防治木薯細(xì)菌性枯萎病的生防菌株篩選和防效測(cè)定

鄭麗 張海鵬 陳陽 劉孟浩 宋艷培 江紹鋒 林江 高賽超 何時(shí)雨 覃新導(dǎo)

摘 要 從木薯8個(gè)不同生境分離到298株細(xì)菌，測(cè)定其產(chǎn)酶、次生代謝物和頡頏活性，結(jié)果表明，產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶、葡聚糖酶和生長(zhǎng)素的菌株和比例分別為160（53.69%）、57（19.13%）、11（3.69%）和150（50.34%），產(chǎn)嗜鐵素菌株最多203個(gè)，比例達(dá)68.12%；產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株最少7株，比例僅為2.35%；其中，9株菌株對(duì)木薯細(xì)菌性枯萎病菌具有頡頏活性，比例為3.02%。通過賦值選擇88個(gè)得分較高的菌株，對(duì)其16S rRNA測(cè)序及ARDRA-PCR和BOX-PCR聚類分析，發(fā)現(xiàn)可分成21個(gè)簇，且每個(gè)簇的種群豐度較高。優(yōu)選11個(gè)菌株進(jìn)行日光溫室大棚盆栽防效測(cè)定，其中，HWY-3-1防效為100%，防效在60%以上的菌株有DBS-5（85.96%）、HS-4-3（82.88%）、DHWP-1（79.37%）、HWYT-3-2（77.88%）、HWS-4-3（77.84%）、DHNS-3-5（65.34%）、DHWR-5-1（61.83%），和對(duì)照防效相比，差異顯著；進(jìn)一步選擇5個(gè)防效較好的潛力菌株測(cè)定其田間防效，結(jié)果顯示，HWY-3-1（Bacillus pumilus）平均防效為38.11%，與對(duì)照的防效存在顯著差異。試驗(yàn)篩選策略可行，初步找到1株對(duì)CBB防效較穩(wěn)定的生防菌株Bacillus pumilus。

關(guān)鍵詞 木薯細(xì)菌性枯萎??；分離和篩選；頡頏；聚類分析；生防效果

中圖分類號(hào) S436.421.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Selection and Identification of Biocontrol Agents Against

Cassava Blight Bacteria

ZHENG Li1，2， ZHANG Haipeng2， CHEN Yang4，LIU Menghao3， SONG Yanpei3，

JIANG Shaofeng2， LIN Jiang4， GAO Saichao4， HE Shiyu1， QIN Xindao1 *

1 Guangzhou Experimental， Station Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Guangzhou， Guangdong 510140， China

2 College of Agriculture， South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510642， China

3 College of Materials and Energy， South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510642， China

4 Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract 298 bacterial isolates were recovered from eight different microenvironments of field-grown cassava plants. of that， 160（53.69%）expressed protease， 57（19.13%）produced cellulase， 7（2.35%）expressed chitinase， and 203（68.12%）secreted siderophores； 11（3.69%）produced glucanase， 150（50.34%）expressed IAA， and only 9（3.02%）representative isolates were for in vitro antagonism. ARDRA and identification of antagonistic bacteria identified 21 distinct groups（G1-21）with the similarity coefficient of 50% among the 298 isolates， BOX-PCR fingerprint analysis revealed that isolates in different ARDRA groups had dissimilar genotypes. Eleven representative isolates were evaluated for their efficacy against cassava blight bacterial mildew caused by Xanthomonas axonopodis pv. Manihotis in the greenhouse， the isolates showed biocontrol efficacy ranging from 44.14% to 100%. Eight of them（HWY-3-1（100%）， DBS-5（85.96%）， HS-4-3（82.88%）， DHWP-1（79.37%）， HWYT-3-2（77.88%）， HWS-4-3（77.84%）， DHNS-3-5（65.34%）， DHWR-5-1（61.83%）attained the efficacy over 60%. HWYT-3-2 and HNR-3-7 significantly suppressed the disease at 30 dpt， and HWYT-3-2 provided significant disease protection from 30-40 dpt， the average bio control efficiency was 38.11%. The strategy of the study was feasible， and found one strains HWYT-3-2 Bacillus pumilus of BCAs against CBB control.

