利用SSR分子標(biāo)記研究白菜類亞種資源的遺傳多樣性

李光光　黃紅弟　張華　鄭巖松　李榮華

摘 要 為研究幾種白菜類亞種資源的演變過程，利用白菜SSR引物對94份白菜類亞種種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，19對SSR引物擴增出137個條帶，平均每對引物可擴增出7.16個；多態(tài)性位點百分率（P）、基因雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon-Wiener指數(shù)（H）和多態(tài)信息含量（PIC）的均值分別為：99.9%、0.897、11.598、2.454、0.886，除P值外，4個指標(biāo)間相關(guān)性極顯著；94份白菜類亞種種質(zhì)資源的UPGMA聚類結(jié)果表明：在遺傳相似系數(shù)為0.58時實驗材料分為3類，多數(shù)地方種菜心與小白菜親緣關(guān)系更近。白菜SSR引物對大（?。┌撞嘶蚪M具有較好的多態(tài)性、紅菜苔次之、野生芥菜最低。

關(guān)鍵詞 白菜類亞種資源；SSR；遺傳多樣性；親緣關(guān)系

中圖分類號 S330 文獻標(biāo)識碼 A

Abstract In order to analyze the evolution of Chinese cabbage[ssp. chinensis（L.）Makino]resource， a total of 94 Chinese cabbage[ssp. chinensis（L.）Makino]materials were used to assess the genetic diversity. The results showed that， nineteen cabbage SSR primers combinations amplified 137 alleles， 7.16 loci on average for each pair of primers. The average of polymorphism loci percentage（P）， genetic heterozygosity（He）， effective number of alleles（Ne）， Shannon-Wiener index（H）and polymorphism information content（PIC）was 99.9%， 0.897， 11.598， 2.454， 0.886， respectively， and there were extremely significant correlation among them except P value. 94 Chinese cabbage[ssp. chinensis（L.）Makino]materials were clustered into three groups by UPGMA when GSC was 0.58， much of local Chinese cabbage was closer relationships with pakchoi. The order of genome amplification polymorphism by Chinese cabbage SSR primers was（small）cabbage， red bolt second lowest and wild mustard.

Key words Chinese cabbage[ssp. chinensis（L.）Makino]resource； SSR； genetic diversity； genetic relationship

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.021

蕓薹屬白菜類蔬菜[Brassica campestris L. ssp. chinensis（L.）Makino var. communis Tsen et Lee]為A基因組，除了大白菜外，其亞種有5個變種：普通白菜變種（var. communis Tsen et Lee）、烏塌菜變種（var. rosularis Tsen et Lee）、菜薹變種（var. utilize Tsen et Lee）、紫菜薹變種（var. purpurea Bailey）及薹菜變種（var. tai-tsai Hort），經(jīng)過自然及人工選擇形成了類型豐富的群體。普通白菜變種中的不結(jié)球白菜（Brassica rapa L. ssp. chinensis Makino）及菜薹變種中的菜心（Brassica campestris L. ssp. chinensis var. utilis Tsen et Lee）多數(shù)起源于華南地區(qū)，具有生長期短、適應(yīng)好及營養(yǎng)好等特點，經(jīng)過長期的種植及選擇，在華南地區(qū)產(chǎn)生了不同的地方種資源及商品種材料。相關(guān)研究對一些白菜類資源已進行了分類及遺傳多樣性研究，但由于白菜類作物屬于異花授粉類型，較高的異交率及地方長期選擇后，逐漸在形態(tài)、生長發(fā)育等方面出現(xiàn)較為復(fù)雜的變異，不利于該類資源的創(chuàng)新利用。

