胡椒連作對土壤微生物群落功能多樣性與群落結(jié)構(gòu)的影響

王燦　李志剛　楊建峰　祖超　鄭維全　鄔華松　魚歡

摘 要 連作障礙嚴(yán)重威脅中國胡椒優(yōu)勢種植區(qū)可持續(xù)發(fā)展，而土壤微生物多樣性下降、群落結(jié)構(gòu)失衡是連作障礙形成的重要原因之一。為了探明胡椒連作障礙與微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)變化之間的關(guān)系，揭示胡椒連作障礙形成的微生物機(jī)理，本文采用BIOLOG微平板法研究了海南萬寧8、18和28 a 3種不同種植年限胡椒園土壤微生物群落功能多樣性和群落結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明：隨種植年限增加，不同園塊之間穩(wěn)定并達(dá)到最大的平均吸光度值（AWCD）呈明顯下降趨勢；香農(nóng)指數(shù)、香農(nóng)均勻度等多樣性指數(shù)亦隨種植年限增加呈顯著下降趨勢，而辛普森優(yōu)勢度指數(shù)無顯著性差異；微生物群落結(jié)構(gòu)隨著年限增加出現(xiàn)了2次明顯變化，第1次群落結(jié)構(gòu)變化發(fā)生在8～18 a階段，主要與酚酸類和多聚物類碳源利用微生物大幅減少有關(guān)，第2次則發(fā)生在18～28 a階段，與碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類和胺類相關(guān)利用微生物減少有關(guān)。因此，胡椒連作顯著降低了土壤中微生物多樣性，改變了微生物群落結(jié)構(gòu)，是胡椒連作障礙形成的重要原因之一。

關(guān)鍵詞 胡椒；連作障礙；BIOLOG；微生物功能多樣性；微生物群落結(jié)構(gòu)

中圖分類號 S182 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Consecutive monoculture induces black pepper（Piper nigrum L.）poor growth， low yield， and serious soil-borne disease， thus becomes one of the most serious threats to the sustainable development of black pepper industry in China. To investigate its microbiological formation mechanisms， the soil samples from black pepper orchards with consecutive monoculture for 8， 18 and 28 years were analyzed by using the BIOLOG EcoPlates method and the responses of soil microbial functional diversity and community structure to different planting ages were demonstrated as follow. It revealed that average well color development（AWCD）obviously decreased with increasing planting duration. The same tendency was also demonstrated in soil microbial diversity indices， such as Shannon index， Shannon evenness index and Simpson index. In addition， the utilization of carbon sources by soil microbes from different planting duration showed significantly different. For example， the utilization rates of phenolic compounds and polymers obviously decreased during the period from the 8 th year to the 18th year and those of carbohydrates， amino acids， carboxylic acids and amines obviously decreased from the 18th year to the 28th year， which indicating the soil microbial community structure experienced two obvious changes with planting duration increasing. Furthermore， the principal component analysis（PCA）also showed the soil samples from the three planting duration were clearly separated from each other. These results suggested that consecutive monoculture of P. nigrum L. could decrease soil microbial activity and diversity， change the soil microbial community.

Key words Black pepper（Piper nigrum L.）； obstacle of consecutive monoculture； BIOLOG analysis； soil microbial functional diversity； community structure

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.010

胡椒（Piper nigrum L.）是世界古老而著名的香料，具有較高經(jīng)濟(jì)價值。據(jù)統(tǒng)計，2015年中國胡椒產(chǎn)業(yè)產(chǎn)值已超30億元，其種植、生產(chǎn)和加工已成為熱區(qū)100多萬農(nóng)民脫貧致富的特色作物產(chǎn)業(yè)[1]。受氣候條件限制，中國胡椒主要集中在海南東部，種植面積和產(chǎn)量均占全國的90%以上，種植歷史已達(dá)數(shù)十年。由于胡椒為多年生藤本植物，種植需以水泥柱或石柱作為支撐物，因而新墾胡椒園需要大量投入，這也造成種植時多以單一園塊連續(xù)種植為主。近年來，隨著種植年限增加，以單一連作為主要模式的海南優(yōu)勢種植區(qū)逐步出現(xiàn)連作障礙現(xiàn)象，表現(xiàn)為連作園補(bǔ)種幼苗生長緩慢，成齡植株長勢弱，感病率增加，經(jīng)濟(jì)壽命縮短[2]。據(jù)調(diào)查，目前種植區(qū)內(nèi)連續(xù)種植15 a以上的胡椒園約占50%，其中部分胡椒園甚至達(dá)到30～40 a，連作障礙已成為影響中國胡椒產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的重要威脅之一[1-2]。