Key words Cassava bacterial blight； selection and identification； antagonism activity； cluster analyse； bicontrol efficiency

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.08.023

木薯（Manihot esculenta Crantz）為大戟科木薯屬灌木狀多年生作物，是我國(guó)熱區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物，其塊根被廣泛應(yīng)用于食品加工、變性淀粉和生物能源等產(chǎn)業(yè)之中。近年來，我國(guó)木薯栽培面積一直保持在40萬hm2以上，年產(chǎn)鮮薯900萬t左右[1]。

由地毯草黃單胞木薯萎蔫致病變種（Xanthomonas axonopodis pv. manihotis，簡(jiǎn)稱Xam）引起的木薯細(xì)菌性枯萎?。–assava bacterial blight，簡(jiǎn)稱CBB）是一種毀滅性病害[2]，廣泛發(fā)生于亞洲、非洲和美洲的木薯產(chǎn)區(qū)。在非洲和南美洲，病害發(fā)生后所造成的木薯產(chǎn)量損失為12%～90%，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致毀種絕收[3]。在我國(guó)，該病最先在臺(tái)灣地區(qū)發(fā)生流行，造成產(chǎn)量損失達(dá)30%，淀粉出粉率減少40%左右。2007～2009年，中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院對(duì)我國(guó)木薯主產(chǎn)區(qū)病害普查結(jié)果表明，該病在我國(guó)海南、云南和廣西、廣東等省份普遍發(fā)生，是當(dāng)前木薯生產(chǎn)中的主要病害，嚴(yán)重影響相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4]。

目前，學(xué)者就木薯細(xì)菌性枯萎病抗病植株篩選和化學(xué)防控已開展了廣泛的研究[5-8]，但防治效果的持續(xù)性和穩(wěn)定性問題依然突出。生物防治因其綠色、健康以及與原生態(tài)的相容性已成為CBB防治研究的熱點(diǎn)。而關(guān)于如何能獲得防效穩(wěn)定的生防菌株，則顯得至關(guān)重要。本研究重點(diǎn)在從木薯不同生境分離到頡頏細(xì)菌，采取相關(guān)策略進(jìn)行賦值評(píng)估，初步尋找到有效生防菌株，開展溫室、大田防效測(cè)定，獲得優(yōu)質(zhì)生防菌株，為后續(xù)研究其生防機(jī)理等內(nèi)容奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

取樣地點(diǎn)：樣本于2014年8月份采集于廣東省湛江遂溪某木薯園。

病原菌來源：本研究室保存的病原菌，于2013年采集于廣東湛江遂溪某木薯地，分離于木薯發(fā)病葉片和莖稈，純化、保存，通過比對(duì)菌落形態(tài)、16s RNA測(cè)序分析，鑒定為地毯草黃單胞木薯萎蔫致病變種（Xanthomonas axonopodis pv. manihotis，簡(jiǎn)稱Xam）。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集和菌株分離 樣本采集：CBB發(fā)病地塊和非發(fā)病地塊。每塊地分成4個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)至少有250 m2，每個(gè)小區(qū)的樣本由5個(gè)重復(fù)混合而成。土壤取樣時(shí)，深度為0～15 cm，面積約1 m2。采用五點(diǎn)采樣法，每點(diǎn)間隔至少10 m。每點(diǎn)3株健康植株連同根圍土一并收集。采集后的樣品迅速裝入寫好編號(hào)的塑料袋中帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離。參考Morris等[9]的方法取樣：A. 無病害地塊的健康植株；B. 無病害地塊的健康植株根圍土；C. 無病害地塊的根際土；D. 病害地塊的健康植株；E. 病害地塊的病株（病株上的健康部位葉片）；F. 病害地塊健康植株的根圍土；G. 病害地塊染病植株的根圍土；H. 病害地塊的根際土。以及另一地塊（吳川唐綴，新地，第一年種植木薯）的健康葉片及其莖稈的中空部分。

外生細(xì)菌分離[10]：取3 g樣品，放入滅菌的三角瓶中，加27 mL無菌的0.85% NaCl和滅菌玻璃珠，于搖床上150 r/min振蕩30 min后，靜置5 min，得到10-1稀釋液，依次制備成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋液。分別取10-4、10-5、10-6三個(gè)梯度的稀釋液100 μL涂在R2A培養(yǎng)基（R2A培養(yǎng)基（1 L）：酵母粉0.5 g，酪蛋白胨0.25 g，肉蛋白胨0.25 g，水解酪蛋白0.5 g，葡萄糖0.5 g，淀粉0.5 g，丙酮酸鈉0.3 g，磷酸氫二鉀0.3 g，水合硫酸鎂0.024 g，瓊脂15 g，pH=7.2）上，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)，30 ℃培養(yǎng)48 h。

