國內單克隆抗體在口蹄疫檢測中的應用

金映紅 苗書魁 魏玉榮 汪萍 魏婕 夏俊 木克熱木 米曉云

摘要：口蹄疫是一種嚴重危害畜牧業(yè)發(fā)展，影響世界政治經濟被稱為“政治經濟病”的重大動物傳傳染病，快速有效的診斷對其防控具有重要的意義，單克隆抗體具有與抗原高特異性結合、理化性狀高度均一、可通過細胞培養(yǎng)大量獲取等特性，使其在醫(yī)學領域廣泛應用。目前國內外有很多學者將單克隆抗體技術運用于口蹄疫研究中，為口蹄疫的研究開創(chuàng)了新的鄰域。本文簡要概述一下目前國內單克隆抗體在口蹄疫檢測方面的應用。

關鍵詞：口蹄疫；口蹄疫病毒 ；單克隆抗體；口蹄疫檢測

中圖分類號：S858 文獻標識碼：B 文章編號：2096-3637（2017）07-0049-02

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是國際獸疫局規(guī)定的A類動物傳染病，并被列為18種A類傳染病之首，世界衛(wèi)生組織（OIE）列為通報疾?。↙ist disease），我國列為1類動物傳染病。它傳播途徑多、速度快，是傳染病中危害最大的能造成跨國界爆發(fā)流行的惡性傳染病之一，嚴重威脅畜牧業(yè)的發(fā)展、畜產品的進出口貿易、影響人民群眾的生產生活及社會經濟、政治的穩(wěn)定發(fā)展，故又被稱為“政治經濟病”。FMD發(fā)現(xiàn)至今已有上百年的歷史，迄今尚未在全球范圍內得到控制和根除。口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus， FMDV）共有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3（即南非1、2、3型）和Asia1（亞洲1型）7種血清型，且極易發(fā)生突變，現(xiàn)已知80 多個亞型，目前我國流行的口蹄疫主要為O、A兩個血清型[1]。由于該病毒各型之間無交叉保護反應，且同型內的不同亞型的抗原性也存在差別，使得口蹄疫的診斷和控制存在很大的難度。獲得一種快速準確地鑒別FMD各種血清型的檢測試劑可有效提高FMD的診斷效率，為FMD的控制提供有力依據(jù)。

自1975年英國劍橋大學Kohler 和 Milstein兩位研究者建立雜交瘤單克隆抗體（單抗）技術以來，1982 年英國普布里斯動物病毒研究所K.c.McCullough等人首次研究出抗口蹄疫病毒O型單抗細胞株，1985 年中國農科院蘭州獸醫(yī)研究所首次在國內建立了分泌O型口蹄疫病毒單抗雜交瘤細胞株，1987年建立了口蹄疫A型單抗細胞株，之后新疆獸醫(yī)研究所伊米提等、東北農業(yè)大學孫靜等也先后制備出口蹄疫A型單抗細胞株。隨后各種抗FMD單克隆抗體細胞株的獲得不僅為動物檢疫部門提供了一種快速、方便、靈敏的檢疫方法，也為流行病學調查、新疫苗研制和基礎理論研究開辟了一條新的途徑 。鑒于單克隆抗體具有與抗原高特異性結合、理化性狀高度均一、可通過細胞培養(yǎng)大量獲得等特性，以下我們就單克隆抗體在FMD檢測中的應用做一簡要概述。

1 抗原的選擇

FMDV 屬小 RNA 病毒科（Picornavidae）口蹄疫病毒屬（Aphthovirus）。該病毒由VP1、VP2、VP3 和 VP4 4 種結構蛋白及前導蛋白酶（Lpro）、2A、2B、2C、3A、3B、3C 蛋白酶（3Cpro）及 3D 聚合酶（3Dpol）和它們的前體等非結構蛋白構成?？谔阋卟《镜慕Y構蛋白構成其衣殼，不同血清型FMDV 結構蛋白之間存在抗原差異性。而其非結構蛋白主要參與病毒RNA 的復制、裂解以及結構蛋白的折疊、裝配等過程，不存在血清型之間的差異。