種質(zhì)資源是遺傳育種選育的材料來源，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及品種創(chuàng)新具有重要意義。白菜類蔬菜作物的品種鑒定、遺傳多樣性及親緣關(guān)系的鑒定報導(dǎo)多是利用RAPD、SRAP、ISSR、SSR、MFLP等[1-5]，由于SSR為共顯性分子標(biāo)記技術(shù)，操作簡單，重復(fù)性好，可隨機、均勻的分布在擴增的基因組內(nèi)，被普遍用于遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位、遺傳多樣性和指紋譜圖的繪制[5]。根據(jù)基因組遺傳信息開發(fā)出的SSR引物，對于屬內(nèi)作物，還具有一定的通用性，有利于同屬的作物的資源評價分析，并對研究屬內(nèi)群體的性狀演化起到借鑒作用。

目前分子標(biāo)記技術(shù)多是針對白菜類作物的商品種進行研究，對群體內(nèi)的自交系本身及自交系與商品種之間的演變研究還未見報道。本試驗利用開發(fā)出的19對大白菜基因組SSR引物，對白菜類亞種資源群體內(nèi)結(jié)構(gòu)特點及遺傳多樣性進行分析，以期為白菜類亞種作物進行育種材料的遺傳改良、基因庫的構(gòu)建提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

94份試驗材料（表1）均為菜心課題組改良的中間材料及在種子市場購買的商品種和田間收集的地方種，所有材料均種植在廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院花都試驗基地，常規(guī)田間管理。

1.2 方法

改良CTAB 法提取試驗材料嫩葉中的DNA，PCR反應(yīng)體系組成及擴增過程按照張婉等[6]方法，銀染檢測6%聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果。0-1記錄條帶的有無，計算各引物下的多態(tài)性百分率，NTSYS-pc 2.10e軟件分析0-1矩陣，通過UPGMA法生成聚類圖，構(gòu)建白菜類亞種資源的遺傳多樣性。

按照張超等[7]方法計算遺傳多樣性相關(guān)指標(biāo)，獲得雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon-Wiener指數(shù)（H）、多態(tài)性位點百分率（P）、多態(tài)信息含量（PIC）等相關(guān)信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 白菜SSR引物多態(tài)性分析

利用19對白菜SSR引物對94份白菜類蔬菜基因組DNA進行擴增，獲得了137個條帶，多態(tài)性條帶占總條帶的99.27%。每個引物可擴增得到多態(tài)性條帶3～12個、平均7.16個，說明94份參試材料的遺傳信息較多，見圖1（A-B）。

2.2 遺傳多樣性指標(biāo)分析

試驗材料的多態(tài)性位點百分率（P）為97.5%～100%，多態(tài)性>50%，表明19對白菜基因組SSR引物能擴增出豐富的遺傳信息；基因雜合度（He）均值為0.897，變化范圍為0.729～0.948；有效等位基因數(shù)（Ne）為11.598，變化范圍為3.694～19.354；Shannon-Wiener指數(shù)（H）均值為2.454，變化范圍為1.409～3.010；多態(tài)信息含量（PIC）均值為0.886，變化范圍為0.680～0.946，這些遺傳多樣性指標(biāo)均表明參試白菜類蔬菜群體的遺傳多樣性較強（表2）。

遺傳多樣性指標(biāo)相關(guān)性分析表明（表3），多態(tài)性位點百分率P與其它指標(biāo)之間無任何顯著性相關(guān)，說明P值可以描述引物擴增的多態(tài)性，但不能對試驗群體的遺傳信息豐富度進行說明；而擴增帶數(shù)、He、Ne、H相關(guān)性非常顯著，這些指標(biāo)可以對白菜類蔬菜種質(zhì)資源的多樣性進行描述。

2.3 SSR標(biāo)記的遺傳相似性分析

0-1矩陣的相似性分析結(jié)果（圖2）表明，94份白菜類蔬菜遺傳相似性系數(shù)為0.321～0.927，平均相似性系數(shù)為0.624、基本上與遺傳系數(shù)的跨度距離相當(dāng)；遺傳系數(shù)0.50～0.75的范圍內(nèi)包含了86.02%的白菜類蔬菜，說明這些蔬菜親緣關(guān)系較近，可以進行種內(nèi)/間雜交來擴大種質(zhì)資源的利用效率。

