外源綠原酸緩解黑大豆SB鋁毒害的機(jī)理研究

江曉潔 李芳 王聞聞 陳宣欽

摘要： 該文研究了外源綠原酸（CGA）對(duì)Al脅迫下鋁敏感型黑大豆SB根生理生化指標(biāo)以及根中脅迫相關(guān)基因表達(dá)的變化，探討外源CGA緩解SB根鋁毒害的效果及分子機(jī)理。以不同濃度Al和CGA處理SB，篩選出CGA緩解Al毒害的最佳濃度，測(cè)定Al含量、抗氧化系統(tǒng)酶活性、1433蛋白與H+ATP酶的表達(dá)、H+泵活性。結(jié)果表明：低濃度CGA能緩解Al脅迫下黑大豆SB根伸長(zhǎng)抑制，并促進(jìn)側(cè)根數(shù)目增加，而高濃度CGA的緩解效果下降；0.01 g·L1 CGA使Al脅迫下SB根尖Al含量與MDA含量下降，促進(jìn)根系檸檬酸的分泌。RTPCR和Western Bloting分析表明0.01 g·L1 CGA促進(jìn)Al脅迫下SB根中1433b、1433m、1433k和GHA2基因（質(zhì)膜H+ATP酶）的表達(dá)，抑制MATE基因的表達(dá)。同時(shí)，0.01 g·L1 CGA能促進(jìn)Al脅迫下質(zhì)膜H+ATP酶蛋白磷酸化水平以及其與1433蛋白結(jié)合，且能提高質(zhì)膜H+ATP酶和H+泵活性。因此推測(cè)外源CGA可能通過(guò)增加側(cè)根數(shù)，增強(qiáng)1433蛋白和質(zhì)膜H+ATP酶基因蛋白表達(dá)水平和互作，彌補(bǔ)Al脅迫下MATE表達(dá)的抑制，增加檸檬酸的分泌，增強(qiáng)SB對(duì)鋁毒害的耐受性。

關(guān)鍵詞： 黑大豆SB， 綠原酸， 檸檬酸， 1433蛋白， H+ATPase， Al脅迫

中圖分類(lèi)號(hào)： Q945.78

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 10003142（2017）06073409

Abstract： We investigated the influences of exogenous chlorogenic acid （CGA） on the physiological parameters and Al stressrelated gene expression of SB （Alsensitive black soybean） root under Al stress. A major goal of this report was to explore the alleviating molecular mechanism of exogenous CGA on Al toxicity in SB. SB seedings were cultured in water solution and treated with 50 μmol·L1 Al or CGA plus 50 μmol·L1 Al. The optimal concentration of CGA alleviating Al toxicity was screened. And we study the effects of optimal exogenous CGA on root tip Al content， the activities of antioxidant enzyme， the expressions of 1433 protein and H+ATPase， and the activity of H+ pump under 50 μmol·L1 Al stress. Low concentrations of CGA alleviated inhibition of root elongation caused by Al toxicity and promoted the increase of lateral root numbers under Al stress. However， the CGAalleviated effect was weaken with high concentration of CGA treatment. It was founded that the alleviation effect of 0.01 g·L1 CGA was the most significant. Exogenous 0.01 g·L1 CGA decreased the Al in root tips and MDA contents. And the citric acid content in root exudates of SB under Al stress was significantly increased due to the addition of exogenous 0.01 g·L1 CGA. Expression analysis showed that exogenous 0.01 g·L1 CGA enhanced the expression of three 1433 isoforms （1433b， 1433m， and 1433k） and increased the expression of GHA2 （plasma membrane H+ATPase） gene， but inhibited the gene expression of MATE in SB under Al stress. The results of immunoprecipitation（IP） showed that the phosphorylation of the PM H+ATPase was up regulated by the exogenous 0.01 g·L1 CGA， which could bind with 1433 protein under Al stress. Meanwhile， plasma membrane H+ATPase and H+ pump activities were both enhanced by exogenous 0.01 g·L1 CGA under Al stress. It was suggested that exogenous CGA may enhance the SB tolerance to Al stress by increasing the lateral roots number， compensating inhibition of MATE expression and interaction between them to increase citric acid exudation.