由于FMDV的7個血清型之間存在共有表位，造成部分單克隆抗體用于檢測時在各型間出現(xiàn)交叉反應，因此特異性抗原的選用可提高制備的單抗在FMDV定型檢測時的特異性。FMDV全病毒粒子 146S具有較強的免疫原性，而結構蛋白VP1 蛋白是FMDV最重要的抗原位點，也是抗原變異的關鍵， 是唯一耐受水解蛋白酶的病毒蛋白， 也是在動物體內誘導產生中和抗體的主要成分， 因其高度保守的G-H 環(huán)和 C 端在病毒抗原性和免疫原性方面具有重要作用，型特異性最好，所以很多學者致力于VP1蛋白的表達純化并以此作為抗原來制備單克隆抗體。

2 單克隆抗體在口蹄疫檢測中的應用

2.1 抗原的檢測

由于口蹄疫存在7個血清型，因此快速定型是該病毒臨床診斷中的重點，在FMDV抗原檢測時所用的補體結合法、中和試驗、瓊脂擴散試驗、間接血凝試驗、雙抗夾心ELISA、膠體金定型試紙條等傳統(tǒng)的血清學方法，普遍存在檢測周期長，檢測方法特異性相對較低等缺點，而實驗室常用的敏感性較高的RT-PCR 方法，又易出現(xiàn)交叉污染，不能很好地區(qū)分FMDV 的血清型。因此，越來越多的學者著眼于建立一種利用FMDV單克隆抗體的檢測方法。周國輝等[2] 以?？?FMDV IgG為捕獲抗體，制備的AsiaⅠ型單抗ⅠB4為檢測抗體，建立了AsiaⅠ型 FMDV 的抗原捕獲 ELISA檢測方法，該方法可檢出0.5859 μg 純化的 AsiaⅠ型 FMDV 和2.5×103TCID50病毒。李任峰等[3]用O型完整病毒制備的多抗和單抗2G12，分別作為捕獲抗體和檢測抗體建立的雙抗夾心ELISA，可檢測出含量90 ng 的病毒。楊沁[4]等以C型FMDV重組 VP1蛋白為抗原，制備單克隆抗體與O、A sial、A型FMDV 以及豬水皰病病毒無交叉反應，為C型FMD的診斷及預防提供基礎材料。孫靜[5]等用純化的A型FMDV為抗原制備了單克隆抗體，并以此建立了抗原捕獲ELISA方法，該方法為A型FMDV抗原檢測提供了一種實用且有效的技術手段。石正旺[6]等以O型FMDV為抗原制備單克隆抗體并建立快速特異性檢測方法，可有效區(qū)分豬水皰病病毒、A 型和 Asia-I 型 FMDV，敏感性結果與RT-PCR檢測結果相符，在批內和批間均具有較好的重復性。林彤[7]等結合羊抗鼠IgG和用檸檬酸三鈉還原法標記的抗AsiaⅠ型單克隆抗體，研制出檢測AsiaⅠ型FMDV的膠體金免疫層析試紙條，在保證操作簡便、快速、靈敏的基礎上，滿足了實驗人員外出采樣時所遇到的保存、運輸、結果可靠性的問題。張懷宇[8]等用制備的4株抗 AsiaⅠ型FMDV 的單抗建立了ELISA方法，用于檢測成品疫苗的FMDV乳化前滅活抗原中的總抗原含量，從而改進不同組織培養(yǎng)方法帶來的影響，從而保證疫苗的免疫效率。

2.2 抗體的檢測

口蹄疫是一個全球性動物疾病，對于該病的控制與消滅，西方發(fā)達國家采用捕殺的方式進行應對，以達到“無口蹄疫區(qū)”的效果，而對于發(fā)展中國家和落后國家來講該方法極為不適，大范圍的注射疫苗可以有效的控制疫情的暴發(fā)，但要想使疫苗發(fā)揮更好的作用，就需要準確地區(qū)分出疫苗免疫動物和自然感染動物。目前，結果可信度較高的區(qū)分自然感染動物和疫苗免疫動物的方法是檢測動物體內抗非結構蛋白3B和多聚蛋白 3ABC的抗體。國內尚無利用單克隆抗體制備檢測試劑來區(qū)分口蹄疫自然感染動物和疫苗免疫動物的。

