火龍果莖多糖的超高壓提取及抗氧化活性研究

郭淼　宋江峰　王傳凱

摘 要 為研究火龍果莖多糖的超高壓提取工藝及抗氧化活性。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析方法，確定超高壓提取的最優(yōu)工藝，并從清除ABTS自由基和DPPH自由基能力方面來評(píng)價(jià)火龍果莖多糖的體外抗氧化能力。結(jié)果表明，火龍果莖多糖的超高壓提取的最佳工藝條件為：液固比10 ∶ 1（mL ∶ g）、超高壓壓力300 MPa、超高壓時(shí)間4 min。在此工藝條件下多糖得率為（2.83±0.02）%?；瘕埞o對(duì)ABTS自由基和DPPH自由基具有清除作用，對(duì)ABTS自由基和DPPH自由基的清除率IC50分別為濃度為4.3 mg/mL和5.5 mg/mL時(shí)。

關(guān)鍵詞 火龍果莖；多糖；超高壓；抗氧化

中圖分類號(hào) TS201.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract To study the technology of ultra high pressure extraction and analysis its antioxidannt activity of polysaccharides from pulp pitaya stem， on the basis of single factor experiments， the optimal processing conditions were determined by means of response surface analysis and Box-Behnken design. The results showed that the optimum extraction conditions of the polysaccharides from pulp pitaya stem were as follows： liquid to solid ratio10 ∶ 1（mL/g）， pressure 300 MPa and extraction time 4min. Under the conditions， the extraction yield of the polysaccharides from pulp pitaya stem reached（2.83±0.02）%. The polysaccharides from pulp pitaya stem had the ABTS and DPPH scavenging activity. The mass concentration of IC50 was 4.3 mg/mL and 5.5 mg/mL， respectively. This study could provide useful references for the development and exploitation of the polysaccharides from pulp pitaya stem.

Key words pulp pitaya stem； polysaccharides； ultra high pressure； antioxidant

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.030

火龍果（Hylocerus undatus），為仙人掌科量天尺屬植物，其營養(yǎng)豐富，含有多糖、黃酮、皂苷、植物甾醇、黃酮等活性成分[1-3]，近年來，在我國南部區(qū)域海南省、廣西自治區(qū)等大量栽種?；瘕埞烧蟮那o桿為火龍果莖，富含多糖等活性成分[4-6]，目前往往作為廢棄物丟棄，不僅污染環(huán)境，還造成資源浪費(fèi)。因此，對(duì)火龍果莖多糖進(jìn)行提取利用，可提高火龍果種植的經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)火龍果的開發(fā)利用具有重要意義。

目前，火龍果莖多糖的提取方法為熱水浸提法，其提取時(shí)間長，提取溫度高，得率低；何聰芬等[7]采用熱水浸提法提取火龍果莖多糖，提取得率僅為0.96%。近年來，一些研究者研究強(qiáng)化多糖提取的方法。超高壓提取作為一種新型的提取方法，在多糖的提取上得到研究，王新新等[8]采用超高壓提取瓜蔞多糖，Bai等[9]采用超高壓提取龍眼多糖，但采用超高壓提取火龍果莖多糖尚未見報(bào)道，對(duì)其抗氧化活性也缺乏研究。因此，本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化超高壓提取火龍果莖多糖的最佳工藝參數(shù)，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行抗氧化活性研究，以期為火龍果莖的開發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為‘黔果2號(hào)火龍果莖，2015年11月采自?？谑薪迹烧笄逑?、置冰箱中冷藏備用；D-葡萄糖、苯酚、濃硫酸來自北京譜析科技有限公司；DPPH、ABTS來自美國sigma公司，以上試劑均為分析純。

751-GD紫外可見光分光光度計(jì)（上海分析儀器總廠）、RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、UHP900×2-Z超高壓處理裝置（包頭科發(fā)公司）。

1.2 方法

1.2.1 超高壓提取火龍果莖多糖 稱取一定量的火龍果莖，切碎，加入不同體積純水，裝入聚乙烯塑料袋，混合均勻后真空封口，將包裝后的塑料袋放入超高壓裝置的工作介質(zhì)中，在設(shè)定壓力下超高壓處理一定時(shí)間后，取出，提取液在4 000 r/min離心20 min，上清液真空濃縮后，加入無水乙醇，使乙醇濃度達(dá)到85%，然后放在4 ℃的冰箱中過夜，移去上層上清液，將下層沉淀冷凍干燥，即為火龍果莖粗多糖。

1.2.2 多糖含量的測定 采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[10-11]。

1.2.3 超高壓提取火龍果莖多糖工藝條件的優(yōu)化

以多糖的得率為指標(biāo)，采用單因素法，以液固比（5 ∶ 1、10 ∶ 1、15 ∶ 1、20 ∶ 1、25 ∶ 1）（mL ∶ g）、超高壓壓力（100、200、300、400 MPa）（0.1 MPa作為對(duì)照）、和超高壓處理時(shí)間（2、3、4、5、6 min）為影響因素，考察其對(duì)多糖得率的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，選擇液固比、超高壓壓力和超高壓處理時(shí)間為自變量，以多糖的得率為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.5b軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面分析，優(yōu)化提取條件，因素與水平表見表1。