Key words： black soybean， chlorogenic acid， citric acid； 1433， H+ATPase； Al stress

酸性土壤主要分布在熱帶、亞熱帶地區(qū)和對(duì)食物要求量大的發(fā)展中國(guó)家，約占世界可耕種土壤的30%（Sasaki et al，2004）。酸性土壤中的鋁毒害嚴(yán)重抑制農(nóng)作物生長(zhǎng)與產(chǎn)量。鋁在土壤pH>7時(shí)基本以沉淀形式存在（硅酸鹽或氧化物），對(duì)植物無(wú)毒。當(dāng)土壤pH<5時(shí)，鋁則會(huì)由沉淀形式轉(zhuǎn)化成為可溶的離子狀態(tài)，被植物吸收，造成傷害（Delhaize & Ryanp，1995）。氧自由基引起的膜脂氧化損傷幾乎是各種逆境脅迫對(duì)植物損傷的共同途徑和特征。植物體內(nèi)存在清除氧自由基的酶和非酶抗氧化系統(tǒng)。低濃度Al脅迫下，小麥（孔繁翔和桑偉蓮，2004）、水稻（馬寶慧，2007）、八仙花（彭盡暉等，2013）、栝樓（周媛，2012）等植物中抗氧化酶活性隨著Al3+濃度的增加而升高。耐鋁豇豆品種T6 SOD，POD和CAT活性顯著高于鋁敏感豇豆品種S3（于力等，2012）。在1 000 mg·L1的高鋁毒環(huán)境下，抗氧化酶會(huì)受到不同程度的抑制，抑制作用與植物種類(lèi)有關(guān)。大豆根系中SOD與CAT活性在高濃度Al脅迫下顯著下降（劉鵬等，2004）；而同樣在1 000 mg·L1Al脅迫下，蕎麥根系中SOD活性顯著降低，CAT活性有所升高（王保義等，2006）。植物體內(nèi)存在非酶類(lèi)抗氧化系統(tǒng)，主要包括各種還原性物質(zhì)，如還原型谷胱甘肽（GSH）、a生育酚（aTOC）、抗壞血酸（AsA）與類(lèi)胡蘿卜素（CAR）等 （馬寶慧，2007）。

鋁誘導(dǎo)的有機(jī)酸分泌是植物緩解Al毒的最重要途徑。在鋁毒脅迫下，植物根系有機(jī)酸的分泌受H+ATPase、多藥耐藥毒性物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（MATE）和1433蛋白等的調(diào)控。MATE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白廣泛存在于植物中（梁鋒等，2011）。Al脅迫下，高粱與擬南芥根表皮MATE高表達(dá)（Chen et al，2012；Liu et al，2009），促進(jìn)檸檬酸的外轉(zhuǎn)運(yùn)，緩解Al毒害。質(zhì)膜H+ATPase與檸檬酸的分泌量也有關(guān)。Al脅迫下大豆質(zhì)膜H+ATPase基因表達(dá)上調(diào)，根尖檸檬酸的分泌增加，加入釩酸鹽（VA，H+ATPase抑制劑）后，H+ATPase活性與檸檬酸分泌量顯著下降（Shen et al，2005）。1433蛋白普遍存在于植物中，能與H+ATPase特異結(jié)合，促進(jìn)H+ATPase磷酸化。Al脅迫下，蠶豆根系質(zhì)膜H+ATPase與1433蛋白的表達(dá)上調(diào)，H+ATPase磷酸化水平增加，質(zhì)膜H+ATPase與H+泵活性顯著增強(qiáng)，檸檬酸分泌量增加（郭傳龍等，2015；Chung et al，1999）。

