous pestalotiopsis disseminata）制成生防菌劑防治松突圓蚧取得了理想的效果（方麗英等，2007；黃寶靈等，2009；Lü et al.，2011），但部分地區(qū)松突圓蚧危害范圍仍以一定速度繼續(xù)擴(kuò)增。因此，深入研究蟲生廣布擬盤多毛孢對(duì)松突圓蚧的致病機(jī)制，能為開發(fā)具有強(qiáng)效、持久、安全防治松突圓蚧的廣布擬盤多毛孢菌株提供科學(xué)依據(jù)，促使該項(xiàng)生物防治技術(shù)的推廣應(yīng)用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】方麗英等（2007）從自然死亡的松突圓蚧死尸上分離得到蟲生廣布擬盤多毛孢并將其制成生防菌防治松突圓蚧，發(fā)現(xiàn)以生防菌防治松突圓蚧的效果顯著，其致死率遠(yuǎn)高于松突圓蚧自然死亡率。但在生防菌制備過程中無(wú)法避免蟲生真菌退化現(xiàn)象，菌株的退化會(huì)嚴(yán)重影響防治效果，因此郭麗娟等（2014）對(duì)蟲生廣布擬盤多毛孢GXSTYJ03菌株的退化原因進(jìn)行研究，明確了影響該菌株退化的主要因素及菌株復(fù)壯的最佳方法，為大批量生產(chǎn)菌粉劑提供了技術(shù)保障。黃蓉等（2014）、呂成群等（2014）探討蟲生廣布擬盤多毛孢GXSTYJ03侵染對(duì)松突圓蚧胞外酶作用及對(duì)松突圓蚧酚氧化酶原系統(tǒng)的影響，掌握了該菌株的生物學(xué)特性，分析了影響蟲生廣布擬盤多毛孢對(duì)松突圓蚧致病的毒力因子，明確菌株孢子懸浮液1×107個(gè)孢子/mL是酶制劑生產(chǎn)和病蟲害防治的最佳使用量，以及松突圓蚧對(duì)蟲生廣布擬盤多毛孢侵染的免疫反應(yīng)。然而昆蟲的免疫反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜體系，會(huì)調(diào)度多種抵抗因子來防御病原真菌入侵，這個(gè)過程會(huì)消耗大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，主要表現(xiàn)為海藻糖、葡萄糖和蛋白質(zhì)含量發(fā)生變化。薛皎亮等（2006）對(duì)油松毛蟲感染白僵菌后體內(nèi)蛋白質(zhì)變化情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)感染白僵菌1～8 d后蟲體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量持續(xù)下降。熊琦（2013）研究發(fā)現(xiàn)，桃小幼蟲在受到球孢白僵菌TST05菌株侵染后，其體內(nèi)的海藻糖和蛋白質(zhì)含量明顯下降，葡萄糖含量呈先升高后下降趨勢(shì)。昆蟲體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要以海藻糖形式存儲(chǔ)，海藻糖存在于昆蟲幾乎所有組織和器官中，利用唯一能將海藻糖分解為葡萄糖的海藻糖酶來供給能量（于彩虹等，2008）。病原真菌菌絲一旦進(jìn)入昆蟲血腔，便利用昆蟲體內(nèi)的物質(zhì)作為營(yíng)養(yǎng)以保證菌絲的生長(zhǎng)和大量繁殖，逐漸感染昆蟲內(nèi)部組織和器官，最終使昆蟲感染死亡。感染導(dǎo)致寄主昆蟲死亡的因素是多方面的，其中，病菌在蟲體內(nèi)大量繁殖，耗盡蟲體的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是導(dǎo)致昆蟲死亡的一個(gè)重要因素（樊金華等，2013）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于蟲生廣布擬盤多毛孢GXSTYJ03菌株的生產(chǎn)及防治松突圓蚧等方面的研究已較完善，但有關(guān)蟲生廣布擬盤多毛孢的致病機(jī)制僅見其侵染可抑制松突圓蚧的酚氧化酶原系統(tǒng)功能，從而克服松突圓蚧免疫反應(yīng)的報(bào)道。目前，關(guān)于蟲生廣布擬盤多毛孢對(duì)松突圓蚧體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝影響的研究尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】逐日測(cè)定感染蟲生廣布擬盤多毛孢GXSTYJ03菌株的松突圓蚧體內(nèi)海藻糖、葡萄糖、蛋白質(zhì)含量及海藻糖酶活性，了解蟲生廣布擬盤多毛孢對(duì)松突圓蚧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的影響，為廣布擬盤多毛孢致死松突圓蚧機(jī)理研究及開發(fā)利用廣布擬盤多毛孢防治松突圓蚧提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試蟲生廣布擬盤多毛孢GXSTYJ03菌株由廣西大學(xué)林學(xué)院黃寶靈研究員提供；供試松突圓蚧采自玉林市玉州區(qū)林場(chǎng)馬尾松林。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 松突圓蚧染菌 參照呂成群等（2014）的方法染菌。先制備GXSTYJ03菌株的1×107個(gè)孢子/mL孢子懸浮液，然后用裝有孢子懸浮液的手動(dòng)噴霧器將菌液噴于帶有松突圓蚧的松針針葉，保證針葉基部葉鞘部分被菌液噴濕。以噴灑無(wú)菌吐溫-80且?guī)в兴赏粓A蚧的松針為對(duì)照組。在20 ℃、濕度95%、14 h/10 h光暗交替條件下室內(nèi)培養(yǎng)。