1.2.4 清除ABTS自由基能力測定 采用WANG等方法并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整[12]，將7 mmol/L的ABTS與2.45 mmol/L的過硫酸鉀混合，放在暗處16 h，得到ABTS自由基離子；在734 nm下將離子溶液的吸光值調(diào)整為0.700±0.02，30 ℃下平衡30 min；然后將2.0 mL ABTS離子液和0.2 mL待測樣品在室溫混合均勻，反應(yīng)20 min后，于734 nm處測定吸光值，ABTS自由基清除能力C1為：

1.2.5 DPPH自由基清除活性 采用WANG等方法并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整[12]，將3 mL 0.1 mmol/L DPPH（95%乙醇配成），加入2 mL待測樣品，在室溫下避光保持30 min后，采用517 nm測定吸光值。按下式計(jì)算DPPH自由基清除率C2（%）。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為mean±S，采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 液固比對(duì)火龍果莖多糖得率的影響 不同液固比對(duì)火龍果莖多糖得率的影響結(jié)果如圖1所示，液固比在5 ∶ 1～15 ∶ 1之間時(shí)，多糖得率隨溶劑用量的增加而迅速提高，液料比達(dá)到15 ∶ 1后，得率變化不顯著（p>0.05）。因此液固比以15 ∶ 1（mL ∶ g）為宜。

2.1.2 超高壓壓力對(duì)火龍果莖多糖得率的影響

不同超高壓壓力對(duì)火龍果莖多糖得率的影響結(jié)果如圖2所示，隨著超高壓壓力的增加，超高壓壓力對(duì)細(xì)胞壁的破碎作用增強(qiáng)，火龍果莖多糖溶出速率增大，得率逐漸增加，超高壓壓力過300 MPa時(shí)，得率變化不顯著（p>0.05）?？赡苁窃搲毫σ呀?jīng)將細(xì)胞完全破壞。因此超高壓壓力以300 MPa為宜。

2.1.3 不同超高壓時(shí)間對(duì)火龍果莖多糖得率的影響

不同超高壓時(shí)間對(duì)火龍果莖多糖得率的影響如圖3所示，在2～4 min時(shí)，多糖得率隨著時(shí)間的增加而迅速提高，達(dá)到4 min后，得率隨后有所下降。其原因可能是隨著超高壓時(shí)間的增加，超高壓下細(xì)胞破碎度逐漸增大，過多碎片阻礙多糖溶出，導(dǎo)致得率下降。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化超高壓提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以火龍果莖多糖得率為指標(biāo)，液固比（A）、超高壓壓力（B）和超高壓時(shí)間（C）為因素，進(jìn)行三因素三水平17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

運(yùn)用Design Expert 8.0.5b數(shù)軟件對(duì)表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得火龍果莖多糖得率與各因素的二次多項(xiàng)式回歸模型為：Y=2.84+0.048A+0.026B-0.079C-0.075AC+0.017BC-0.16A2-0.39B2-0.13C2回歸模型進(jìn)行方差分析和回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3，從表3可以看出，該二次回歸方程模型極顯著（p<0.000 1），模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.928 6，表明該模型可以解釋92.86%的響應(yīng)值Y的變化?；貧w方程的相關(guān)系數(shù)（R2=0.928 6， Adj-R2=0.968 7，Pred-R2=0.824 6）及變異系數(shù)CV（2.71%）均表明模型方程能夠較好地反映真實(shí)的試驗(yàn)值。 該方程與實(shí)際情況擬合很好，較好地反映了多糖得率與液料比、超高壓壓力300 MPa、超高壓時(shí)間的關(guān)系；模型一次項(xiàng)B對(duì)響應(yīng)值Y影響顯著（p<0.05），二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值Y影響都極顯著（p<0.01），說明分析結(jié)果可靠；模型交互作用不顯著。根據(jù)F值大小，可知各因素對(duì)火龍果莖多糖得率影響的程度依次是超高壓時(shí)間>液料比>超高壓壓力。

響應(yīng)曲面圖見圖4。從圖中可以看出，2個(gè)參數(shù)之間的相互作用對(duì)得率影響的響應(yīng)面分析圖為山丘曲面時(shí)，特征值為正值，均有極大值存在；而等高線均為橢圓形，表示兩兩相互作用顯著。