綠原酸（CGA），又名3O咖啡?？崴?，是一種廣泛存在于植物體內(nèi)酚性成分，是植物有氧呼吸過(guò)程產(chǎn)生的一種苯丙氨酸代謝物（林學(xué)政等，2005；陳紹華等，2009）。當(dāng)植物受到生物脅迫時(shí)，一方面CGA作為植保素，破壞病原菌細(xì)胞壁，直接制劑抑制病原菌的生長(zhǎng)（周志娥等，2014）；另一方面，CGA也可轉(zhuǎn)變成為木質(zhì)素與軟木脂，使被入侵的傷口迅速木質(zhì)化，防止病菌進(jìn)一步入侵。當(dāng)植物受到非生物脅迫時(shí)，植物體內(nèi)的CGA含量急劇增加，參與脅迫響應(yīng)（林學(xué)政等，2005）。此外，綠原酸本身作為一種還原劑，對(duì)羥基自由基具有清除作用，對(duì)植物組織的氧化損傷具有緩解作用（陳紹華等，2008）。目前未見(jiàn)有關(guān)綠原酸對(duì)Al脅迫下的植物生理生化，生長(zhǎng)發(fā)育和逆境相關(guān)基因表達(dá)的影響。

本研究使用水培法，以黑大豆SB（Al敏感型）為材料，研究外源綠原酸對(duì)Al脅迫下SB根系相關(guān)生理生化指標(biāo)的影響，探討SB根中脅迫相關(guān)基因表達(dá)的變化，揭示外源CGA緩解SB根系鋁毒害的生理及其分子機(jī)理。

1材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)與處理

參照王聞聞等（2014）的方法培養(yǎng)黑大豆SB，3 d后，用含有AlCl3和CGA+AlCl3的營(yíng)養(yǎng)液（0.5 mmol.L1 CaCl2，pH 4.5）處理幼苗，AlCl3濃度為50 μmol·L1，CGA濃度為0.004 g·L1，0.01 g·L1，0.02 g·L1，0.04 g·L1，并以營(yíng)養(yǎng)液處理的幼苗為對(duì)照，處理24 h、3 d、7 d后，測(cè)量根伸長(zhǎng)以及側(cè)根數(shù)目測(cè)定。

將培養(yǎng)的SB幼苗置于處理液（分別含有50

μmol·L1 AlCl3和0.01 g·L1 CGA+50

μmol·L1 AlCl3的營(yíng)養(yǎng)液）中，以營(yíng)養(yǎng)液處理為對(duì)照。分別處理0、2、4、6、8、12、18、24 h后，取植物的根稱(chēng)重后用于根尖Al含量測(cè)定；用液氮處理剩余的植物根后放置超低溫冰箱（-80 ℃）保存，用于其它檢測(cè)分析。

1.2 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.2.1 相對(duì)根伸長(zhǎng)率及側(cè)根數(shù)目的測(cè)定處理植物前，對(duì)根基部進(jìn)行標(biāo)記，并測(cè)量比較處理前后從根尖頂端到標(biāo)記點(diǎn)距離的差異，處理前后測(cè)量值之差為根伸長(zhǎng)量（周志娥等，2014）。側(cè)根數(shù)目的測(cè)定：分別計(jì)數(shù)不同處理前后長(zhǎng)度大于1 mm的側(cè)根數(shù)目，求其平均值 （王聞聞等，2014）。

1.2.2 根系分泌物檸檬酸收集及含量測(cè)定取6只50 mL的開(kāi)口試管，分別加入10株長(zhǎng)勢(shì)一致的SB幼苗及AlCl3 50

μmol·L1 和CGA（0.004，0.01，0.02，0.04 g·L1）的營(yíng)養(yǎng)液（0.5 mmol·L1 CaCl2，pH 4.5）中，以營(yíng)養(yǎng)液（0.5 mmol·L1 CaCl2，pH 4.5）處理為對(duì)照。處理24 h后，將樣品用真空干燥儀常溫下干燥后加入4 mL蒸餾水溶解樣品。溶解的樣品過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂提純，用梯度的硫酸銨洗脫。將洗脫液濃縮回收后1 mL 50%的甲醇溶解過(guò)濾，再用HPLC法進(jìn)行樣品檸檬酸含量分析。檢測(cè)器波長(zhǎng)為210 nm，流速0.8 mL·min1，柱溫30 ℃，根據(jù)峰面積確定樣品中的檸檬酸含量 （王聞聞等，2014）。

