基于納米銀催化銀沉積的核酸適配體傳感器研究

李晨晨 倪超 朱超云 宋偉 賴慶菁

摘要：文章以酶標(biāo)板為分析平臺(tái)，絲網(wǎng)印刷芯片電極為檢測(cè)裝置，構(gòu)建電化學(xué)核酸適配體傳感器。將生物素修飾的核酸適配體固定至鏈霉親和素包裹的酶標(biāo)板中，以巰基修飾的核酸適配體功能化的納米銀作為探針。通過三明治型的夾心反應(yīng)后，加入銀增強(qiáng)溶液，利用納米銀催化銀沉積反應(yīng)，在孔板中形成了大量的銀沉積物。隨著酸溶解生成的銀沉積物后，插入印刷芯片電極，采用方波陽(yáng)極溶出伏安法對(duì)釋放出的銀離子進(jìn)行測(cè)定。銀的電化學(xué)溶出峰與PDGF-BB的濃度相關(guān)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)PDGF-BB的定量測(cè)定。分析方法對(duì)PDGF-BB的測(cè)定結(jié)果良好，線性范圍為3.12～200 ng/mL，檢測(cè)限為1.23 ng/mL，且特異性良好。

關(guān)鍵詞：核酸適配體；傳感器；納米銀

開發(fā)新的分析方法用于定性定量測(cè)定與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)，在醫(yī)學(xué)診斷、治療和研究領(lǐng)域內(nèi)至關(guān)重要。與抗體相比，核酸適配體具有化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)、合成簡(jiǎn)單、易于修飾的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)適合于開發(fā)各種不同分析方法里的分子工具。因此，在研究者設(shè)計(jì)各種不同的生物分析方法里，核酸適配體成了一種更為有效的選擇[1]。近年來，在生物傳感器的構(gòu)建中，核酸適配體被用做生物識(shí)別的元件，發(fā)展了多種不同的分析方法，例如熒光生物傳感器、比色法生物傳感器和電化學(xué)生物傳感器等[2-4]。將電化學(xué)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)和核酸適配體特異性的識(shí)別能力結(jié)合起來并應(yīng)用在傳感器中，已經(jīng)成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)。絲網(wǎng)印刷芯片電極由于具有其他電極所沒有的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，具有成本低，靈敏度高、重現(xiàn)性好、可一次性使用的優(yōu)點(diǎn)，為醫(yī)學(xué)診斷提供一個(gè)嶄新的分析平臺(tái)。在各種納米材料標(biāo)記物中，納米銀顆粒因?yàn)楦菀籽趸蚨哂懈玫碾娀瘜W(xué)性活性，從而更適合作為檢測(cè)探針。本研究以多孔板為分析平臺(tái)，絲網(wǎng)印刷芯片電極為檢測(cè)裝置，構(gòu)建電化學(xué)核酸適配體傳感器。將生物素修飾的核酸適配體固定至鏈霉親和素包裹的多孔板中，以巰基修飾的核酸適配體功能化的納米銀作為探針。通過三明治型的夾心反應(yīng)后，加入銀增強(qiáng)溶液，利用納米銀催化效應(yīng)，在孔板中形成了大量的銀沉積物。隨著酸溶液溶解生成的銀沉積物，采用方波陽(yáng)極溶出伏安法對(duì)釋放出的銀離子進(jìn)行測(cè)定，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)PDGF-BB定量測(cè)定。

1 試劑和儀器

鏈霉親和素（北京博奧生物有限公司）；PDGF-BB（MW= 24800 Da，R&D System，Minneapolis）；牛血清白蛋白，硝酸銀，硼氫化鈉，吐溫（Tween-20），KCI，MgC12，抗壞血酸（Sigma-Aldrich，美國(guó)）。H2S04，HNO3，KNO3，NaCI，Na2HP04，KH2P04（南京化學(xué)試劑有限公司）；96孔板（上海生工生物有限公司）。絲網(wǎng)印刷芯片電極為實(shí)驗(yàn)室自制，所用水均為超純水。CⅢ1232B便攜式電化學(xué)工作站（上海辰華）。

