光甘草定對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響

趙偉 宋歌

摘要：本試驗(yàn)對(duì)金葡菌進(jìn)行培養(yǎng)并加入藥物觀察來測(cè)定影響因子。分光光度計(jì)的測(cè)定數(shù)據(jù)表明，不同濃度的光甘草定對(duì)金黃色葡萄球菌均有一定的抑制作用。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌；生物被膜；光甘草定；分光光度計(jì)

中圖分類號(hào)：S859.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：2096-3637（2017）07-0006-03

和很多的致病菌一樣，金黃色葡萄球菌也可以在其表面形成一層生物被膜，金黃色葡萄球菌的生物被膜形成以后，其形態(tài)特征，以及生理變化都會(huì)發(fā)生很復(fù)雜的變化，生物被膜由很多大分子物質(zhì)組成，它能使包裹在內(nèi)部的細(xì)菌免受外界不良環(huán)境的干擾和破壞，從而對(duì)細(xì)菌起到保護(hù)作用[1]。所以，要想防治或者治療金黃色葡萄球菌的感染，就要先從生物被膜入手。

1金葡菌生物膜系統(tǒng)簡(jiǎn)介

金黃色葡萄球菌之所以難以防治，難以治療，是因?yàn)樵诟腥窘瘘S色葡萄球菌以后，病菌會(huì)形成一個(gè)復(fù)雜細(xì)菌生物被膜。細(xì)菌生物被膜是一層包裹在細(xì)菌外面的極其復(fù)雜和嚴(yán)密的膜[2]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在生物膜的形成起始階段，細(xì)菌與細(xì)菌的粘附是生物膜形成的關(guān)鍵，這個(gè)階段很大程度上受到胞外DNA（eDNA）作用和影響。在聚集階段發(fā)揮作用的是多糖PIA[3]。PIA不僅能夠誘導(dǎo)細(xì)菌之間相互依附粘連，還能促進(jìn)細(xì)菌的分化增值，有此形成多層的細(xì)胞團(tuán)塊，進(jìn)而形成生物被膜[4]。

基因ica操縱子是細(xì)胞間多糖粘附素合成的基礎(chǔ)。它有五個(gè)基因串聯(lián)組成，分別是icaA，icaD，icaB，icaC，icaR。其中發(fā)揮最重要作用的是icaA[5]。胞外DNA能夠促進(jìn)生物被膜的形成，細(xì)胞質(zhì)水解酶可以通過裂解細(xì)菌將胞外DNA釋放到細(xì)菌外界加強(qiáng)生物被膜的形成。并且細(xì)胞質(zhì)水解酶受cidA的調(diào)控，所以cidA間接的對(duì)生物被膜的形成發(fā)揮重要的作用。然而如果cidA基因缺失，就會(huì)降低細(xì)菌的裂解，進(jìn)而減少胞外DNA的釋放，間接的對(duì)生物被膜的形成起到抑制作用。由此可見，胞外DNA是否能夠釋放，很大程度上取決于cidA的調(diào)節(jié)。從另一方面來說，基因cid操縱子和ica操縱子都受到agr和sar兩個(gè)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的影響[6]。由此，agr和sar是金葡菌研究中最重要的研究系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)表明，agr和sar系統(tǒng)可以通過影響cid的表達(dá)來控制細(xì)菌自溶，通過調(diào)控ica來影響生物膜的形成。

要想控制或抑制生物被膜，首先要做的是對(duì)生物被膜形成的研究和分析。近年對(duì)于生物被膜的研究，大多是通過改變不同環(huán)境或藥物對(duì)生物被膜的作用，然后對(duì)生物被膜進(jìn)行測(cè)定，通過得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)果分析討論，從而得出對(duì)生物被膜形成影響最大的因素，進(jìn)而探測(cè)生物被膜形成的機(jī)理。在金黃色葡萄球菌生物被膜研究的實(shí)驗(yàn)中，通過甲基葡萄糖的研究[7]說明生物被膜的主要組成是多糖PIA，而且PIA的合成，受細(xì)菌總糖量的影響。對(duì)于金黃的葡萄球菌的治療和防治，要從生物被膜開發(fā)，尋求的藥物也需要以對(duì)PIA和eDNA有影響為基本要素。在近年的實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中，甘草系列的研究發(fā)展迅速，并且可能滿足影響的條件，本實(shí)驗(yàn)旨在檢驗(yàn)光甘草定對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響[8]。

2研究的目的和意義

本實(shí)驗(yàn)將光甘草定等樣品溶于PBS溶液制成液體藥物，加入到具有相同狀態(tài)金黃色葡萄細(xì)菌的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，制備成不同終濃度（有空白對(duì)照）的液體進(jìn)行孵育作用，作用結(jié)束后用結(jié)晶紫染色，用分光光度計(jì)測(cè)出各孔的吸光度，從數(shù)據(jù)的不同反映出藥物對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的影響。進(jìn)一步探索光甘草定在治療藥物研發(fā)上的應(yīng)用，為人類身體健康和食品安全方面的發(fā)展做出貢獻(xiàn)。