1.2.3 根尖Al含量的測(cè)定將處理過(guò)的根用蒸餾水清洗3次，洗凈根表面附著的Al，將根表面的水分吸干，裝入信封中，再放入70 ℃的烘箱2～3 d后烘干直至恒重。烘干的樣品經(jīng)500 ℃ 高溫灰化后，加入1 mL優(yōu)級(jí)純硝酸浸提過(guò)夜得到提取液，提取液用蒸餾水定容至50 mL。用ICPAES測(cè)定根中金屬Al含量（Lan et al，2016）。

1.2.4 MDA和H2O2含量的測(cè)定使用硫代巴比妥法（TBA法）（張志良和瞿偉菁，2003）測(cè)定MDA含量。H2O2含量測(cè)定使用二甲基酚橙法（李忠光等，2007）。

1.2.5 根尖抗氧化系統(tǒng)酶活性的測(cè)定取冷凍保存的樣品參照Chen et al（2012）的方法測(cè)量根尖抗氧化系統(tǒng)酶（SOD、POD與CAT）活性。

1.2.6 基因表達(dá)分析取置于-80 ℃冰箱凍存的SB根尖，于液氮中研磨呈粉末后，加入適量Trizol 試劑 （Invitrogen）提取RNA，使用MMuLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA。根據(jù)質(zhì)膜中 H+ATPase的編碼基因vha2 和 sb1433保守區(qū)的cDNA序列，設(shè)計(jì)合適的引物，以28sRNA為內(nèi)參（王杰等，2015），參考王聞聞等（2014）所用的引物序列進(jìn)行RTPCR分析。

1.2.7 免疫共沉淀分析按照Yan et al（2002）的方法提取質(zhì)膜蛋白，參照J(rèn)ahn et al（1997）的方法檢測(cè)SB根系中質(zhì)膜1433蛋白與H+ATPase的相互作用。20 μg的膜蛋白在 10%PAGE上分離后，用半干轉(zhuǎn)膜法將分離的膜蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。電轉(zhuǎn)完畢后，使用質(zhì)膜 H+ATPase和1433蛋白抗體做一抗進(jìn)行Western分析，加入二抗觀(guān)察結(jié)果。

1.2.8質(zhì)膜H+ATPase活性和H+泵活性的測(cè)定參照Yan et al（2002）的方法提取質(zhì)膜蛋白，紫外分光光度計(jì)法測(cè)定H+泵的活性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Prism5和DPS 7.05對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并比較顯著性差異。

2結(jié)果與分析

2.1 外源CGA對(duì)Al脅迫下SB根伸長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)的影響

根伸長(zhǎng)抑制是Al毒對(duì)植物根傷害的最直接表現(xiàn)。根伸長(zhǎng)抑制通常通過(guò)根相對(duì)伸長(zhǎng)率（RRG）這一指標(biāo)反應(yīng)。本研究在50 μmol·L1 Al溶液中分別加入添加0.004、0.01、0.02、0.04 g·L1 的CGA處理SB幼苗24 h后，測(cè)定根長(zhǎng)，并與正常的營(yíng)養(yǎng)液和單獨(dú)Al處理作為對(duì)照，計(jì)算根的相對(duì)伸長(zhǎng)率。圖1結(jié)果顯示，50 μmol·L1 Al處理后，會(huì)一定程度抑制了SB根伸長(zhǎng)，與正常營(yíng)養(yǎng)液處理相比，Al處理下SB根相對(duì)伸長(zhǎng)率（RRG）有所降低。0.01 g·L1 CGA處理下SB的RRG顯著高于單獨(dú)Al處理，甚至高于正常營(yíng)養(yǎng)液處理，提示0.01 g·L1 CGA處理能緩解Al脅迫誘導(dǎo)的根伸長(zhǎng)抑制。其它濃度的CGA處理下根相對(duì)伸長(zhǎng)率雖然高于單獨(dú)Al處理，但二者之間并無(wú)顯著差異。側(cè)根數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，處理3 d后，Al脅迫下側(cè)根數(shù)顯著低于正常對(duì)照，Al脅迫除抑制根伸長(zhǎng)，還可抑制側(cè)根生長(zhǎng)發(fā)育。而外源添加0.004、0.01、0.02、0.04 g·L1 CGA處理的SB側(cè)根數(shù)目顯著高于單獨(dú)Al處理。除0.04 g·L1CGA處理外，50 μmol·L1Al溶液中分別添加0.004、