土壤微生物作為驅(qū)動土壤物質(zhì)循環(huán)、能量流動的重要因子，參與了土壤酶和植物促生類物質(zhì)生成、有機(jī)（自毒）物質(zhì)分解、土壤固定態(tài)養(yǎng)分溶解等諸多土壤生物化學(xué)過程[3]。健康土壤中種類豐富且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的微生物群落能夠保證各自微生物群落充分發(fā)揮自身功能，同時抵抗病原菌侵入，從而表現(xiàn)為較高生產(chǎn)力[4-5]；而長期連作土壤微生物多樣性下降，微生物區(qū)系失衡，參與土壤過程的微生物類群和數(shù)量減少，抵御病原微生物侵入能力下降，從而造成土壤生產(chǎn)力衰退、植株長勢差、病害多發(fā)等連作障礙現(xiàn)象[5-6]。因此，研究連作障礙形成過程中土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化對構(gòu)建健康穩(wěn)定的土壤微生態(tài)環(huán)境具有重要意義，是連作障礙形成機(jī)制研究中的熱點之一[7]。

前期對胡椒連作障礙的研究表明[2]，隨著連作時間增加，土壤微生物總量出現(xiàn)下降，且主要為細(xì)菌和放線菌數(shù)量減少而真菌數(shù)量增加，因而導(dǎo)致群落結(jié)構(gòu)由高肥的“細(xì)菌型”向低肥的“真菌型”轉(zhuǎn)化，這與大豆、黃瓜、棉花等其它作物連作研究基本一致[4，6-9]。但群落結(jié)構(gòu)變化過程中哪些微生物具體類群發(fā)生了變化尚不清楚，這些微生物類群變化與其它土壤物理、化學(xué)等連作障礙因子之間是否存在聯(lián)系還有待進(jìn)一步揭示。BIOLOG微平板法作為一種基于碳源代謝的微生物群落特性分析方法，不僅可以根據(jù)碳源代謝差異對土壤微生物進(jìn)行分類，而且與磷脂脂肪酸PLFA法、分子生物學(xué)PCR-DGGE法、高通量454測序法等研究方法相比具有簡單、快速、成本低等特點，目前廣泛應(yīng)用于土壤微生物群落功能多樣性評價[10-11]。因此，本研究以海南胡椒種植區(qū)不同種植年限胡椒園土壤為研究對象，采用BIOLOG微平板法研究不同種植年限土壤微生物群落變化，以此明確隨種植年限增加土壤中發(fā)生變化的具體微生物類群及其增減趨勢，為明確胡椒連作障礙形成微生態(tài)學(xué)機(jī)制和探索防治措施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗地點為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所胡椒基地，地處海南省萬寧市（18°1′N，110°13′E）。該地區(qū)屬典型熱帶季風(fēng)氣候，年均溫25 ℃，日照時數(shù)1 800～2 300 h，年均降水量2 100 mm，每年5～10月為雨季，當(dāng)年11月到次年4月為旱季，土壤類型為磚紅壤。該基地為研究所《胡椒栽培技術(shù)規(guī)程》（NY/ T 969-2006）標(biāo)準(zhǔn)示范基地，田間管理與施肥方式基本一致。土壤樣品采集時間為2014年4月，樣品分別來自該基地內(nèi)種植年限為8、18和28 a胡椒園，品種為栽培種熱引1號（印尼大葉種），面積各約0.2～0.27 hm2。取樣時以對角線在園塊內(nèi)選取5～7個點做成1個混合樣，每個樣點重復(fù)采樣3次。用小鏟挖開每個點所在胡椒冠幅下土壤，取10～20 cm土層中根系，采用抖土法收集土樣，完畢后放入冰盒后帶回實驗室。用于BIOLOG分析的土樣放入4 ℃冰箱保存；用于土壤基礎(chǔ)理化測定的土樣置于室內(nèi)通風(fēng)陰涼處風(fēng)干，過篩后備用。