內(nèi)生細(xì)菌分離[10]：分別取樣品若干，用1%的次氯酸鈉浸泡5 min，70%酒精浸泡1～2 min，無菌水清洗3次（取最后1次清洗的溶液100 μL涂于R2A平板上，若48 h后無菌生長(zhǎng)則認(rèn)為表面消毒干凈，無菌）。其他同外生菌的分離方法。

選菌落數(shù)在30～300個(gè)的平板，計(jì)數(shù)，挑取平板上不同大小、形態(tài)的菌落分離、純化，40%甘油保存于-70 ℃超低溫冰箱中，備用。

1.2.2 產(chǎn)酶和代謝產(chǎn)物活性測(cè)定

（1）蛋白酶活性測(cè)定。參照Yang等[10]的方法，挑取處于生長(zhǎng)旺盛期的菌株接種于蛋白培養(yǎng)基平板上（A：脫脂奶粉6.4 g，溶于240 mL水中，121 ℃滅菌1 min；B：瓊脂6.4 g，定容至240 mL，121 ℃滅菌20 min，A與B分別滅菌后混合），30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察透明圈且測(cè)量?jī)?nèi)徑和外徑，4個(gè)技術(shù)重復(fù)，3次試驗(yàn)平行重復(fù)，下同。

（2）幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定。參照Roberts等[11]的方法，制備好膠體狀幾丁質(zhì)，將頡頏細(xì)菌接種在以膠體狀幾丁質(zhì)為唯一碳源的Chi-Ayers培養(yǎng)基平板（NH4H2PO4 1.0 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，膠體狀幾丁質(zhì)1%（w/V）定容至1 000 mL，pH=7.0，瓊脂20 g），30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察透明圈且測(cè)量?jī)?nèi)徑和外徑。

（3）β-1，3-葡聚糖酶活性的檢測(cè)。參照楊威[12]的方法，將頡頏細(xì)菌接種在葡聚糖平板上（β-1，3-葡聚糖0.1 g，TSB 0.4 g，瓊脂1.6 g，4 g/L的剛果紅1 mL，定容至100 mL），30 ℃培養(yǎng)48 h，觀察透明圈且測(cè)量?jī)?nèi)徑和外徑。

（4）纖維素酶活性的檢測(cè)。參照Ghose[13]的方法，把準(zhǔn)備好的菌株接到纖維素酶活性測(cè)定平板（蛋白胨10 g，酵母粉10 g，羧甲基纖維素鈉10 g，氯化鈉5 g，磷酸二氫鉀1 g，瓊脂18 g，定容至1 000 mL，pH=7.0），30 ℃培養(yǎng)48 h后，用1 g/L的剛果紅染1 h后，倒掉染液后，用1 mol/L的NaCl浸泡1 h。觀察透明圈的有無且測(cè)量其內(nèi)徑和外徑。

（5）產(chǎn)嗜鐵素活性的檢測(cè)。參照Shin等[14]的方法，將A，B液混合倒平板，并將準(zhǔn)備好的菌株接于該平板上[A：1，60.5 mg CAS（鉻天青S）溶于50 mL去離子水；2，10 mL三價(jià)鐵溶液（1 mmol/L FeCl3·6H2O，10 mmol/L鹽酸為溶劑）；3，72.9 mg HDTMA溶于40 mL去離子水。上述3個(gè)溶液混合定容至100 mL，pH調(diào)至中性，121 ℃滅菌20 min。B：30.24 g Pipes加入900 mL Waker agar培養(yǎng)基，12 g 50%（w/V）的NaOH溶液將培養(yǎng)基pH調(diào)至6.8，121 ℃滅菌20 min]，30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察透明圈且測(cè)量?jī)?nèi)徑和外徑。

（6）產(chǎn)吲哚乙酸測(cè)定。參照Sawar等[15]的方法，取二甲氨基苯甲醛8 g溶于760 mL 95%酒精和160 mL濃鹽酸中，制得埃利希氏試劑。以1%胰蛋白胨水（pH=7.2～7.6）為培養(yǎng)液，2 d后將培養(yǎng)好的菌液加入3～5 mL埃利希氏試劑，觀察液面是否變紅。

