油棕草莖點霉葉斑病病原菌的生物學(xué)特性和毒力測定

鄭麗 張海鵬 林江 曾憲海 李靜

摘 要 對油棕草莖點霉葉斑病病原菌（Phoma herbarum）的生物學(xué)特性展開研究。結(jié)果表明：菌絲最適生長溫度為20～25 ℃，pH為6～8，在PDA和PSA培養(yǎng)基中菌絲生長最快，光照對菌絲生長無影響，菌絲可利用多種碳源、氮源，其中以葡萄糖、半乳糖、木糖和蔗糖為碳源生長最好，對氮源的利用效率以胰蛋白胨最高。采用菌絲生長速率法測定13種殺菌劑的室內(nèi)毒力，結(jié)果表明：甲基硫菌靈和咪鮮胺毒力最強，EC50分別為1.100 7、1.451 6 mg/L，效果最好。

關(guān)鍵詞 油棕葉斑病；草莖點霉；生物學(xué)特性；毒力測定

中圖分類號 S184 文獻標(biāo)識碼 A

Biological Characteristics and Toxic Test of the Pathogen

（Phoma herbarum）of Oil Palm Leaf Spot

in the Seedling Stage

ZHENG Li1，2，3， ZHANG Haipeng3， LIN Jiang4， ZENG Xianhai2，

LI Jing2， SHEN Huifang6， XIE Changping5 *， QIN Xindao2 *

1 Guangzhou Experimental Station， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Guangzhou， Guangdong 510140， China

2 Opening Project Fund of Key Laboratory of Rubber Biology and Genetic Resource Utilization， Ministry of Agriculture / State

Key Laboratory Breeding Base of Cultivation & Physiology for Tropical Crops / Danzhou Investigation & Experiment Station

of Tropical Crops， Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan 571737， China

3 College of Agriculturure， South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510642， China

4 Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Danzhou，Hainan 571737，China

5 College of Environment and Plant Protection， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

6 Institute of Plant Protection， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou， Guangdong 510640， China

Abstract The biological characteristics of Phoma herbarum， which causes leaf spot on oil palm， were as follows： the optimum temperature and pH for the mycelia growth was 20～25 ℃ and pH 6.0～8.0， respectively. The hyphae of this strain could grow faster on PDA and PSA medium and there was no significance between the light or dark treatments. Besides， the carbon sources such as glucose， galactose， xylose and sucrose were suitable for the hyphae to grow and tryptone could be efficiently used by this strain. Lastly， the inhibition activity of 13 common fungicides against P. herbarum was also carried out by the mycelium growth rate method. According to the tested results， the fungicides with best inhibition activity were 70% Thiophanate-Methyl（WP）and 45% Prochloraz（SC）and the values of their EC50 was1.100 7 and 1.451 6 mg/L， respectively.

Key words Leaf spot of Oil palm； Phoma herbarum； biological characteristics； screening of fungicides

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.09.019

油棕（Elaeis guineensis Jacq），別名油椰子、非洲油棕，是熱帶地區(qū)重要的木本油料作物，有“世界油王”之稱[1]。油棕的綜合利用價值比較高，除食用外，也可用于工業(yè)和生物柴油的生產(chǎn)[2-5]。因此，油棕作為“綠色能源”、“可再生能源”及高產(chǎn)油效率作物，具有很好的發(fā)展前景[6]。

隨著種植面積的增大、植株的調(diào)運及試種引種新環(huán)境，植株面臨新病害的威脅。據(jù)報道，為害油棕葉片的病原菌主要有擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis spp.）、長蠕孢屬（Helminthosporium spp.）、靈芝屬（Genoderma spp.）等[7-12]，新老葉皆可發(fā)病，初期出現(xiàn)黃色小斑點，擴大成橢圓形至圓形，后期葉片焦枯、死亡、脫落[7]，而油棕苗期草莖點霉葉斑病癥狀特點為：在葉片上出現(xiàn)形狀不規(guī)則和大小不一的褐色病斑，葉面稍有突起，葉背向下凹陷，隨著病情發(fā)展，病斑相連擴大，中央呈灰白色，其上散生許多黑色小點，邊緣暗褐色，外圍常有黃色暈圈，嚴(yán)重影響葉片光合作用，降低景觀效益，制約油棕的發(fā)展[13]。目前主要依靠化學(xué)藥劑防治病害，代森錳鋅、甲霜靈與福美雙復(fù)配能有效控制葉斑病的流行[9]。楊炳安[14]報道，苯菌靈可防治葉斑病，且有很好的防治效果。據(jù)報道，殺蟲劑通過減少蟲子對油棕帶來傷口來降低葉斑病病原菌侵入幾率，從而達到較好控制葉斑病發(fā)生[15]。