2.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 運(yùn)用Design Expert 8.0.5b軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化分析，確定最佳提取條件為：液固比10 ∶ 1（mL ∶ g）、超高壓壓力300 MPa、超高壓時(shí)間4 min，在該提取條件下，預(yù)測火龍果莖多糖得率可達(dá)到2.84%。采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，火龍果莖多糖得率實(shí)測值為（2.83±0.02）%，表明實(shí)測值與預(yù)測值基本吻合，該模型能較好的預(yù)測超高壓提取火龍果莖多糖得率。

2.2.3 與傳統(tǒng)熱水浸提法的對(duì)比 按文獻(xiàn)報(bào)道的傳統(tǒng)熱水浸提法進(jìn)行提取火龍果莖多糖[6]，火龍果莖多糖的工藝條件為：液料比20 ∶ 1、溫度80 ℃、提取時(shí)間4 h，提取3次，在此條件下，火龍果莖多糖得率為 1.02%。在本研究所得最佳的工藝條件下，火龍果莖多糖得率為 2.84%，不僅比傳統(tǒng)熱水浸提法得率提高2.8倍，且提取時(shí)間由4 h減少為4 min。說明該方法不僅得率高，且提取時(shí)間短，可有效地應(yīng)用火龍果莖多糖的提取。

2.3 超高壓提取火龍果莖多糖抗氧化實(shí)驗(yàn)

2.3.1 ABTS自由基清除率 火龍果莖多糖對(duì)ABTS自由基清除率的測定結(jié)果見圖5。由圖5可知，超高壓提取和常規(guī)熱水提取的火龍果莖多糖對(duì)ABTS自由基的清除率隨樣品濃度升高而增大；但相對(duì)于同濃度的Vc溶液相對(duì)較弱，超高壓提取的火龍果莖多糖對(duì)ABTS自由基清除率IC50的濃度為4.3 mg/mL，常規(guī)熱水提取的火龍果莖多糖對(duì)ABTS自由基清除率IC50的濃度為4.4 mg/mL。二者相差不顯著。

2.3.2 DPPH自由基清除率 火龍果莖多糖對(duì) DPPH自由基清除率的測定結(jié)果見圖6。由圖6可知，超高壓提取和常規(guī)熱水提取的火龍果莖多糖對(duì)DPPH自由基的清除率隨樣品濃度升高而增大；但相對(duì)于同濃度的Vc溶液相對(duì)較弱，火龍果莖多糖對(duì)DPPH自由基清除率IC50的濃度為5.5 mg/mL。常規(guī)熱水提取的火龍果莖多糖對(duì)DPPH自由基清除率IC50的濃度為5.9 mg/mL，二者相差不顯著。

3 討論

目前，傳統(tǒng)火龍果莖多糖采用傳統(tǒng)熱水浸提法，提取溫度80 ℃、提取時(shí)間需要4 h，火龍果莖多糖得率僅為1.02%。而本研究采用超高壓提取工藝提取火龍果莖多糖，提取溶劑仍為水，但采用超高壓處理強(qiáng)化提取過程，不僅提取得率高，而且時(shí)間短，通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果得到多糖提取的優(yōu)化條件為液料比10 ∶ 1（mL ∶ g）、超高壓壓力300 MPa、超高壓時(shí)間4 min。在此工藝條件下多糖得率為（2.83±0.02）%。超高壓提取之所以具有較高的提取得率和較短的提取時(shí)間，是因?yàn)樵诔邏合?，火龍果莖中的細(xì)胞被高壓作用后導(dǎo)致細(xì)胞快速破裂，破裂的細(xì)胞中的多糖得以容易釋放。壓力越高，細(xì)胞越容易破壞，但當(dāng)壓力達(dá)到300 MPa后，細(xì)胞已經(jīng)破壞完全，因此，繼續(xù)增加壓力，細(xì)胞也不再破裂，導(dǎo)致得率不再增加[13-14]；在相同的壓力下，壓力維持時(shí)間越長，細(xì)胞越容易破壞，但當(dāng)時(shí)間達(dá)到一定數(shù)值后，細(xì)胞已經(jīng)破壞完全，因此，繼續(xù)增加時(shí)間，細(xì)胞也不再破裂，得率不再增加。此外，根據(jù)傳質(zhì)理論，加壓處理能夠細(xì)胞的滲透性增加，同時(shí)，根據(jù)相變理論，生物活性成分的溶解度隨著壓力增加而增加，因此超高壓處理加快了傳質(zhì)過程[15]。

許多植物多糖均具有較強(qiáng)的抗氧化活性，本研究發(fā)現(xiàn)火龍果莖對(duì)ABTS自由基和DPPH自由基具有清除作用，對(duì)ABTS自由基和DPPH自由基的清除率IC50分別為濃度為4.3 mg/mL和5.5 mg/mL時(shí)。表明火龍果莖多糖也具有抗氧化作用。但目前對(duì)于火龍果莖多糖的研究尚處于初級(jí)階段，后續(xù)需要對(duì)其結(jié)構(gòu)鑒定和藥理性質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步研究，為龍果莖多糖開發(fā)提供技術(shù)支持。

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