2.4 白菜類蔬菜的聚類分析

利用UPGMA對試驗材料的遺傳相似系數(shù)進行聚類，結(jié)果（圖3）表明，在遺傳相似系數(shù)為（GSC）0.58時分為3類。第Ⅰ類中包括群體ⅰ的小白菜C63（563小白菜）和C64（甜脆小白菜）相似性系數(shù)為0.766，說明兩者多數(shù)性狀相同，可能具有相同的親本來源；群體ⅱ有小白菜、紅菜苔及大白菜多個類型，說明白菜基因組SSR引物在這個群體中具有一定的遺傳信息基礎(chǔ)；群體ⅲ為地方種菜心類型（如C13連州菜心、C22增城一號遲菜心），說明這些材料起源于小白菜類，而遺傳信息比小白菜類較少，可能是人工選擇導(dǎo)致性狀改變。

第Ⅱ類群體聚類先后為小白菜、紅菜苔及野生芥菜，說明這幾個材料的基因組所攜帶的保守信息有數(shù)量上的差異，選用的SSR引物對小白菜基因組具有較好的多態(tài)性、紅菜苔次之、野生芥菜最少。第Ⅲ類有大白菜、小白菜、菜心、紅菜苔及烏塌菜，與C20（桂林卷葉甜脆）較近的C85（矮腳束腰青江白）、C86（矮腳奶白菜）聚在一起，說明地方種菜心具有的遺傳信息較多，且起源于小白菜，而地方種菜心C21（十月柳-4-2-2）即使經(jīng)過低代自交仍然與小白菜C79（白王白菜）、C80（玉兔黑葉白）聚在一起；具有相同親本的C24（遲2-1-4-2-2）與C32（遲2-1-4-1-2-2-2），C23（遲4-1-3-5）、C33（遲4-1-3-1-6-3-1-2）與C54（遲4-1-3-5-2-3-2）等并沒有聚在一起，表明菜心的變異性較高，人工選擇會產(chǎn)生明顯的遺傳信息缺失；商品種的C11（中南尖葉甜）與C12（金船尖葉甜）、C14（尖葉菜心50天）與C15（4560菜心）、C6（穗美60 d）與C7（穗美碧綠甜）遺傳相似性非常接近，說明這些品種有相同親本來源，或者本質(zhì)上即為相同的品種而名稱不同；另外其他商品種菜心及育種中間材料較為分散，與大（?。┌撞硕加芯垲?，說明經(jīng)過人工改良的菜心遺傳信息較為復(fù)雜。

3 討論

3.1 白菜SSR引物在白菜類蔬菜基因組的擴增應(yīng)用

相對于經(jīng)濟作物，白菜類蔬菜SSR引物標(biāo)記基本上來源于大白菜和小白菜（普通白菜變種），而近緣物種的引物在同屬、甚至種間（內(nèi)）具有一定的通用性，可用來進行遺傳多樣性分析。不結(jié)球白菜SSR引物在大白菜、四倍體白菜、烏塌菜、芥菜等蔬菜的通用性擴增率均在63%以上[8]；34對大白菜SSR引物在6個白菜（包括大白菜、小白菜、菜心等）品系中有效擴增率為82.35%，在甘藍(lán)、油菜和蘿卜中的成功擴增率分別為85.71%、100%和77.78%[9]。這與本實驗利用19對白菜基因組SSR引物對白菜類蔬菜及野生芥菜的均可獲得擴增條帶（通用性擴增率為100%）的結(jié)果基本一致；而擴增條帶數(shù)量不一，說明白菜類亞種基因組間存在一定的保守信息。