實(shí)驗(yàn)中所需緩沖溶液如下：1×PBS （137mM NaCI，2.7mM KCI， 10mM Na2HP04，2mM KH2P04，pH=7.4）；1×PBSM（1×PBS，1 mM MgCl2）； PBST（1×PBS， 5%Tween-20）：商品化的無(wú)蛋白封閉緩沖溶液（Tris緩沖溶液做溶劑，pH=7.4）；碳酸鈉緩沖溶液（pH=9.6）。

所用核酸適配體如下：

5 AAAAAAAATACTCAGGGCACTTGCAAGCAATTGTGGTCCCAATGGGCTGAGTAT，其5端由巰基修飾（巰基修飾的核酸適配體）。

5-AAAAAAAATACTCAGGGCACTTGCAAGCAATTGTGGTCCCAATGGGCTGAGTAT，其5端由生物素修飾（生物素修飾的核酸適配體）。

2 實(shí)驗(yàn)過程

2.1巰基修飾的核酸適配體功能化的納米銀制備

在攪拌的狀態(tài)下將硝酸銀和硼氫化鈉（體積比為1：3）逐滴加入冰浴中并混勻，持續(xù)攪拌直至恢復(fù)至室溫。為制備核酸適配體功能化的納米銀，將100μL濃度為IOμM的巰基修飾的核酸適配體與1 mL所合成的納米銀混合。將上述溶液用鹽溶液進(jìn)行陳化，分次加入NaCI直至濃度為0.2 M。孵育42 h后，用1×PBS緩沖溶液離心洗滌3次，最終分散至1×PBSM緩沖溶液中。巰基修飾的核酸適配體功能化的納米銀不用的時(shí)候，于4℃下保存。

2.2多孔板中分析PDGF-BB過程

將100μL濃度為5 mg/mL的鏈霉親和素（用碳酸鈉緩沖溶液溶解，pH=9.6）加入到96孔板中，4℃孵育并靜置過夜。各孔用100 μL無(wú)蛋白封閉緩沖溶液于37℃下溫育1h以消除非特異性的吸附，并用PBST緩沖溶液清洗3次。隨后往各孔中加入200μL濃度為200nM的生物素修飾的核酸適配體（1XPBS緩沖溶液），37℃下反應(yīng)1h后用PBST緩沖溶液清洗3次。在各反應(yīng)孔中加入不同濃度的PDGF-BB（1×PBSM緩沖溶液），于37℃下反應(yīng)th后用PBST緩沖溶液清洗3次，以去除未結(jié)合的PDGF-BB。最后，在各孔里添加100μL巰基修飾的核酸適配體功能化的納米銀，37℃下反應(yīng)1h，在孔中形成了生物素修飾的核酸適配體，PDGF-BB，巰基修飾的核酸適配體功能化的納米銀這三者之間的三明治型的復(fù)合物。各孔用PBST緩沖溶液洗滌3次后待用。

將0.4 mmol/L硝酸銀和0.2 mmol/L抗壞血酸混合液（體積比為1：1）加入反應(yīng)后的各孔中，并在暗處避光放置10 min。銀沉積反應(yīng)完成后，用水清洗各孔3次，排干后各孔加入100 μL濃度為l mol/L的HNO3，于室溫下溶解所生成的銀沉積物。

完成反應(yīng)后的各孔里加入100μL濃度為1M的KNO3，混勻后將絲網(wǎng)印刷芯片電極插入孔中，并連接電化學(xué)工作站，用方波陽(yáng)極溶出伏安法測(cè)定溶液中的銀離子。電極在一0.5 V下，富集10 min后在- 0.4～+ 0.4 V進(jìn)行方波伏安掃描，記錄峰電流。峰電流的濃度的對(duì)數(shù)與PDGF-BB的濃度線性相關(guān)，從而實(shí)現(xiàn)定量測(cè)定。

