基于轉(zhuǎn)錄組的芒果MYB家族基因的鑒定及分析

鄭斌　武紅霞　王松標(biāo)　馬小衛(wèi)　許文天　羅純　姚全勝

摘 要 MYB家族作為植物中較大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，參與調(diào)控植物的多種生理活動。本研究基于芒果果實(shí)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，鑒定出71個MYB家族蛋白，其中包含1個4R-MYB蛋白、3個R1R2R3-MYB蛋白、60個R2R3-MYB蛋白和7個MYB相關(guān)蛋白。進(jìn)化樹及基序分析表明：除個別蛋白外，相同類型的MYB蛋白均聚在一起，且相近分支的MYB蛋白具有相同或相似的基序。60個全長MYB家族蛋白中，大部分為不穩(wěn)定蛋白，且均為不含跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽的親水性蛋白，亞細(xì)胞定位分析均定位于細(xì)胞核。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)芒果R2R3-MYB蛋白與擬南芥有較高的保守性。R2R3-MYB蛋白保守域分析發(fā)現(xiàn)，R2和R3結(jié)構(gòu)域均有多個氨基酸保守不變。GO分析發(fā)現(xiàn)芒果R2R3-MYB蛋白共注釋到生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能3大類功能的15個亞類。

關(guān)鍵詞 芒果；MYB家族基因；R2R3-MYB；生物信息學(xué)

中圖分類號 S667.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract As one of the large transcription factor families， MYB family is involved in regulating a variety of physiological processes in plants. Based on the results of transcriptome sequencing of the fruits in mango， 71 sequences of MYB family proteins， including one 4R-MYB protein， three R1R2R3-MYB proteins， 60 R2R3-MYB proteins and 7 MYB related proteins， were identified in the study. The phylogenetic tree and motifs analyses showed that， with a few individual exceptions， MYB proteins of the same type clustered together， and the majority of the close members in the phylogenetic tree exhibited same or similar motifs compositions. 60 full-length MYB proteins were analyzed， in which most were unstable， and all of those proteins were hydrophilic proteins， without a signal-peptide and transmembrane region. Subcellular localization analysis indicated that those proteins were located in nucleus. In addition， the phylogenetic analyses of the mango（60 members）and Arabidopsis（126 members）R2R3-MYB proteins showed that those proteins were highly conserved between mango and Arabidopsis. Conserved domain（R2 and R3 repeats）of mango R2R3-MYB proteins contained multiple conserved amino residues. GO（Gene Ontology）annotation showed that those proteins could be categorized into 15 function subgroups of three main categories： biological processes， cellular components and molecular function.

Key words Mango（Mangifera indica L.）； MYB family genes； R2R3-MYB； bioinformatics

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.017

轉(zhuǎn)錄因子即反式作用因子，是一類調(diào)控蛋白，能夠與真核基因啟動子區(qū)域中的順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合，通過轉(zhuǎn)錄因子之間以及轉(zhuǎn)錄因子與其他相關(guān)蛋白之間的相互作用激活或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄[1]。MYB家族是植物中較大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。最早的MYB基因u-myb是1982年發(fā)現(xiàn)于鳥類的原癌病毒[2]，植物中發(fā)現(xiàn)的第一個MYB基因?yàn)閆mC1[3]。MYB轉(zhuǎn)錄因子在N端具有保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域[4]，該結(jié)構(gòu)域通常由1～4個氨基酸序列重復(fù)區(qū)（R）組成，每個R區(qū)大約由52個氨基酸組成，但是各個R區(qū)之間不是完全重復(fù)。根據(jù)相鄰的R區(qū)的個數(shù)（1，2，3或4）可以把MYB蛋白分成MYB相關(guān)蛋白（含1個或多個R區(qū)）、R2R3-MYB蛋白、R1R2R3-MYB蛋白和4R-MYB蛋白4種不同類型[5]。

MYB蛋白參與調(diào)控植物的多種生理活動，如細(xì)胞形態(tài)建成、生物和非生物脅迫應(yīng)答、植物次生代謝等[6-7]，但目前對植物MYB轉(zhuǎn)錄因子的了解非常有限，大量MYB轉(zhuǎn)錄因子還未被鑒定出來。近年來，高通量測序和生物信息學(xué)的快速發(fā)展為基因的鑒定及功能分析提供了新思路。利用生物信息學(xué)方法，吳家勝等[8]從粳稻基因組數(shù)據(jù)中鑒定出126個R2R3-MYB蛋白、6個R1R2R3-MYB蛋白以及60個MYB相關(guān)蛋白，宋楊等[9]從越橘果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定出21個R2R3-MYB基因。