3.2 白菜類蔬菜的遺傳多樣性分析

對94份白菜類蔬菜基因組進行SSR擴增，獲得平均多態(tài)性位點百分率為99.9%，且遺傳相似性系數(shù)為0.321～0.927，群體內(nèi)的遺傳差異很大，說明試驗群體攜帶有很高的遺傳多樣性信息。6個遺傳多樣性指數(shù)方差分析表明：除了多態(tài)性位點百分率P外，擴增帶數(shù)、He、Ne、H相關(guān)性非常顯著，這與李光光等[10]結(jié)果基本一致，這說明P可以描述引物的遺傳信息，但卻不能對試驗群體進行準(zhǔn)確描述。試驗得到的Ne與擴增條帶數(shù)相差0.394～9.354，相差較大，表明群體遺傳變異較大[11-12]；基因雜合度（He）較大說明遺傳變異的大、選擇潛力強[13]；多態(tài)信息含量（PIC）>0.5時，表明群體有高度多態(tài)性位點[14-15]；Shannon-Wiener指數(shù)（H）越大，對于其中繁衍和保護物種多樣性的能力越強[16]。He為0.729～0.948、PIC為 0.680～0.946、H為1.409～3.010，表明本試驗群體內(nèi)所選用的材料變異幅度較大、類型多樣，且可用于選擇的潛力較高、群體多樣性很強，有利于資源的創(chuàng)新利用。

3.3 白菜類亞種資源的聚類分析

白菜類蔬菜類型較多，利用分子標(biāo)記對其群體進行關(guān)聯(lián)作圖來分析其結(jié)構(gòu)組成[17]，是資源利用的重要步驟之一。94份白菜類亞種資源存在遺傳相似性系數(shù)0.35以下的材料，說明群體的類型組成較為豐富，有利于白菜類亞種蔬菜資源的創(chuàng)新利用。

第Ⅰ類中的群體?；旧蠈⒌胤椒N菜心都聚在一起，說明來源于白菜基因組的SSR引物能較好的反映群體的遺傳組成，地方種菜心的起源更接近于小白菜，這與地方種增城遲菜心更接近于紫菜薹類型喬燕春等[18]的結(jié)果不盡一致，可能是其表型性狀的調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)偏差影響了總體的聚類分析。第Ⅱ類群體的聚類順序說明同屬的SSR引物能對親緣關(guān)系較近的材料基因組擴增出的遺傳信息較多，亞種變種次之，屬內(nèi)擴增的最少。第Ⅲ類基本上將試驗材料類型都聚在一起，其中屬于華南地方種菜心與小白菜聚在一起，與第Ⅰ類中的群體ⅲ上的聚類結(jié)果一致，說明地方種更趨向于普通白菜，經(jīng)低代自交后，遺傳信息變化不大；而經(jīng)多代人工自交選育的商品種菜心，與大（?。┌撞司垲悰]有明顯的規(guī)律，說明商品種菜心的遺傳關(guān)系較為復(fù)雜。

野生二倍體蕓薹屬B. rapa（2n=20，AA）經(jīng)自然選擇及人工馴化栽培形成了資源類型豐富的白菜類作物，一般認(rèn)為先形成不結(jié)球的小白菜，再經(jīng)過長期的選擇更形成了塌菜等5大形態(tài)不同的變種[19]；另外野生芥菜（B. juncea）也是由野生B. rapa演化為而來的異源四倍體次生種，這些作物在形態(tài)上的差異較大，但由于具有較高的異交率，會使遺傳信息在一定程度上得到保留。本實驗包括大（?。┌撞?、菜心、紅菜薹、烏塌菜、野生芥菜5個類型的蕓薹屬材料，94份白菜類蔬菜聚為3大類，各類組成沒有明顯的群體結(jié)構(gòu)，說明白菜類亞種資源在自然及人工作用下，可以較為容易的實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移，為擴大性狀的遺傳改良提供了豐富的資源基礎(chǔ)。

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