3材料與方法

3.1材料

3.1.1材料來源

金黃色葡萄球菌和光甘草定樣品。

3.1.2試驗(yàn)所用器材及儀器

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、火柴、平皿若干、1.5mlEP管若干、10ul槍頭若干、200ul槍頭若干、1ml槍頭若干、1.5mlEP管架若干、細(xì)菌培養(yǎng)瓶若干、大小瓶塞若干、酒精燈、電磁爐、剪刀、鑷子、接種環(huán)、錐形瓶若干、量筒、250ml試劑瓶若干、100ml試劑瓶若干、數(shù)碼鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9070MBE上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、醫(yī)用凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備公司）、CO2培養(yǎng)箱（青島龍杰儀器公司）、數(shù)碼電熱恒溫培養(yǎng)箱（HPX-9082ME上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、恒溫?fù)u床、高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、微量移液器一套（規(guī)格：0.5～10?l、20～200?l、100～1000?l，購(gòu)自大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司）、電子天平（購(gòu)于北京賽多利斯天平有限公司）、離心機(jī)、酶標(biāo)儀、離心管、一次性手套，-20℃冰箱、4℃冰箱、醫(yī)用膠帶、脫脂棉、封口薄膜等。

3.1.3試驗(yàn)所用試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）（購(gòu)自美國(guó)BD公司）、瓊脂粉（北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠）、革蘭氏染色劑（草酸銨結(jié)晶紫，碘液，95%酒精，石碳酸復(fù)紅）、香柏油、二甲苯、蒸餾水、自來水、75%醫(yī)用酒精、新潔爾滅消毒液、無水乙醇、PBS液（河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備）、苯酚、結(jié)晶紫溶液、氯仿、TEN緩沖液、異戊醇LB、EDTA、醋酸鈉、液體培養(yǎng)基（河南科技大學(xué)制備）等。

3.2主要試劑的配制液

3.2.1 10mg/ml光甘草定溶液：PBS液3ml，加0.03g光甘草定震蕩溶解。

3.2.2 LB培養(yǎng)液：LB液100ml，蛋白胨1g，酵母0.5g，Nacl1g。

3.2.3結(jié)晶紫溶液：結(jié)晶紫0.04g，蒸餾水10ml震蕩溶解。

3.2.4 EDTA。

3.2.5 TEN緩沖液。

3.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

3.3.1檢測(cè)eDNA的方法

按上述方法培養(yǎng)生物膜，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD600下細(xì)菌濃度，按Rice等人（2007）的方法提取并檢測(cè)eDNA。加入0.5MEDTA預(yù)冷1h；用700μl50mMTEN緩沖液（Tris-HCl，10mMEDTA，500mMNaCl）重懸生物膜，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，4℃，18000rpm離心5min；將上清轉(zhuǎn)入新的離心管，加入300μlTE緩沖液，加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）；4℃，12000rpm離心10min，取上清，用氯仿∶異戊醇（24∶1）再次萃取；取水相，加入3倍體積的冷乙醇和1/10體積的醋酸鈉，混勻后-20℃過夜；4℃，18000rpm離心20min，去上清，用70%冷乙醇洗滌，空氣中風(fēng)干后，加入20μlTE緩沖液溶解；用NanoDrop2000分光光度計(jì)檢測(cè)A260/A280的吸光度比，eDNA的相對(duì)表達(dá)量用單位生物膜內(nèi)eDNA的含量表示。

3.3.2甘草測(cè)定的方法

①用PBS將光甘草定配制成濃度為10mg/ml。

②將金黃色葡萄球菌接種與LB培養(yǎng)基37℃震蕩過夜第二天取培養(yǎng)液用LB培養(yǎng)液稀釋10稀釋后，取200μL稀釋后的菌液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，放于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。

③往96孔細(xì)胞培養(yǎng)板加入光甘草定終濃度為10μL/ml，20μL/ml，50μL/ml，100μL/ml，200μL/ml同時(shí)做空白對(duì)照孔，每孔重復(fù)2次，分別作用，2h，4h，6h和8h后用PBS洗去浮游菌，洗3次，加入0.04%結(jié)晶紫染色30min，用自來水洗去浮色，待膜干后，每孔用200μL乙醇溶解，于570～590nm波長(zhǎng)下檢測(cè)。