3 結(jié)果與討論

3.1檢測(cè)原理

本研究提出的基于納米銀催化銀沉積的多孔板電化學(xué)核酸適配體傳感器測(cè)定PDGF-BB的示意如圖1所示。首先利用聚苯乙烯的吸附作用，在pH=9.6的碳酸鈉緩沖溶液里，將鏈霉親和素包被在多孔板中。5端生物素修飾的核酸適配體加入后，通過生物素-親和素之間的特異性結(jié)合，可將適配體固定至孔板表面。5端巰基修飾的核酸適配體功能化的納米銀作為檢測(cè)探針。傳感器的檢測(cè)模式采取三明治型的夾心法，PDGF-BB有兩個(gè)活性點(diǎn)位可以與適配體結(jié)合，因此，在孔板中可形成生物素修飾的核酸適配體，PDGF-BB，巰基修飾的核酸適配體功能化的納米銀這三者之間的三明治型的復(fù)合物。探針中的納米銀具有較好的催化活性，可以催化抗壞血酸還原硝酸銀的反應(yīng)，從而在孔內(nèi)形成大量銀的沉積物。用HNO3將沉積的銀溶解，并于體系內(nèi)釋放出大量的銀離子。將絲網(wǎng)印刷芯片電極插入到孔板內(nèi)，連接便攜式電化學(xué)工作站和計(jì)算機(jī)，采用方波陽(yáng)極溶出伏安法，可定量測(cè)定出反應(yīng)體系所生成的銀的量，實(shí)現(xiàn)了對(duì)PDGF-BB的定量測(cè)定。

3.2分析性能

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，對(duì)不同濃度的PDGF-BB進(jìn)行定量分析。PDGF-BB的含量和納米銀催化銀沉積反應(yīng)所生成的銀的溶出峰電流值相關(guān)，同預(yù)期一致，銀的溶出峰電流值隨著PDGF-BB的濃度增加而增加（見圖2A）。傳感器的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2B所示，從圖中可知，峰電流值和PDGF-BB濃度的對(duì)數(shù)值線性相關(guān)，線性范圍為3.12-200 ng/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為，（uA）= 3.965-1.39 log C（ng/mL），其中C是PDGF-BB的濃度，堤傳感器銀的溶出峰峰電流值，線性相關(guān)系數(shù)R=0.976 4。在3倍信噪比下，計(jì)算出傳感器的檢出限為1.23 ng/mL。該檢出限適用于醫(yī)療診斷中微量PDGF-BB的測(cè)定。

為考察傳感器的特異性，以PDGF的兩個(gè)異構(gòu)體（PDGF-AB，PDGF-AA），BSA，凝血酶（Thrombin）作為可能存在的干擾物質(zhì)，分別對(duì)濃度為50 ng/mL的PDGF-BB，PDGF-AB，PDGF-AA，Thrombin，以及濃度為1mg/mL的BSA進(jìn)行定量分析。由結(jié)果可知，僅當(dāng)有PDGF-BB存在時(shí)，才有傳感器的電流響應(yīng)，PDGF-AB，PDGF-AA和Thrombin的響應(yīng)值與BSA相近，結(jié)果表明，本研究所提出的基于納米銀催化銀沉積的多孔板電化學(xué)核酸適配體傳感器的特異性良好。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究以酶標(biāo)板為分析平臺(tái)，絲網(wǎng)印刷芯片電極為檢測(cè)裝置，構(gòu)建電化學(xué)核酸適配體傳感器。將生物素修飾的核酸適配體固定至鏈霉親和素包裹的酶標(biāo)板中，以巰基修飾的核酸適配體功能化的納米銀作為探針，實(shí)現(xiàn)對(duì)PDGF-BB的定量測(cè)定。分析方法測(cè)定結(jié)果良好，特異性佳。