1. 2. 2 松突圓蚧海藻糖、葡萄糖、蛋白質(zhì)含量及海藻糖酶活性測(cè)定 處理后1～8 d逐日在對(duì)照組和處理組中隨機(jī)取樣，每組取100只松突圓蚧作為一個(gè)樣品，每組3個(gè)樣品作為重復(fù)。用預(yù)冷的1.5 mL 0.2 mol/L的磷酸緩沖液（pH 7.0）冰浴碾磨蟲體，并將勻漿液最終定容至2.0 mL，4800 r/min離心10～15 min，取上清液待測(cè)。

1. 2. 2. 1 海藻糖含量測(cè)定 采用蒽酮法（馮慧，1989）測(cè)定海藻糖含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：先配制海藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液100 mL，濃度為40 mmol/L[稱取海藻糖（Sigma）1.5132 g，以蒸餾水定容]，-70 ℃儲(chǔ)存。用蒸餾水稀釋得7個(gè)濃度梯度，分別為0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80和1.60 mmol/L。取上述溶液100 μL移入10 mL離心管中，加入100 μL 1%硫酸溶液，在90 ℃條件下加熱10 min，冰浴冷卻，再加入100 μL 30%氫氧化鉀溶液，并再次加熱10 min，冰浴冷卻后加入2.5 mL顯色劑[250 mL 80%的硫酸溶液+0.5 g蒽酮（Sigma）]，加熱10 min后冰浴冷卻，立即于630 nm處讀取OD。

海藻糖含量測(cè)定：以待測(cè)提取液100 μL代替標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法進(jìn)行測(cè)定。

1. 2. 2. 2 海藻糖酶活性測(cè)定 采用3，5-二硝基水楊酸法（雷芳等，2006）測(cè)定海藻糖酶活性，并略有改進(jìn)。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：先配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液200 mL，濃度為20 mmol/L（稱取葡萄糖0.79268 g，以蒸餾水定容），-70 ℃儲(chǔ)存。用蒸餾水稀釋，得濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mmol/L的葡萄糖溶液。分別取上述溶液300 μL移入10 mL離心管中，加入300 μL顯色劑[0.5 g 3，5-二硝基水楊酸（Sigma）+0.1 g苯酚+