芒果（Mangifera indica L.）作為五大熱帶水果之一，風(fēng)味獨(dú)特，營養(yǎng)豐富，被譽(yù)為“熱帶果王”，主要分布在海南、廣東、廣西、云南、四川、福建等?。▍^(qū)）[10]。目前關(guān)于芒果MYB基因的研究較少，武紅霞[11]利用轉(zhuǎn)錄組測序?qū)⑴c花色苷合成的MYB基因進(jìn)行了篩選分析，而關(guān)于MYB家族基因的系統(tǒng)鑒定與分析還未見報道。本研究基于芒果果實(shí)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，利用生物信息學(xué)手段對MYB家族基因進(jìn)行鑒定和分析，為進(jìn)一步探究芒果MYB家族基因的功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

芒果蛋白序列來源于本課題組構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（GenBank accession SRP035450）。擬南芥MYB家族氨基酸序列下載于擬南芥信息資源（TAIR）數(shù)據(jù)庫（http：//www.arabidopsis.org/）。

1.2 方法

1.2.1 芒果MYB家族蛋白的鑒定 從Pfam 30.0[12]數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/）下載MYB結(jié)構(gòu)域種子文件PF00249、PF8914、PF13921、PF12776、PF13873、PF13837和PF15963，用HMMER 3.1b2[13]軟件分別構(gòu)建Profile HMM（數(shù)值表格型隱馬可夫模型）并檢索芒果轉(zhuǎn)錄組蛋白數(shù)據(jù)庫，對檢索結(jié)果進(jìn)行整合去冗余，得到候選蛋白。將候選蛋白用SMART[14]（http：//smart.embl-heidelberg.de/）和InterPro[15]（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）分析SANT/MYB結(jié)構(gòu)域，同時用NCBI blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）和植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫[16]（PlantTFDB）（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）進(jìn)行進(jìn)一步分析鑒定。

1.2.2 芒果MYB家族蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建及基序分析 利用MEGA 6.0軟件內(nèi)置的Clustal W程序?qū)γ⒐鸐YB家族蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對分析，將比對結(jié)果采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行自舉評估（Bootstrap），重復(fù)次數(shù)為1 000次，其它參數(shù)使用默認(rèn)值[17]。運(yùn)用MEME 4.11.02程序[18]分析芒果MYB家族蛋白的基序，設(shè)定基序?qū)挾葹?～50，基序數(shù)量為10，其余參數(shù)為默認(rèn)值。

1.2.3 芒果MYB家族蛋白生物信息學(xué)分析 選擇具有全長氨基酸序列的芒果MYB家族蛋白，利用在線工具ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）對其進(jìn)行理化性質(zhì)分析，并用SOPMA[19]（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在線軟件分析其二級結(jié)構(gòu)，信號肽的預(yù)測應(yīng)用SignalP 4.1 Server[20]（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）軟件進(jìn)行分析，最后分別采用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和BaCelLo[21]（http：//gpcr.biocomp.unibo.it/bacello/）在線軟件完成跨膜結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位分析。

1.2.4 芒果和擬南芥R2R3-MYB進(jìn)化樹構(gòu)建 使用MEGA 6.0軟件將芒果R2R3-MYB蛋白（60個）和擬南芥R2R3-MYB蛋白（126個）共同構(gòu)建進(jìn)化樹，參數(shù)設(shè)置同1.2.2。

1.2.5 芒果R2R3-MYB蛋白保守域分析 使用DNAMAN軟件（Version5.2.2）對芒果R2R3-MYB蛋白保守域進(jìn)行比對，將比對結(jié)果用在線軟件WebLogo 3（http：//weblogo.threeplusone.com/create.cgi）分析保守域序列標(biāo)簽。

1.2.6 芒果R2R3-MYB蛋白GO分析 首先使用Blast2GO 4.0軟件[22]對芒果R2R3-MYB蛋白序列進(jìn)行GO（Gene Ontology）注釋，然后用在線軟件WEGO[23]（http：//wego.genomics.org.cn/cgi-bin/wego/index.pl）繪制GO功能分類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 芒果MYB家族成員的獲得