1.2 方法

1.2.1 土壤理化性質(zhì)測定 測定均采用常規(guī)方法[12]，具體如下：土壤pH值用電位法（土水比為1 ∶ 2.5）測定；土壤有機(jī)質(zhì)用KCr2O7容量法-外加熱法測定；速效氮用堿解擴(kuò)散法測定；有效磷用0.03 mol/L NH4F-0.025 mol/L HCl浸提-鉬銻抗比色法測定；有效鉀用中性NH4OAc浸提-火焰光度法測定。

1.2.2 土壤微生物群落功能多樣性測定 采用BIOLOG生態(tài)微平板（BIOLOG EcoPlateTM）測定。稱取相當(dāng)于10.00 g烘干質(zhì)量的濕潤土壤于250 mL三角瓶中，加入90 mL無菌去離子水，4 ℃下充分振蕩1 h，靜置3 min后用無菌去離子水配制成10-3土壤懸浮液。用8通道加樣槍吸取此土壤懸浮液150 μL至ECO板的微孔中，每24 h測定590 nm處吸光度值，直至讀數(shù)穩(wěn)定為止，一般培養(yǎng)240 h。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

利用每孔吸光度值計算平均吸光度值（average well colour development， AWCD），利用培養(yǎng)96 h的每孔吸光度值計算香農(nóng)指數(shù)（Shannon index）、香農(nóng)指數(shù)均勻度（Shannon evenness）和辛普森優(yōu)勢度指數(shù)（Simpson index）等多樣性指數(shù)，具體計算方法參見楊永華等[13]和張志明等[14]，數(shù)值計算出后，采用單因素方差分析不同種植年限間的顯著性差異；以96 h的每孔吸光度值進(jìn)行主成分分析（PCA）。單因素方差分析和主成分分析均利用SPSS 19.0軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡椒連作對土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)的影響

由表1可知，隨著種植年限增加，土壤pH和有機(jī)質(zhì)含量均呈顯著下降趨勢，其中8～18 a和18～28 a階段土壤pH分別下降0.22和0.36個單位，有機(jī)質(zhì)含量分別減少0.37 g/kg和2.35 g/kg，表明土壤pH和有機(jī)質(zhì)含量隨連作時間增加，受影響程度越大；土壤速效磷呈上升，速效鉀則下降趨勢，而速效氮含量無顯著差異，這可能與胡椒施肥過程中施入的氮磷多而鉀肥少，引起連作胡椒園土壤養(yǎng)分失衡有關(guān)。

2.2 連作對胡椒園土壤微生物群落功能多樣性的影響

2.2.1 土壤微生物群落碳源利用能力分析 平均吸光度值（AWCD）是表征土壤微生物群落利用碳源能力強(qiáng)弱，反映碳代謝總體活性的重要指標(biāo)[15]。不同種植年限處理的AWCD值隨著培養(yǎng)時間增加均呈“S”型增加（圖1所示），其中24～96 h AWCD增加速率最快，96 h后不同處理間碳代謝活性逐步達(dá)到最大且趨于穩(wěn)定；不同處理間AWCD最大值存在差異，表現(xiàn)為8 a>18 a>28 a，表明隨著連作時間增加，土壤微生物群落碳源利用能力下降，總體碳代謝活性降低。