1.2.3 平板頡頏活性測(cè)定 參照楊威[12]的方法，將病原菌接種到LB培養(yǎng)液中，28 ℃、200 r/min、22 h震蕩培養(yǎng)，制成種子液，以5%的接種量接種到LB液中，28 ℃，200 r/min，24 h培養(yǎng)成發(fā)酵液。隨后將病原菌發(fā)酵液以5%的比例接種到LB固體培養(yǎng)基中（待LB固體培養(yǎng)基冷卻至37～45 ℃加入此比例的病原菌菌液），制成含病原菌的平板，每皿加入15 mL。

隨后將預(yù)先培養(yǎng)好的細(xì)菌培養(yǎng)液分別吸取8 μL于滅菌濾紙片（直徑為5 mm）上，以LB培養(yǎng)液和滅菌水為空白對(duì)照。28 ℃培養(yǎng)48～72 h，觀察并測(cè)量抑菌圈大小。每個(gè)處理4個(gè)技術(shù)重復(fù)，3個(gè)試驗(yàn)重復(fù)。

1.2.4 賦值評(píng)估 本賦值系統(tǒng)包括如下指標(biāo)：平板頡頏活性、蛋白酶活性、幾丁質(zhì)酶活性、纖維素酶活性、葡聚糖酶活性以及產(chǎn)嗜鐵素、吲哚乙酸活性。其中賦值方法如下[16]：平板頡頏活性根據(jù)頡頏圈（頡頏圈外徑與內(nèi)徑之差）的大小分為四級(jí)：0，無頡頏活性；1，頡頏圈在1～3 mm之間（含3 mm）；2，頡頏圈在3～6 mm之間（含6 mm）；3，頡頏圈大于6 mm。賦予的值分別為0、1、2、3。水解酶和產(chǎn)生嗜鐵素賦值方法：0，無水解圈；1，水解圈在1～3 mm之間（含3 mm）；2，水解圈在3～6 mm之間（含6 mm）；3，水解圈大于6 mm，依次賦值對(duì)應(yīng)為0、1、2、3。吲哚乙酸活性根據(jù)液面顏色變化賦值如下：0，不變色；1，淺紅色；2，紅色；3，深紅色。

1.2.5 指紋圖譜和16S rRNA測(cè)序和聚類分析

利用細(xì)菌基因組試劑盒（Shanghai SBS Genetech Co. Ltd）提取細(xì)菌基因DNA后，參考楊明明等[17]的方法，分別進(jìn)行擴(kuò)增核糖體DNA限制性酶切分析（amplified ribosomal DNA restriction analysis， ARDRA）和BOX-PCR擴(kuò)增。利用軟件對(duì)所得圖譜進(jìn)行聚類分析。

試劑盒（賽百盛公司）提取細(xì)菌基因組后，參考Yang等[10]的方法從基因組中擴(kuò)增出16S rRNA基因片段的PCR擴(kuò)增。所得產(chǎn)物在華大基因測(cè)序分析，并將相關(guān)序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)。

1.2.6 防效測(cè)定 （1）溫室試驗(yàn)測(cè)定。試驗(yàn)品種為“南植199”。本試驗(yàn)設(shè)置12個(gè)處理：A. 108 CFU/mL菌劑（11個(gè)）發(fā)酵液10倍稀釋液；B. 對(duì)照：同等稀釋倍數(shù)的LB溶液。每處理設(shè)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3棵苗。菌劑和對(duì)照處理組每株苗噴施30 mL，對(duì)照組用等量LB和滅菌水以相同方法噴霧；以上各處理組在噴霧時(shí)均加入終濃度為0.01%的表面活性劑Tween-20。噴施5 d后以剪葉的方式接種濃度為107 CFU/mL的病原菌[18]。接種病原菌21、23、25、28 d分別，調(diào)查病害嚴(yán)重度并計(jì)算生防效果。

病害調(diào)查方法：0級(jí)為葉片無病斑；1級(jí)為病斑占葉面積1/10以下；3級(jí)為病斑占葉面積 1/10～1/4；5級(jí)為病斑占葉面積1/4～1/2；7級(jí)為病斑占葉面積1/2～3/4；9 級(jí)為病斑占葉面積 3/4以上。

病情指數(shù)和生防效果統(tǒng)計(jì)計(jì)算方法：病情指數(shù)=[∑（病級(jí)數(shù)×該病級(jí)植株數(shù)）/（最高病級(jí)×總植株數(shù)）]×100；生防效果=[（對(duì)照病情指數(shù)-處理組病情指數(shù)）/對(duì)照病害嚴(yán)重度]×100。