我國目前內任采用大范圍注射常規(guī)滅活疫苗免疫來控制FMD的流行。且采用國際上最常用的病毒中和試驗和液相阻斷ELISA方法[9]來檢測免疫動物的抗體水平。鑒于傳統(tǒng)檢測方法檢測周期長，實驗室采用的分子生物學方法受條件制約不利于基層推廣，而ELISA 檢測法操作簡單、快捷、重復性好、靈敏度高，便于大范圍推廣和用于批量檢測，因此，許多學者致力于FMD的ELISA 檢測方法的研制。向敏等[9] 利用AsiaⅠ口蹄疫病毒vp2蛋白制備單克隆抗體，并建立了單抗競爭ELISA方法，檢測AsiaⅠ型口蹄疫抗體，臨床應用表明，該方法與UBI公司的口蹄疫全病毒抗體檢測試劑盒及荷蘭賽迪公司的口蹄疫病毒LPB-ELISA抗體檢測試劑盒總符合率達89.0%與86.5%。林彤[10]等分別用純化的AsiaⅠ型VP1蛋白和標記的抗AsiaⅠ型FMDV的單克隆抗體作為抗原和抗體，建立單克隆抗體競爭ELISA用于AsiaⅠ型豬FMDV抗體的監(jiān)測。利用特異性和敏感性較高的單克隆抗體建立的競爭 ELISA，不僅可以避免利用多抗檢測時出現(xiàn)的非特異性的影響，還可通過酶標的方法檢測多宿主動物樣品，從而達到更高的抗體監(jiān)測水平。

3 結語

作為“政治經濟病”的動物傳染病，口蹄疫防控與治理依然受到世界各地的關注?，F(xiàn)階段我國口蹄疫的流行以O型和A型為主。雖然目前使用的ELISA方法可區(qū)分 FMDV 的 7 種血清型抗原及豬水泡病病毒（SVDV），但由于O型和A型的抗原性很廣，很難區(qū)分疫苗株與田間分離株，制備出特性的檢測試劑，有效區(qū)分自然感染動物和注苗動物的極為緊迫。目前，國內致力于口蹄疫單克隆抗體研究的學者很多，而利用單克隆抗體制備出有效檢測試劑的很少，選取優(yōu)勢、特異且廣譜的抗原表位獲取抗原，制備高特異性的單克隆抗體，使FMDV的單克隆抗體在易感動物的被動免疫中發(fā)揮出其潛在的應用價值，提高檢測結果的精確度，使單克隆抗體技術在口蹄疫防治工作更加完美的實現(xiàn)其價值。

參考文獻

[1]何繼軍，郭建宏，劉湘濤.我國口蹄疫流行現(xiàn)狀與控制策略 [J].中國動物檢疫， 2015，32（6）：10-14.

[2]周國輝，李萬，趙磊，等.抗AsiaⅠ型口蹄疫病毒單克隆抗體的制備及抗原捕獲EUSA檢測口蹄疫病毒的研究[J].中國預防獸醫(yī)學報，2007，29（12）：960-964.

[3]李任峰，何啟蓋，劉正飛，等.口蹄疫病毒單克隆抗體的制備及檢測應用[J]. 生物技術通報， 2006，增刊：544-548.

[4]楊沁，林彤，?；菔|，等. C型口蹄疫病毒單克隆抗體的制備與鑒定[J]. 甘肅農業(yè)大學學報，2013，1（48） ：1-5.

[5]孫靜，周國輝，王幸等. 抗A型口蹄疫病毒單克隆抗體的制備及抗原捕獲 ELI SA 檢測方法的建立[J]. 中國預防獸醫(yī)學報， 2013，35（2）：146-150.

[6]石正旺等.O型FMD固相競爭ELISA及雙抗夾心ELISA方法的建立與應用.甘肅農業(yè)大學， 2016 屆碩士學位論文， 2016 ：18-38.

[7]林彤，邵軍軍，叢國正，等.AsiaⅠ型口蹄疫病毒膠體金免疫層析檢測方法的建立[J].生物工程學報， 2009，25（5）：767-772.

[8]張懷宇，王泰健，趙耘，等. 抗AsiaⅠ型口蹄疫單克隆抗體的制備及初步應用[C].中國畜牧獸醫(yī)學會 2006 學術年會， 2006：772-776.

[9]向敏，張克山，盧順，等.AsiaⅠ口蹄疫VP2蛋白單克隆抗體的制備及單抗競爭ELISA方法的建立[J]. 生物工程學報， 2008，24（9）：1664-1669.

[10]林彤， 邵軍軍， 叢國正， 等. 利用Asia1型口蹄疫病毒VP1蛋白的單克隆抗體建立單抗競爭ELISA 方法[J]. 安徽農業(yè)科學，2009，37（23）：11025-11026.