0.5 g氫氧化鈉+0.025 g無(wú)水亞硫酸鈉，蒸餾水定容至50 mL]于90 ℃條件下加熱5 min，冰浴冷卻，再加入100 μL 40%四水合酒石酸堿鈉水溶液，立即于550 nm處讀取OD。

海藻糖酶活性測(cè)定：用移液槍吸取待測(cè)提取液100 μL于10 mL離心管中，加入200 μL海藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（40 mmol/L），于37 ℃條件下水浴30 min，然后沸水浴2～3 min終止反應(yīng)，冰浴冷卻后加入上述顯色劑，并按照上述方法測(cè)定葡萄糖含量。該葡萄糖為海藻糖酶催化分解海藻糖所形成的葡萄糖。海藻糖酶活性以mmol/L（葡萄糖）·mg（蛋白）·min表示。

1. 2. 2. 3 葡萄糖含量測(cè)定 按試劑盒（南京建成生物工程研究所）操作方法進(jìn)行。

1. 2. 2. 4 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 以牛血清蛋白（BSA，Sigma）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法（Bradford，1976）進(jìn)行測(cè)定。松突圓蚧蛋白質(zhì)含量單位為mg/100只。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同處理對(duì)松突圓蚧海藻糖含量的影響

處理后逐日取樣測(cè)定松突圓蚧體內(nèi)海藻糖含量，結(jié)果如圖1。由圖1可知，對(duì)照組松突圓蚧體內(nèi)的海藻糖含量無(wú)較大波動(dòng)，在0.6924～0.7286 mmol/L小幅度變化；而處理組各時(shí)間點(diǎn)所測(cè)海藻糖含量均小于對(duì)照組，且隨處理時(shí)間延長(zhǎng)呈明顯的下降趨勢(shì)，在染菌后1～3 d海藻糖含量急速下降，第4 d略有升高但相較第3 d無(wú)顯著差異（P>0.05，下同），隨后緩慢下降，并在第7 d達(dá)最低點(diǎn)，為0.1702 mmol/L，與對(duì)照組相比降低了76.53%，兩者間差異達(dá)極顯著水平（P<0.01，下同）。

2. 2 不同處理對(duì)松突圓蚧海藻糖酶活性的影響

處理后逐日取樣測(cè)定松突圓蚧體內(nèi)海藻糖酶活性，結(jié)果如圖2。由圖2可知，松突圓蚧體內(nèi)的海藻糖酶活性變化趨勢(shì)與海藻糖含量變化趨勢(shì)相反，染菌后海藻糖酶活性逐漸升高，在染菌后3 d海藻糖酶活性（1.6570 mmol/L·min·mg）顯著高于對(duì)照組（P<0.05，下同）；染菌后4 d有所降低，但與對(duì)照組差異不顯著；隨后又開始上升，并在第7 d時(shí)達(dá)最高點(diǎn)（1.7173 mmol/L·min·mg），顯著高于對(duì)照組，而在第6和8 d時(shí)與對(duì)照組相比達(dá)極顯著差異水平。

2. 3 不同處理對(duì)松突圓蚧葡萄糖含量的影響

對(duì)松突圓蚧體內(nèi)葡萄糖含量的測(cè)定結(jié)果（圖3）顯示，對(duì)照組蟲體內(nèi)的葡萄糖含量在試驗(yàn)期內(nèi)無(wú)明顯變化，維持在1.6741～1.8606 mmol/L；而處理組松突圓蚧體內(nèi)的葡萄糖含量變化明顯，在感染初期葡萄糖含量上升，在染菌后3 d迅速升高至3.1479 mmol/L，是對(duì)照組的1.92倍，且差異達(dá)極顯著水平，隨后開始下降，在4～6 d時(shí)與對(duì)照組無(wú)顯著差異，7 d后處理組葡萄糖含量顯著低于對(duì)照組。