（2）田間防效試驗(yàn)測(cè)定。試驗(yàn)品種為“南植199”。本試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)處理：A. 108 CFU/mL菌劑（5個(gè)）發(fā)酵液稀釋10倍；B. 對(duì)照：同等稀釋倍數(shù)的LB溶液。每處理設(shè)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3棵苗。菌劑、病原菌接種、調(diào)查方法、統(tǒng)計(jì)病害方法同溫室大棚盆栽防效測(cè)定相同。接種病原菌25、29、31、35 d分別，調(diào)查病害嚴(yán)重度并計(jì)算生防效果。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

在Microsoft Excel中對(duì)平板的抑菌圈、酶活、病害嚴(yán)重度、防效等數(shù)據(jù)進(jìn)行基礎(chǔ)處理。用分析軟件DPS v7.05進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為平均值±SD，通過One-Way ANOVA Analysis、LSD Test（p<0.05）進(jìn)行方差和顯著水平分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各生境細(xì)菌的分離結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)樣品主要來自木薯幾個(gè)不同生境，針對(duì)每個(gè)生境植物組織的根莖葉進(jìn)行樣本的分析處理，如表1。隨后對(duì)這些生境處理中細(xì)菌種群密度和數(shù)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)存在差異；種群密度最高的為DDWR（病害地塊的病株上健康部位-根-外生菌），達(dá)1.2×107 CFU/g FW；最低的為DHNY（病害地塊的病株上健康部位-葉-內(nèi)生菌），為1×104 CFU/g FW；從HWR（無病害地塊的健康植株-根-外生菌）中分離到細(xì)菌的比例最高，為7.72%，DHNY（病害地塊的健康植株-葉-內(nèi)生菌）和HNYT（吳川唐綴健株葉片-內(nèi)生葉）中則分離菌株數(shù)量較少，分別為1.34%和0.34%（表1）?？傏厔?shì)為，外圍細(xì)菌的種群密度和數(shù)量均高于內(nèi)生菌株；根圍菌株的高于葉片和莖部；而土壤中分離菌株的豐度則高于植株（葉、莖、根）。

2.2 細(xì)菌產(chǎn)水解酶、次生代謝物及頡頏活性結(jié)果

將分離的298株細(xì)菌就其產(chǎn)酶活性和產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，其中160株具蛋白酶活性，7株具幾丁質(zhì)酶活性，203株產(chǎn)嗜鐵素，57株產(chǎn)纖維素酶，11株產(chǎn)葡聚糖酶，150株細(xì)菌能產(chǎn)生長(zhǎng)素。其中產(chǎn)嗜鐵素的菌株最多，占總菌株數(shù)的68.12%，產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株最少，僅為2.35%，產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶、葡聚糖酶和生長(zhǎng)素的細(xì)菌比例分別為53.69%、19.13%、3.69%和50.34%（表2）。

頡頏活性測(cè)定結(jié)果表明，9株細(xì)菌具有頡頏活性，占總菌株數(shù)的3.02%，這些菌株分別來自HWS、HWY、HWR、DHW和SHNR五種生境，其中來自HWS的分離菌株中具有頡頏活性的菌株比例最高，達(dá)18.8%，其次為HWY中分離得到的頡頏菌株，占14.3%。在HWR、DHW和SHNR生境中則分別為8.7%、7.1%和7.7%（表2）。

對(duì)298株生防潛力菌株（BCAs，Biological Control Agents）的酶活性、次生代謝物和平板頡頏活性進(jìn)行賦值，根據(jù)得分及菌株分離生境等綜合因素，選擇其中88株BCAs進(jìn)行16s RNA測(cè)序和指紋圖譜分析。