0.01、0.02 g·L1 CGA處理下側(cè)根數(shù)與正常對(duì)照水平相當(dāng)。處理7 d后，外源添加0.004、0.01、0.02、0.04 g·L1 CGA處理下的側(cè)根數(shù)目仍高于單獨(dú)Al處理，且0.01 g·L1 CGA處理側(cè)根數(shù)目高于其它濃度CGA處理。

2.2 外源CGA對(duì)Al脅迫SB根尖檸檬酸分泌量的影響

植物根系有機(jī)酸分泌外排是植物抗鋁毒害的最重要機(jī)理。Al處理與對(duì)照相比SB根系分泌物中檸檬酸含量顯著增加。Al處理下外源添加CGA不同程度增加了Al脅迫下SB根系檸檬酸分泌量。SB根系檸檬酸分泌隨著CGA濃度的增加首先呈現(xiàn)先升高的趨勢(shì)，達(dá)到最適的濃度后，就呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，根據(jù)CGA對(duì)SB根分泌檸檬酸影響的變化特點(diǎn)，外源0.01 g·L1 CGA處理下檸檬酸分泌量最高，證實(shí)該濃度對(duì)緩解Al脅迫的效果可能優(yōu)于其它濃度（圖2）。同時(shí)，在外源0.01g·L1CGA處理Al脅迫下的大豆根的不管是根伸長(zhǎng)長(zhǎng)度還是側(cè)根數(shù)目均顯著高于其他濃度，說(shuō)明在外源0.01 g·L1 CGA濃度緩解Al對(duì)SB脅迫的效果最明顯。因此，選擇0.01 g·L1 CGA作為其它實(shí)驗(yàn)的處理濃度。

2.3 外源CGA對(duì)Al脅迫下SB根尖Al含量的影響

0.01 g·L1 CGA單獨(dú)處理與對(duì)照相比，SB根尖Al含量無(wú)顯著差異。由此可見(jiàn)，CGA本身對(duì)根尖Al含量并無(wú)顯著的影響。50

μmol·L1 Al脅迫下SB根尖鋁含量顯著高于CGA單獨(dú)處理和對(duì)照。50

μmol·L1 Al脅迫下添加0.01 g·L1 CGA后，根尖鋁含量顯著低于單獨(dú)Al處理，說(shuō)明CGA能顯著減少Al脅迫下SB根尖鋁的積累（圖3）。

2.4 外源CGA對(duì)Al脅迫下SB根尖MDA和H2O2含量的影響

Al單獨(dú)處理使SB根中MDA含量明顯提高。外源添加CGA后，Al誘導(dǎo)的MDA含量的升高顯著降低，恢復(fù)到對(duì)照水平，提示CGA對(duì)Al脅迫誘導(dǎo)的膜脂過(guò)氧化損傷具有緩解作用（圖4：A）。Al脅迫和CGA處理，H2O2含量與對(duì)照無(wú)顯著差異，Al脅迫引起的膜脂過(guò)氧化，MDA含量增加，并不通過(guò)H2O2積累（圖4：B）。

2.5 外源CGA對(duì)Al脅迫下SB根尖抗氧化酶活性的影響

Al處理后，SB根系可溶性蛋白含量要顯著高于對(duì)照，推測(cè)Al脅迫會(huì)促使一些基因過(guò)表達(dá)；然而在A(yíng)l脅迫下外源施加CGA后，可溶性蛋白含量雖略高于A(yíng)l單獨(dú)處理，但二者之間并無(wú)顯著差異，CGA并不增加Al脅迫下可溶性蛋白含量 （圖5：A）。與對(duì)照相比，Al處理下SB根中SOD活性顯著降低，CAT和POD活性無(wú)顯著差異；外源CGA對(duì)Al脅迫下SOD、POD、CAT活性沒(méi)有顯著影響（圖5）。