2.2.2 多樣性指數(shù)分析 采用培養(yǎng)96 h的平板微孔吸光度值，計算不同種植年限下土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)及均勻度。結(jié)果表明，隨著種植年限增加，香農(nóng)指數(shù)、香農(nóng)均勻度和辛普森指數(shù)均呈下降趨勢。其中，18 a和28 a處理的香農(nóng)指數(shù)較8 a處理分別下降19.1%和74.9%，香農(nóng)均勻度指數(shù)分別下降26.3%和63.1%；而辛普森指數(shù)僅分別下降3.1%和9.3%（見表2）。顯著性分析表明，香農(nóng)指數(shù)和香農(nóng)均勻度指數(shù)在不同種植年限處理之間達(dá)到顯著水平（p<0.05），而辛普森指數(shù)在不同處理間無顯著性差異（見表2）。

2.2.3 土壤微生物對不同類型碳源利用的差異

按化學(xué)官能團(tuán)的性質(zhì)對ECO板上的31種碳源分成6類[16]，即糖類及其衍生物、氨基酸、羧酸、多聚物、酚酸類和胺類，將每類碳源的吸光值平均后進(jìn)行分析。從圖2可知，不同種植年限土壤微生物對不同碳源的利用程度差異較大，說明隨著連作時間增加，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。其中，利用多聚物類和酚酸類碳源的微生物最先受到影響，從8 a到18 a這一階段2類微生物有較大程度降低，而此后下降程度不大；而碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類和胺類等碳源利用微生物則在18 a后受連作影響較大，因而表現(xiàn)為28 a明顯下降。

2.3 土壤微生物群落功能多樣性主成分分析

采用培養(yǎng)96 h的平板微孔吸光度值進(jìn)行主成分分析，提取2個主成分因子并做荷載圖（如圖3）。2個主成分因子累計方差貢獻(xiàn)率達(dá)到85.71%，說明2個主成分因子可以很好地解釋不同種植年限土壤之間的絕大多數(shù)差異。其中第1主成分（PC 1）的方差貢獻(xiàn)率為78.99%，第2主成分（PC 2）的方差貢獻(xiàn)率為6.72%。在PC 1軸上，8 a、18 a和28 a分別分布于軸的正值區(qū)、零點區(qū)和負(fù)值區(qū)；在PC 2軸上，18 a主要分布于正值區(qū)，而8 a和28 a分布在負(fù)值區(qū)。因此，利用主成分分析可以很好地將8、18和28 a土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分別劃分在荷載圖第4、第1和第3象限，進(jìn)一步表明胡椒土壤微生物群落結(jié)構(gòu)隨著種植年限增加出現(xiàn)了明顯變化。

分析31種碳源在2個主成分上的荷載值如表3所示。從表中可知，對第1主成分（PC 1）貢獻(xiàn)較大的碳源主要包括D-半乳糖酸內(nèi)酯等9種碳水化合物類碳源、L-精氨酸等4種氨基酸類碳源和r-羥基丁酸等4種羧酸類碳源；對第2主成分（PC 2）貢獻(xiàn)較大的碳源則主要包括N-乙酰基-D-葡萄胺等2種胺類碳源。由于PC 1方差貢獻(xiàn)率為78.99%，表明引起連作胡椒土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的主要種群即碳水化合物類、氨基酸類和羧酸類這3類碳源利用微生物。

3 討論

隨著土地資源日益緊張，中國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中土地利用強(qiáng)度不斷加大，土壤連作障礙現(xiàn)象已十分普遍[17]。連作通常導(dǎo)致作物生長發(fā)育不良，品質(zhì)及產(chǎn)量下降，抗病能力降低。盡管其形成原因較多，但土壤中微生物多樣性下降、群落結(jié)構(gòu)失衡被認(rèn)為是導(dǎo)致土壤生產(chǎn)力下降、作物減產(chǎn)的重要原因之一[8-9，18]。