2. 4 不同處理對(duì)松突圓蚧蛋白質(zhì)含量的影響

由圖4可看出，處理組松突圓蚧體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量在試驗(yàn)期內(nèi)均低于對(duì)照組，在第7 d時(shí)降到最低值0.2581 mg/100只，只有對(duì)照組的51.41%，且處理后2～5 d和第7 d時(shí)蛋白質(zhì)含量與對(duì)照組相比差異達(dá)極顯著水平。

3 討論

昆蟲細(xì)胞內(nèi)海藻糖含量較高時(shí)能保護(hù)細(xì)胞活性，增強(qiáng)昆蟲生存和防御傷害的能力，在抵御沖擊負(fù)荷等方面有重要作用（雷芳等，2006；陸玉建等，2015）。病原真菌在侵染寄主過程中，菌絲生長(zhǎng)所需能量主要來源于寄主。本研究結(jié)果顯示，松突圓蚧被真菌侵染3 d后，其體內(nèi)海藻酶活性迅速升高，且一直高于對(duì)照組，反之海藻糖含量迅速降低且一直低于對(duì)照組；隨著海藻糖被海藻糖酶降解，在第1～3 d時(shí)葡萄糖含量顯著升高，為真菌菌絲生長(zhǎng)和繁殖提供了能量，在染菌3 d后葡萄糖含量開始下降，且在5 d后明顯低于對(duì)照組，說明病菌突破了昆蟲的抵御防線，使得昆蟲疾病加重逐漸進(jìn)入死亡階段。菌絲除了直接消耗寄主體內(nèi)的葡萄糖外，也有可能利用自身的海藻糖酶分解寄主體內(nèi)的海藻糖，從而促使寄主提高海藻糖酶活性來分解海藻糖獲取能量，因此導(dǎo)致處理組的海藻糖酶活性始終高于對(duì)照組，海藻糖含量則低于對(duì)照組，該變化對(duì)松突圓蚧的取食行為和免疫能力有極大影響，與樊金華等（2013）研究感染布氏白僵菌后油松毛蟲血淋巴中海藻糖酶活性、海藻糖和葡萄糖含量的變化結(jié)果相似。

隨著真菌菌絲在寄主體內(nèi)生長(zhǎng)和大量繁殖，寄主體內(nèi)海藻糖和葡萄糖被大量消耗，蟲體為了維持自身的生理活動(dòng)，極有可能分解蛋白質(zhì)。菌絲在侵染蟲體時(shí)也會(huì)釋放蛋白酶（黃蓉等，2014）分解寄主蛋白質(zhì)從而貫穿于蟲體各組織，因此本研究處理組幼蟲的蛋白質(zhì)含量在染菌2 d后即顯著低于對(duì)照組?？傊?，正是由于病原真菌侵染蟲體導(dǎo)致蟲體內(nèi)海藻糖酶活性增強(qiáng)將海藻糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，這一過程既為真菌提供了營(yíng)養(yǎng)而有利于病原真菌生長(zhǎng)和提高感染力，同時(shí)又破壞蟲體內(nèi)血糖平衡，從而加速昆蟲死亡。

據(jù)報(bào)道，某些真菌具有海藻糖酶，其分為酸性海藻糖酶和中性海藻糖酶，本研究中蟲生廣布擬盤多毛孢GXSTYJ03菌株在侵染松突圓蚧時(shí)是否利用海藻糖酶及是何種海藻糖酶在起作用有待進(jìn)一步探究；同時(shí)，蟲生廣布擬盤多毛孢對(duì)松突圓蚧體內(nèi)保護(hù)酶和解毒酶等相關(guān)防御酶系的影響亦有待后續(xù)研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，蟲生廣布擬盤多毛孢侵染松突圓蚧過程中引起蟲體內(nèi)海藻糖、葡萄糖和蛋白質(zhì)含量一定程度降低，導(dǎo)致其無(wú)法供給維持自身生命活動(dòng)所需的能量，是致死松突圓蚧的原因之一。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）