2.3 聚類分析和賦值評(píng)估

測(cè)序和ARDRA、BOX-PCR圖譜分析，88個(gè)菌株分別來自以下21個(gè)簇（屬）：G1葡萄球菌屬（Staphylococcus sp.）、G2微球菌屬（Micrococcus sp.）、G3泛菌屬（Pantoea sp.）、G4黃單孢菌屬（Xanthomonas sp.）、G5假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、G6不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.）、G7埃希氏菌屬（Escherichia sp.）、G8短桿菌屬（Brevibacterium sp.）、G9克洛諾斯氏菌屬（Cronobacte sp.）、G10芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）、G11類諾卡氏菌屬（Nocardioidaceae sp.）、G12類芽孢桿菌屬（Paenibacillus sp.）、G13微小桿菌屬（Exiguobacterium sp.）、G14蒼白桿菌屬（Ochrobactrum sp.）、G15短小桿菌屬（Curtobacterium sp.）、G16金黃桿菌屬（Chryseobacterium sp.）、G17肺炎桿菌屬（Klebsiella sp.）、G18腸桿菌屬（Enterobacteria sp.）、G19伯克霍爾德菌屬（Burkholderia sp.）、G20小細(xì)菌屬（Microbacterium sp.）、G21叢毛單胞菌屬（Comamonas sp.）。進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)21個(gè)屬（簇）的細(xì)菌所占比例存在差異（圖1），其中以以G10芽孢桿菌屬的豐度最好，所占比例為26.14%，其次是G18和19（9.09%），G20、G16和G17（7.95%），最低的為G1＼2＼7＼8＼9＼11＼12＼13＼14（1.14%）。

對(duì)88株頡頏細(xì)菌進(jìn)行綜合賦值評(píng)估，結(jié)果見表3，得分范圍為1～13分，得分最高菌株為HNR3-7和HYW3-9，得分分別分布如下：1分（16個(gè)，18.18%），2分（6個(gè)，6.82%），3分（7個(gè)，7.95%），4分（7個(gè)，7.95%），5分（15個(gè)，13.64%），6分（12個(gè)，13.64%），7分（8個(gè)，9.09%），8分（1個(gè)，1.14%），9分（3個(gè)，3.41%），10分（7個(gè)，7.95%），11分（3個(gè)，3.41%），12分（1個(gè)，1.14%），13分（2個(gè)，2.27%）。大多菌株得分分布在5～7分。

結(jié)合以上綜合數(shù)據(jù)，選擇其中11個(gè)菌株進(jìn)行溫室盆栽防效測(cè)定。這11個(gè)菌株得分情況分別如下（表3），得分最高為HNR-3-7，可產(chǎn)生纖維素酶、蛋白酶，具有較好的嗜鐵素分解能力，且有平板頡頏作用；得分中等且有較好頡頏作用的菌株有HWY-3-1、HWS-4-3；這3個(gè)菌株還來自同一個(gè)屬（G10），經(jīng)菌株鑒定分析，它們均屬于Bacillus sp.。來自另一簇的菌株HWYT-3-2，得分最低，為2，僅產(chǎn)生嗜鐵素，鑒定為Brevibacterium sp.

可見，選擇的這11個(gè)待開展溫室盆栽防效測(cè)定的菌株，種類較為豐富，且產(chǎn)酶種類存在差異，平板頡頏效果亦不相同。

2.4 防效測(cè)定

溫室接種病原菌后21～28 d調(diào)查病害情況（表4），發(fā)現(xiàn)防效較好菌株為HWY-3-1、HWYT-3-2、DBS-5，防效在100%～64.40%間。對(duì)21～28 d的防效進(jìn)行平均系數(shù)分析，結(jié)果顯示，HWY-3-1防效為100%，植株并沒發(fā)病，和對(duì)照相比，差異顯著；防效在60%以上的菌株有DBS-5（85.96%）、HS-4-3（82.88%）、DHWP-1（79.37%）、HWYT-3-2（77.88%）、HWS-4-3（77.84%）、DHNS-3-5（65.34%）、DHWR-5-1（61.83%），和對(duì)照的防效相比，差異也顯著；防效較差的菌株為HNR-3-7（0.17%）和HNR-4-3（44.14%），均為Bacillus amyloliquefaciens，它們和對(duì)照間防效的差異不也顯著。

根據(jù)溫室防效結(jié)果，選擇其中5株細(xì)菌測(cè)定其田間防效作用（表5），來自不同生境，分別為HWY-3-1（Bacillus pumilus）、HNR-3-7（Bacillus amyloliquefaciens）、DHNS-3-5（Curtobacterium citreum）、HS-4-3（Enterobacter sp.）、DBS-5（Microbacterium arborescens），其中HNR-3-7的盆栽防效較差，但因其具有較好的纖維素降解和糖化水平[19]，故也作為田間防效的測(cè)試菌株。

在田間，接種病原菌后25 d調(diào)查，結(jié)果顯示，防效較好菌株為HWY-3-1、HNR-3-7和DBS-5，防效在74.20%～36.42%。對(duì)25～35 d的防效進(jìn)行平均系數(shù)分析，結(jié)果顯示，HWY-3-1平均防效為38.11%，與對(duì)照的防效存在顯著差異；HNR-3-7（25.31%）、DBS-5（7.90%）和HS-4-3（19.73%）防效和對(duì)照存在差異，但不顯著。