2.6 外源CGA對(duì)Al脅迫下SB根中1433蛋白、質(zhì)膜H+ATPase和MATE基因表達(dá)的影響

由圖6可知，與對(duì)照相比，Al脅迫下SB根1433基因表達(dá)水平不同程度增強(qiáng)。外源添加CGA后，1433b、1433m和1433k表達(dá)水平略高于A(yíng)l單獨(dú)處理的植株；而1433c、1433e、1433f、1433g、1433i、1433j和1433n表達(dá)水平低于A(yíng)l單獨(dú)處理。Al處理下， GHA2mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照，外源添加CGA后，GHA2mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步增加，Al脅迫下， MATE基因mRNA水平顯著高于對(duì)照，與單獨(dú)Al處理相比，外源添加CGA后MATE基因的表達(dá)水平略有下降，但仍高于對(duì)照（圖6）。

2.7 外源CGA對(duì)Al脅迫下SB根中質(zhì)膜H+ATPase蛋白磷酸化水平及其與1433蛋白互作、H+ATPase活性及H+泵活性的影響

Al處理下，SB根中質(zhì)膜H+ATPase的磷酸化水平高于對(duì)照，外源添加CGA后，SB根中質(zhì)膜H+ATPase的磷酸化水平進(jìn)一步增加（圖7）。與質(zhì)膜H+ATPase的磷酸化水平結(jié)果相似，Al處理下1433蛋白與磷酸化質(zhì)膜H+ATPase的結(jié)合能力高于對(duì)照，添加外源0.01 g·L1 CGA后1433蛋白與磷酸化質(zhì)膜H+ATPase的結(jié)合水平增加，高于單獨(dú)Al處理和對(duì)照。CGA促進(jìn)了Al脅迫下1433蛋白與磷酸化質(zhì)膜H+ATPase的結(jié)合。

添加外源CGA后，Al處理下SB根中質(zhì)膜H+ATPase的活性高低依次為Al+0.01 CGA>Al>CK。H+泵活性的結(jié)果與質(zhì)膜H+ATPase活性的結(jié)果基本一致，50 μmol·L1 Al溶液添加0.01 g·L1 CGA處理能增強(qiáng)H+泵的活性，單獨(dú)Al處理下的H+泵活性位于對(duì)照組與CGA處理二者之間（圖8）。

3討論

激素在植物應(yīng)答緩解環(huán)境脅迫中起著重要的調(diào)節(jié)作用，如水楊酸、脫落酸、茉莉酸、乙烯、多肽激素等（徐偉和嚴(yán)善春，2005）。Al脅迫下紫花苜蓿IAA含量顯著下降（任曉燕，2013）。CGA是IAA的保護(hù)劑，抑制IAA氧化反應(yīng)，緩解Al脅迫對(duì)根系伸長(zhǎng)的抑制作用（Paul et al，1964）。本研究中，外源低濃度CGA（0.004和0.01 g·L1 ）緩解Al對(duì)SB根伸長(zhǎng)具有抑制作用的同時(shí)，對(duì)側(cè)根的生長(zhǎng)發(fā)育具有促進(jìn)作用，而高濃度0.02和0.04 g·L1CGA的緩解和促進(jìn)效果下降。有機(jī)酸分泌是植物抗鋁毒害的最重要途徑。Al脅迫下，0.01 g·L1 CGA處理后，SB根系檸檬酸的分泌量顯著提高，而其它濃度的CGA處理下，檸檬酸分泌量變化并不明顯，可見(jiàn)，Al脅迫下，0.01 g·L1 CGA對(duì)SB根系具有最顯著的緩解作用。此外，我們注意到高濃度0.02和0.04 g·L1 CGA緩解Al毒害的效果下降，推測(cè)其可能的原因是被細(xì)胞吸收后，糖苷鍵水解，生成了3，4二羥基苯丙烯酸，其羥基和羧基能電離出H+離子；高濃度CGA被植物細(xì)胞吸收后，破壞細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的酸堿穩(wěn)態(tài)，造成細(xì)胞代謝紊亂，因而緩解作用下降。