本研究從芒果轉(zhuǎn)錄組49117個蛋白序列中篩選出395個具有SANT/MYB結(jié)構(gòu)域的候選蛋白序列，通過進(jìn)一步分析去冗余，共獲得71個芒果MYB家族蛋白序列（表1），其中60個為全長序列。71個MYB家族蛋白中包含1個4R-MYB蛋白、3個R1R2R3-MYB蛋白、60個R2R3-MYB蛋白和7個MYB相關(guān)蛋白，其中不具有全長蛋白序列的Unigene9486、Unigene6062和Unigene8022雖僅含一個SANT/MYB結(jié)構(gòu)域，但同源分析發(fā)現(xiàn)其均為R2R3-MYB蛋白序列。

2.2 芒果MYB家族蛋白進(jìn)化樹及基序分析

芒果MYB家族蛋白結(jié)構(gòu)域、進(jìn)化樹及基序分析見圖1。由圖1可知，60個R2R3-MYB蛋白除CL6663.Contig1外均聚在一起，3個R1R2R3-MYB蛋白聚在一個分支，7個MYB相關(guān)蛋白除CL11270.Contig2外均聚在一起。

本研究分析了芒果MYB家族的10個基序（圖2），基序1為R2R3結(jié)構(gòu)域基序，基序2、基序4和基序10為R2結(jié)構(gòu)域基序。由表1可知，基序2存在于所有具有全長的MYB家族蛋白，基序1存在于所有具有全長的R2R3-MYB蛋白。結(jié)合進(jìn)化樹（圖1）可以看出，相近分支MYB蛋白基序的類型和位置相同或相近。

2.3 芒果MYB家族蛋白特性分析

芒果MYB家族蛋白理化性質(zhì)及二級結(jié)構(gòu)分析見表2。由表2可以看出，60個全長MYB家族蛋白的相對分子量在21.24～115.88 ku之間，其中含33個酸性蛋白（理論等電點(diǎn)<7）、1個中性蛋白（理論等電點(diǎn)=7）和26個堿性蛋白（理論等電點(diǎn)>7）；平均疏水指數(shù)均小于0，為親水性蛋白；不穩(wěn)定指數(shù)（II）分析發(fā)現(xiàn)除Unigene1513為穩(wěn)定蛋白外（II<40），其余均為不穩(wěn)定蛋白（II>40）。60個MYB家族蛋白均不含信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)，亞細(xì)胞定位均定位于細(xì)胞核。二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)：芒果MYB家族蛋白中無規(guī)卷曲和α-螺旋所占比例較大，其中48個為無規(guī)卷曲所占比例最大，11個為α-螺旋所占比例最大，CL9291.Contig2二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋和無規(guī)卷曲所占比例一致。

2.4 芒果與擬南芥R2R3-MYB蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹比對

芒果與擬南芥R2R3-MYB蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖3。由圖3可以看出，大部分芒果R2R3-MYB蛋白與擬南芥不同亞組的R2R3-MYB蛋白聚在一起，說明芒果R2R3-MYB蛋白與擬南芥有較高的保守性。擬南芥相同亞組的R2R3-MYB蛋白具有相同或相似的功能[5]，推測聚在不同亞組的芒果R2R3-MYB蛋白與擬南芥該亞組具有相同或相似的功能，其中與擬南芥S4亞組處于同一分支的CL10982.Contig2、Unigene13684和CL6446.Contig2可能參與調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)從而抑制花色苷的合成，與擬南芥S5亞組及AtMYB5處于同一大分支的Unigene13160、CL2107.Contig1、Unigene1513、Unigene12158和CL6888.Contig2以及與S6亞組處于同一分支的CL5638.Contig1和CL5638.Contig2可能具有促進(jìn)花色苷合成的作用。

2.5 芒果R2R3-MYB蛋白保守域分析

芒果R2R3-MYB蛋白R2R3高度保守DNA binding結(jié)合域見圖4。由圖4可以看出，芒果R2R3-MYB蛋白R2結(jié)構(gòu)域的4（W）、8～9（E、D）、12（L）、20（G）、25（W）、38（R）和41～47（K、S、C、R、L、R、W）等多個位點(diǎn)保守不變，R3結(jié)構(gòu)域的10（E）、14（I）、18（H）、22～23（G、N）、25（W）、28（I）、33～38（P、G、R、T、D、N）、41～42（K、N）和44（W）等位點(diǎn)保守不變。