3 討論

木薯細(xì)菌性枯萎病對(duì)木薯產(chǎn)業(yè)具有毀滅性危害，嚴(yán)重威脅木薯的產(chǎn)量及品質(zhì)，尋找有效防治該病害的措施尤為重要。生物防治中以菌防菌，成為一種發(fā)展趨勢(shì)，對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有巨大意義[20-21]。其中利用有益微生物調(diào)控植物病害具有可持續(xù)性且對(duì)環(huán)境友好[22-23]。生物防治首要任務(wù)是優(yōu)質(zhì)的潛在生防菌株分離、篩選。目前，大部分篩選策略多是基于離體條件下菌株對(duì)病原菌的頡頏活性開展[24]。但平板具有較好頡頏活性的菌株，大約1%的菌株能在溫室實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)生防效果，而這個(gè)比例到了田間會(huì)更少[10]。因此，篩選策略是生物防治面臨的難點(diǎn)。

生防菌株對(duì)病害的控制一般是多種機(jī)理綜合作用的結(jié)果，如營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，主要是鐵離子的競(jìng)爭(zhēng)；生態(tài)位的競(jìng)爭(zhēng)，主要是定殖效應(yīng)影響微生態(tài)群落多樣性；產(chǎn)生抑菌物質(zhì)；誘導(dǎo)植物抗病體系。在篩選過程中，一般首先測(cè)定菌株頡頏活性，再測(cè)定頡頏活性較好菌株酶活性，必然會(huì)忽略很多無頡頏活性但可能具有較好酶活性的潛力菌株，而它們可能可誘導(dǎo)植物抗性。此外，由于分離方法的局限性，分離中不可避免存在重復(fù)菌株。通過ARDRA和BOX指紋圖譜分析并結(jié)合16s RNA測(cè)序分析，從遺傳學(xué)角度上進(jìn)一步優(yōu)化分析分離菌株，盡可能有效去除重復(fù)菌株[12]。本研究中，我們建立一套針對(duì)CBB生防菌株篩選系統(tǒng)，統(tǒng)籌頡頏和酶活性以及指紋圖譜分析數(shù)據(jù)，采取賦值評(píng)估，優(yōu)選潛在生防菌株，測(cè)定生防效果。通過溫室盆栽和田間防效結(jié)果證明了我們假設(shè)的這套篩選系統(tǒng)的可行性。來自3個(gè)不同簇的菌株HWY-3-1（G10）、HS-4-3（G18）和 DBS-5（G20），溫室防效依次為100%、82.88%和 85.96%；賦值得分依次為7、3、6，其中HWY-3-1可產(chǎn)生嗜鐵素和蛋白酶以及具有平板頡頏活性；HS-4-3則可產(chǎn)生葡聚糖酶和IAA，DBS-5可產(chǎn)生嗜鐵素、蛋白酶和纖維素酶活性。來自同一簇G10的菌株HWY-3-1、HWS-4-3、HNR-3-7、HS-4-7、DHWP-1，賦值分別為7、10、13、10、6，防效依次為100%、77.84%、61.83%、82.88% 和79.37%，可產(chǎn)生嗜鐵素和蛋白酶。在此基礎(chǔ)上，從同一簇菌株中優(yōu)選還具有頡頏活性的HWY-3-1測(cè)定田間防效，表現(xiàn)穩(wěn)定防效。田間測(cè)試的5個(gè)菌株，3個(gè)菌株無平板頡頏活性，田間防效表現(xiàn)一般，但防效低于有頡頏活性的菌株HWY-3-1和 HNR-3-7。在溫室防效測(cè)試中，還具有頡頏活性菌株HWY-3-1（100%）和HWS-4-3（77.84%），其防效和無頡頏活性菌株防效HS-4-3（82.88%）和DBS-5（85.96%），差異不顯著。由此可見，頡頏活性和酶活性在生防潛力菌株篩選中，同等重要。