3.1 胡椒連作對土壤微生物群落功能多樣性的影響

連作土壤一般伴隨著土壤微生物群落功能多樣性降低。時鵬等[19]利用BIOLOG法研究玉米連作土壤表明，連作土壤微生物群落功能多樣性顯著低于非連作土壤。岳冰冰等[20]研究發(fā)現(xiàn)，煙草連作7年土壤微生物功能多樣性顯著低于連作2年處理。張重義等[17]對地黃連作研究表明，隨著種植年限增加，土壤微生物群落多樣性呈下降趨勢。前期對胡椒連作的研究表明[2]，隨著胡椒種植年限增加，土壤微生物總量逐年下降。本研究利用BIOLOG法也發(fā)現(xiàn)，表征31種碳源利用程度的平均吸光度值（AWCD），在不同種植年限土壤之間隨連作時間增加明顯下降（圖1），表明連作土壤微生物群落碳代謝整體能力下降，土壤微生物群落功能多樣性降低，與上述研究結(jié)果一致。

多樣性指數(shù)也反映了微生物群落功能多樣性變化。而且，不同指數(shù)反映多樣性不同側(cè)面，香農(nóng)指數(shù)和香農(nóng)均勻度主要反映群落物種個體數(shù)和分布均勻度，而辛普森指數(shù)反映群落中最常見類群的優(yōu)勢度[10-11，21]。本研究中香農(nóng)指數(shù)和香農(nóng)均勻度結(jié)果與AWCD一致，均隨連作時間增加顯著下降，表明微生物功能多樣性隨年限增加而下降；但辛普森指數(shù)在種植年限間差異不顯著，表明該過程中微生物優(yōu)勢種群可能未發(fā)生明顯變化，又根據(jù)不同類型碳源利用微生物隨種植年限的變化差異可知（圖2），碳水化合物類、氨基酸類和羧酸類等碳源利用微生物受種植年限影響程度較小，是胡椒根際中的優(yōu)勢微生物種群。

3.2 胡椒連作對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

土壤微生物群落功能多樣性反映了群落總體情況，而土壤微生物對不同類型碳源利用的差異，則反映了土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)組成變化[22]。本研究中，6類不同碳源利用微生物AWCD值均隨連作時間增加呈下降趨勢，但出現(xiàn)較大下降的階段存在不同：酚酸類和多聚物類碳源利用微生物出現(xiàn)大幅下降時間相對較早，在連作8～18 a時即明顯下降；而碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類和胺類等則相對較晚，到連作18～28 a才有明顯下降。因而分析不同微生物類群對胡椒連作障礙形成的影響程度，可以更好地理解胡椒連作障礙形成原因。

Badri等[23]利用擬南芥根系分泌物不同組分培養(yǎng)土壤微生物發(fā)現(xiàn)，與其它碳源類組分相比，酚酸類利用微生物物種豐富度更高，對于土壤微生物多樣性和群落組成具有重要意義。本研究中8～18 a階段酚酸類和多聚物類利用微生物活性大幅降低，表明這一時期連作胡椒土壤微生物多樣性出現(xiàn)了第1次明顯下降；而且，與其他碳源利用微生物相比，這2類微生物活性大幅下降的時間相對較早，說明其適應(yīng)外界環(huán)境變化的能力相對較弱，在今后研究中，可將相關(guān)微生物活性開始大幅下降階段作為胡椒連作障礙初始發(fā)生的重要信號。

本研究中，18～28 a階段碳水化合物類、氨基酸類和羧酸類等碳源利用微生物大幅下降，說明這3類微生物適應(yīng)外界環(huán)境變化的能力相對較強(qiáng)。盡管如此，隨著連作年限增加，土壤pH等微生態(tài)環(huán)境不斷惡化，最終造成這些優(yōu)勢微生物活性減弱，此時土壤連作障礙問題也更加明顯。