3.3.3病菌接種

把超凈工作臺(tái)的紫外燈打開放入試管，菌（液體）、LB液體培養(yǎng)基，消毒滅菌20～30min、然后，點(diǎn)燃酒精燈，在酒精燈旁完成實(shí)驗(yàn)，消毒灼燒空試管口，消毒培養(yǎng)液瓶口、到入1/3左右，打開裝菌種的離心管、用接種環(huán)灼燒消毒，沾菌、加入試管、灼燒用過的接菌環(huán)、試管蓋上紙蓋子封口，用報(bào)紙包好，放入THZ-92C氣浴恒溫震蕩器過夜（37℃12h），整理超凈工作臺(tái)。

3.3.4細(xì)菌的稀釋

將復(fù)蘇好的細(xì)菌從恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱內(nèi)取出，觀察小試管內(nèi)的細(xì)菌的情況，細(xì)菌的形態(tài)，色澤，透明度等，在凈化操作臺(tái)中，取錐形瓶加入3ml菌液。再加入27mlLB培養(yǎng)液，用200μL移液器加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)48h。

3.3.5封口保藏

將加入了200μL稀釋菌液的96孔板，用保鮮膜纏繞，確保96孔板上下兩個(gè)半殼之間的空隙被密封，在底部放置濕潤(rùn)的毛巾，置于特定的容器內(nèi)，放在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)48h。

4結(jié)果及分析

4.1 eDNA測(cè)定的結(jié)果

將作用2h的實(shí)驗(yàn)板經(jīng)過實(shí)驗(yàn)處理，然后測(cè)定其數(shù)據(jù)取平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并做出最溶度增大的數(shù)據(jù)柱狀圖，作圖如下：

4.2甘草作用的結(jié)果

將生物膜用結(jié)晶紫試劑染色以后，對(duì)樣本進(jìn)行處理完成，放入分光光度計(jì)中進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定后，求相同時(shí)間同一濃度數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，作出柱狀圖如下：

4.3分析

4.3.1 eDNA的測(cè)定

eDNA的相對(duì)表達(dá)量就是對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜形成多少的直接反映。所以從圖（1）的變化可以看出，數(shù)據(jù)逐漸減小，說明同一作用時(shí)間，隨著作用濃度的增大，光甘草定對(duì)金葡菌的抑制作用也在增強(qiáng)。

4.3.2光甘草定圖（2）

光甘草定實(shí)驗(yàn)板的測(cè)定數(shù)據(jù)有明顯的浮動(dòng)和變化，說明隨著光甘草定的濃度的不同，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)明顯在減小，柱狀圖也在平穩(wěn)的下降，實(shí)驗(yàn)表明光甘草定對(duì)金黃色葡萄球菌的形成有明顯的抑制作用，并且隨著光甘草定的濃度的增大，金黃色葡萄球菌受抑制的作用就更加明顯。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制效果也在增強(qiáng)。光甘草定歲生物被膜的影響機(jī)理可能是光甘草定的抗菌抗癌作用。柱狀圖越來越低是因?yàn)殡S著濃度的增加細(xì)菌受到的影響作用也越來越大，生物被膜的形成越來越少。因此實(shí)驗(yàn)表明，光甘草定對(duì)金黃色葡萄球菌的形成有明顯的抑制作用。

5討論

甘草是一種有益的中草藥，味甘，性緩。用于很多疾病的防治和治療。而且分布廣泛。在我國(guó)分布在新疆寧夏等地區(qū)。甘草是天然活性物質(zhì)，能夠增強(qiáng)人體免疫力，對(duì)炎癥，腫瘤等疾病具有不同程度的防治和治療效果。在修復(fù)自身免疫方面和抗病毒方面也有一定的效果。

經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，任何實(shí)驗(yàn)濃度的光甘草定均表現(xiàn)出的是對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的抑制作用。通過數(shù)據(jù)的平穩(wěn)降低和曲線的持續(xù)下降，表明光甘草定對(duì)生物被膜有持續(xù)的影響作用，并且還隨著濃度的增加，抑制作用還越來越強(qiáng)。進(jìn)過近年的實(shí)驗(yàn)研究成果觀察，抑制的機(jī)理可能是影響可細(xì)菌的生長(zhǎng)。有實(shí)驗(yàn)證明[9]，光甘草定對(duì)酪氨酸酶的活性有一定的影響作用。因此有可能是在細(xì)菌的新陳代謝階段，某一種或者某幾種酶活性受到干擾，導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)受阻，因此生物被膜的形成被影響。也有可能是的結(jié)構(gòu)到破壞。導(dǎo)致細(xì)菌無法完成特定的生理過程，因此無法完成正常的生物被膜的構(gòu)建。也有很多實(shí)驗(yàn)證明光甘草定具有一定程度的抗菌和抗癌作用。因此光甘草定可能還有其他的影響生物被膜形成的機(jī)理。

6結(jié)論

光甘草定，10～200μL/ml濃度梯度的光甘草定，隨著濃度的增加對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制作用增強(qiáng)。隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用增強(qiáng)。

參考文獻(xiàn)

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