Al3+誘導(dǎo)植物產(chǎn)生和積累大量的活性氧，破壞正常組織的結(jié)構(gòu)與功能，甚至導(dǎo)致死亡。本研究中，Al脅迫下MDA含量顯著增加，暗示Al脅迫引起膜脂過(guò)氧化。添加外源CGA后，MDA含量顯著下降，CGA能夠緩解Al脅迫引起的脂質(zhì)過(guò)氧化。外源CGA和單獨(dú)鋁處理下H2O2的含量與對(duì)照無(wú)明顯差異，Al脅迫引起的膜脂過(guò)氧化，MDA含量增加，并不是H2O2的積累氧化造成的。外源CGA和單獨(dú)鋁處理與對(duì)照相比，SOD活性顯著下降，POD和CAT活性與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，CGA對(duì)Al脅迫下抗氧化酶活性并無(wú)顯著的影響和調(diào)控作用。CGA分子中具有氫自由基結(jié)構(gòu)，能夠清除植物體內(nèi)的活性氧，減輕自由基對(duì)組織的氧化脅迫（胡宗福等，2006）。因此我們推測(cè)CGA通過(guò)其還原用，清除Al脅迫產(chǎn)生的除H2O2外的其它活性氧，緩解膜脂過(guò)氧化，減少M(fèi)DA的產(chǎn)生。

植物受到Al3+刺激時(shí)，根系分泌大量有機(jī)酸，如檸檬酸、蘋(píng)果酸等，這些有機(jī)酸能與細(xì)胞外的Al3+結(jié)合，防止Al3+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)造成對(duì)植物的損害（郭傳龍，2013）。檸檬酸通道蛋白屬于MATE家族，能轉(zhuǎn)運(yùn)檸檬酸至胞外，螯合細(xì)胞外的Al3+（謝小東等，2011）。本研究中，SB在A(yíng)l脅迫下，加入0.01 g·L1CGA后，檸檬酸的分泌量雖然顯著增加，但MATE表達(dá)量卻較單獨(dú)Al脅迫處理略有下降，綠原酸對(duì)MATE表達(dá)具有一定的抑制效應(yīng)?？梢?jiàn)，綠原酸并不通過(guò)上調(diào)MATE的表達(dá)，增加Al脅迫下SB根系檸檬酸的分泌。結(jié)合根伸長(zhǎng)抑制試驗(yàn)，0.01 g·L1CGA能顯著增加Al脅迫下SB側(cè)根數(shù)目。因此，我們推測(cè)可能是側(cè)根數(shù)目的增多，生物量增加，彌補(bǔ)了MATE的基因表達(dá)水平的下降造成的差異，最終使檸檬酸分泌量增加從而緩解Al脅迫。

植物中1433基因家族至少有十五種亞型，這些1433蛋白能與靶細(xì)胞不同程度結(jié)合，調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)。在酸性土壤中，Al3+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，激活1433蛋白，并與H+ATPase特異性結(jié)合，使其磷酸化和H+泵活性增加，增強(qiáng)檸檬酸的分泌作用（周志娥等，2014）。與單獨(dú)Al脅迫相比，CGA處理后的1433蛋白表達(dá)各有不同，其中三種1433蛋白（1433b、1433k和1433m）的表達(dá)水平均略微上調(diào)，而1433c、1433e、1433f、1433g、1433i、1433j和1433n基因表達(dá)水平下降。同時(shí)與單獨(dú)Al處理相比，CGA處理后，質(zhì)膜H+ATPase的磷酸化水平，其與1433的結(jié)合能力，H+泵活性均增加。因此，推測(cè)CGA還可能通過(guò)調(diào)控1433蛋白的表達(dá)，增加質(zhì)膜H+-ATP酶的磷酸化水平，增強(qiáng)H+泵的活性使檸檬酸分泌量增加，緩解Al對(duì)SB的毒害。至于CGA如果具體調(diào)控哪種1433蛋白亞型，需要進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。

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