3.3 土壤微生物群落功能多樣性與胡椒連作障礙的關(guān)系

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，物種越均勻，多樣性越豐富，其抑制病原菌能力越強(qiáng)[5，24]。如Irikiin等[25]研究發(fā)現(xiàn)，番茄青枯病發(fā)病率與BIOLOG ECO板中碳源利用數(shù)目呈負(fù)相關(guān)。董艷等[26]研究也表明，提高土壤微生物多樣性可以顯著降低蠶豆枯萎病的發(fā)生。目前認(rèn)為，微生物群落多樣性的抑病機(jī)理可能與根際生態(tài)位競爭[27-28]或者微生物間碳源營養(yǎng)競爭[28-29]有關(guān)。在本研究中，連作胡椒土壤微生物群落功能多樣性下降，也與實際生產(chǎn)中老齡園病害易發(fā)、產(chǎn)量下降等問題具有一致性。而且研究表明，通過合理施用化肥[30]，增施有機(jī)肥[31]或有機(jī)生物肥[32-33]，采取輪作[34]或間作[35]等大田管理措施來提高根際微生物多樣性，可以有效緩解連作障礙，為今后解決胡椒連作障礙問題提供了參考。

3.4 不同碳源利用微生物與胡椒連作障礙

由前述分析已知，酚酸類利用微生物活性下降是胡椒連作障礙開始的重要信號。但引起連作障礙的原因除了酚酸類利用微生物大幅減少會造成土壤微生物多樣性下降、群落結(jié)構(gòu)失衡外，還可能與其大幅減少引起胡椒根際中酚酸類物質(zhì)積累有關(guān)。大豆、煙草等研究已表明，酚酸類物質(zhì)是重要的化感物質(zhì)，長期連作導(dǎo)致其在土壤中累積是造成連作障礙發(fā)生的重要原因[36-37]。本研究中，酚酸類碳源利用微生物在8～18 a時大幅減少，表明此時胡椒根際中酚酸類物質(zhì)分解速率將大大降低，未被分解利用的酚酸類物質(zhì)在土壤中大量累積，從而表現(xiàn)為較強(qiáng)的化感作用。國外也有報道[38]，巴西、泰國、馬來西亞等胡椒主產(chǎn)國在胡椒種植15 a左右時就會輪作，否則胡椒產(chǎn)量就會大幅降低，進(jìn)一步證實了15～18 a這一階段是胡椒連作障礙開始發(fā)生的主要時期。但該時期連作障礙形成機(jī)制仍需在今后研究中取得更直接的證據(jù)予以證實。

碳水化合物、氨基酸和羧酸類碳源利用微生物也與連作障礙形成密切相關(guān)。碳水化合物類物質(zhì)是根際微生物利用最廣泛的碳源，其利用微生物減少表明土壤微生物整體多樣性下降。精氨酸、天冬酰胺酸、苯丙氨酸等氨基酸可以促進(jìn)尖孢鐮刀菌等病原菌孢子萌發(fā)和菌絲生長，使得根際微環(huán)境有利于病原菌生長，引發(fā)植株病害[39]。羧酸類利用微生物減少會造成植物根際有機(jī)酸分解減緩，加速根際酸化，如本研究中8～18 a和18～28 a階段土壤pH分別下降0.22和0.36個單位；當(dāng)根際酸化程度過大則會抑制根系生長，影響作物水分和養(yǎng)分吸收，引起作物長勢變差。因此，當(dāng)參與眾多土壤生物化學(xué)過程的微生物種群大幅減少時，其維持土壤物質(zhì)循環(huán)與能量流動的能力也相應(yīng)下降，土壤微生態(tài)環(huán)境逐步惡化，從而表現(xiàn)出較嚴(yán)重的連作障礙問題。

3.5 小結(jié)與展望

本研究采用BIOLOG微平板法研究了不同種植年限胡椒園土壤微生物功能多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果表明，隨種植年限增加，胡椒園土壤微生物功能多樣性降低，群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，同時土壤pH值明顯下降，養(yǎng)分逐漸失衡，這些因素共同作用是導(dǎo)致胡椒連作障礙形成的主要原因。但由于BIOLOG法培養(yǎng)的微生物只占自然完整微生物中的10%[7]，不能完全反映連作障礙形成過程中所有微生物群落變化等信息[40]。因此，今后需采用更先進(jìn)的研究方法，如454、Illumina等高通量測序技術(shù)來開展相關(guān)研究[10]，為揭示胡椒連作障礙形成中微生物參與機(jī)制提供更加直接、明確的證據(jù)。

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