2.6 芒果R2R3-MYB蛋白GO聚類分析

芒果R2R3-MYB蛋白GO功能分類見圖5。由圖5可以看出，60個R2R3-MYB蛋白注釋到生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能3大類功能的15個亞類。細(xì)胞組分類別中，有4、3和3個R2R3-MYB蛋白分別注釋到細(xì)胞（Cell）、細(xì)胞部分（Cell part）和細(xì)胞器（Organelle）。分子功能類別中，58個R2R3-MYB蛋白注釋到結(jié)合功能（binding），1個注釋到催化活性（Catalytic activity）。生物學(xué)過程類別中，6個R2R3-MYB蛋白注釋到細(xì)胞過程（cellular process），注釋到代謝過程（metabolic process）、發(fā)育過程（developmental process）和刺激響應(yīng)（response to stimulus）的分別為4個、4個和2個，注釋到其他亞類的僅為1個。

3 討論

MYB蛋白參與植物激素合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、初生代謝、次生代謝和類黃酮合成等生理生化過程[24]。Cao等[25]、Aoyagi等[26]和Liao等[27]分別利用生物信息學(xué)分析技術(shù)從蘋果、大豆和木薯基因組數(shù)據(jù)中鑒定出222、264和166個R2R3-MYB基因，并對其中部分基因進(jìn)行了功能分析。對于沒有基因組信息的物種可以利用表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs）和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行家族基因的挖掘，Chen等[28]從歐洲油菜表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs）中獲得72個R2R3-MYB基因，Wang等[29]從地黃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定出165個MYB序列，其中40個序列具有完整的開放閱讀框。

本研究基于芒果果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定出71個MYB家族蛋白，其中包含1個4R-MYB蛋白、3個R1R2R3-MYB蛋白、60個R2R3-MYB蛋白和7個MYB相關(guān)蛋白。進(jìn)化樹及基序分析發(fā)現(xiàn)，除個別基因外，不同類型的MYB蛋白分別聚在一起，且相近分支的MYB蛋白具有相同或相似的基序，這與魏海超[30]對大豆和擬南芥MYB家族基因的分析結(jié)果是一致的。

對具有全長的60個芒果MYB家族蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，其中酸性蛋白所占比例較大，大部分為不穩(wěn)定蛋白，且均為不含跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽的親水性蛋白，亞細(xì)胞定位均定位于細(xì)胞核，大部分MYB家族蛋白二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)卷曲所占比例最大。

從芒果和擬南芥R2R3-MYB蛋白共同構(gòu)建的進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，芒果R2R3-MYB蛋白與擬南芥有較高的保守性；芒果R2R3-MYB蛋白保守域分析發(fā)現(xiàn)，其R2和R3結(jié)構(gòu)域均有多個氨基酸保守不變，該結(jié)果與Chen等[28]對歐洲油菜R2R3-MYB蛋白的分析結(jié)果相似。GO分析發(fā)現(xiàn)芒果R2R3-MYB蛋白共注釋到生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能3大類功能的15個亞類，其中96.67%注釋到結(jié)合功能。

MYB蛋白參與植物的多個生命活動，本研究從芒果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定出71個MYB家族蛋白，為今后芒果MYB家族蛋白的研究提供了基礎(chǔ)。由于取樣及測序的局限性，所鑒定的僅為芒果MYB家族的部分蛋白序列，因此，芒果MYB家族蛋白還有待進(jìn)一步挖掘和研究。

從進(jìn)化樹分析可以看出，大部分的芒果R2R3-MYB蛋白與擬南芥不同亞組的R2R3-MYB蛋白聚在一起，推測芒果R2R3-MYB蛋白與擬南芥具有相似的功能，該分析可為下一步芒果R2R3-MYB蛋白的功能分析提供參考。宋楊等[9]利用此方法結(jié)合基因表達(dá)分析鑒定出6個可能與越橘著色相關(guān)的基因，而芒果R2R3-MYB蛋白的功能還有待進(jìn)一步研究明確。

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