芽孢桿菌和假單胞類細(xì)菌是生防細(xì)菌的最大家族，而前者更是防治真菌、細(xì)菌病害的優(yōu)選對(duì)象。生防細(xì)菌發(fā)揮抗菌作用的機(jī)理主要包括產(chǎn)生抗生物質(zhì)、產(chǎn)生胞外酶如幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、蛋白酶和β-1，3-葡聚糖酶等來抑制病原物的生長(zhǎng)、與病原物競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)如產(chǎn)生嗜鐵素、與病原物競(jìng)爭(zhēng)空間位點(diǎn)、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性[25-28]。本研究從木薯多個(gè)生境分離到298株頡頏細(xì)菌，豐度較好，可分為21個(gè)簇；經(jīng)過測(cè)序分析，芽孢桿菌所占比例較大，有Bacillus pumilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus cereus、Bacillus megaterium、Bacillus subtilis等。298個(gè)菌株產(chǎn)生水解酶活性比例不同，其中以產(chǎn)生蛋白酶活性的菌株比例最高，為53.69%；產(chǎn)生嗜鐵素和生長(zhǎng)素IAA的菌株比例分別高達(dá)68.12%和50.34%。對(duì)298個(gè)菌株的平板頡頏效能、產(chǎn)酶活性和代謝能力進(jìn)行賦值，每個(gè)生境選擇出至少1個(gè)菌株，從中篩選得分較高的88株細(xì)菌進(jìn)行聚類分析和測(cè)序分析，挑選11個(gè)綜合賦值評(píng)估較高效的菌株開展溫室盆栽防效實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其中賦值得分較高的菌株溫室防效較高；優(yōu)選5株不同種的細(xì)菌，測(cè)定其田間防效，平均防效均高于對(duì)照組，但低于溫室盆栽防效。導(dǎo)致這種結(jié)果出現(xiàn)的重要原因之一可能是因?yàn)樵谔镩g使用菌劑過程中菌劑的生態(tài)環(huán)境遠(yuǎn)遠(yuǎn)復(fù)雜于理想的溫室條件；但本研究的有效生防菌HWY-3-1仍表現(xiàn)出38.11%的平均防效，在CBB發(fā)病起初，該菌株防效達(dá)到74.20%；該菌株具有較好的平板頡頏效果以及產(chǎn)生嗜鐵素和蛋白酶的活性，后期還發(fā)現(xiàn)該菌株可在木薯葉片較好定殖，能影響葉片的微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性（Zheng et al，unpublished）。

也有相關(guān)研究表明，從根圍土中分離的生防潛力菌株其防效可能更持久和穩(wěn)定，鄭麗等[29]在研究黃瓜霜霉病的生物防控中發(fā)現(xiàn)，篩選的PGPR菌來自健康或發(fā)病植株的根圍土或者葉圍，推測(cè)根圍土和葉圍可能是生防菌分離的優(yōu)選。在本研究中，從不同生境分離生防潛力菌株，如健康或發(fā)病植株的根圍土、根、莖、葉的內(nèi)生菌和外生菌；酶活性、頡頏和防效數(shù)據(jù)表明，葉圍（HWY-3-1）和根圍土（HS-4-3）是生防菌分離較好的來源（表2～5）。產(chǎn)生蛋白酶活性比例最高的生境為根內(nèi)（HNR，84.60%），幾丁質(zhì)酶的為莖內(nèi)（DDNS，14.30%）、嗜鐵素的為莖圍（DHWS，92.90），纖維素酶的莖內(nèi)（DHNS，62.50%），β-1，3-葡聚糖酶的為根圍土（HS，42.90），IAA的為根圍（DDWR，88.90%）；9株具有頡頏活性菌株分離的生境為葉圍（HWY，14.3%）、莖圍（HWS，8.8%）、根圍（HWR，8.7%），土壤（DHWS，7.1%）、根內(nèi)（HNR，7.7%）?？梢?，生防潛力細(xì)菌的多樣性，也為獲得優(yōu)質(zhì)生防菌提供了重要的基礎(chǔ)。

目前，報(bào)道防治CBB的藥劑有治農(nóng)菌和中生菌素，防效分別為71.39%和64.32%；其次是高營(yíng)鏈霉素和大生，校正防效分別為57.41%和52.83%；殺毒礬和春雷霉素的防效分別是35.77%和29.37%[18]，其中，陳奕鵬報(bào)道有內(nèi)生生防菌株類芽孢桿菌屬[30]，與研究中發(fā)現(xiàn)的生防細(xì)菌HWY-3-1（Bacillus pumilus）防效相似。其中DHNS-3-5（Curtobacterium citreum）、HS-4-3（Enterobacter sp.）、DBS-5（Microbacterium arborescens）也可作為后期聯(lián)合混配生防菌劑的材料。

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