本研究針對熱科院廣州實驗站在廣東江門地區(qū)引種試種引起的油棕苗期草莖點霉葉斑病病原菌的生物學(xué)特性和室內(nèi)殺菌劑毒力進行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫的研究，以期為下一步溫室和大田防控實施提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病原菌 本研究室前期分離、保存、鑒定的病原菌草莖點霉（Phoma herbarum），命名為YZ-8[16]。

1.1.2 供試藥劑 室內(nèi)化學(xué)藥劑毒力測定所用13種殺菌劑均為市售品種，具體信息如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 病原菌生物學(xué)特性的測定 溫度對病原菌菌絲生長的影響：將純化的病原菌制成直徑為5 mm的菌餅，接種于PDA培養(yǎng)基上，然后分別置于5、10、15、20、25、30和35 ℃的全光照（3 000 lx）恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌絲生長情況。7 d后用十字交叉法測量菌落直徑，每處理5個重復(fù)，詳情參考范昆等[17]方法。

pH值對病原菌菌絲生長的影響：用HCl和NaOH將PDA培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0。然后采用上述接種、測量的方法。每處理5個重復(fù)，詳情參考范昆等[17]方法。

碳源對病原菌菌絲生長的影響：以Czapek培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，往其中加入等量乳糖、麥芽糖、半乳糖、木糖、葡萄糖、甘露糖和可溶性淀粉替換蔗糖配制不同碳源的培養(yǎng)基，以不添加碳源的Czapek培養(yǎng)基為對照。然后采用上述接種、測量的方法。每處理5個重復(fù)，請參考范昆等[17]方法。

氮源對病原菌菌絲生長的影響：將Czapek培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別往其中加入等量Ca（NO3）2、NaNO3、氯化銨、酵母浸膏、胰蛋白胨、尿素和KNO3替換蔗糖配制不同氮源培養(yǎng)基，以不添加氮源的Czapek培養(yǎng)基為對照，再采用上述接種、測量的方法。每處理5個重復(fù)，詳情參考范昆等[17]方法。

光照對病原菌菌絲生長的影響：從菌落邊緣取直徑5 mm菌餅接種于PDA培養(yǎng)基上，然后分別置于24 h黑暗、24 h光照和光暗交替（12 h/12 h），培養(yǎng)7 d，測量菌落直徑。每處理5個重復(fù)。

培養(yǎng)基類型對病原菌菌絲生長的影響：從純化的菌落邊緣取直徑5 mm的菌餅分別接種到PDA培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基、OMA培養(yǎng)基、CMA培養(yǎng)基、Czapek培養(yǎng)基、WA培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基平板上，在25 ℃恒溫條件下培養(yǎng)7 d，測量菌落直徑。每處理5個重復(fù)，詳情參考范昆等[17]方法。

1.2.2 病原菌室內(nèi)藥劑篩選 采用菌絲生長速率法進行抑菌效果的測定[18]。具體方法為：每種供試藥劑按一定量加入到一定體積的PDA培養(yǎng)基中，根據(jù)所選殺菌劑的推薦劑量配制7個濃度梯度的殺菌劑培養(yǎng)基平板，然后從純化的菌落邊緣打取直徑0.5 cm（Ф0=0.5 cm）的菌餅分別接種，以不加殺菌劑的處理作為對照，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，測量菌落直徑，并計算抑菌率。每個處理5個重復(fù)。

根據(jù)測量的數(shù)據(jù)計算出濃度對數(shù)（X）和抑制菌落生長百分率的幾率值（Y），并利用最小二乘法求得各藥劑對該病原菌的毒力回歸方程（Y=a+bX）、半抑制濃度EC50值和相關(guān)系數(shù)（r2）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

在Microsoft Excel中對菌絲菌落大小、藥劑平板抑菌圈等數(shù)據(jù)處理，實驗結(jié)果為平均值±SD。顯著水平（p<0.05）由DPS version 7.05獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的生物學(xué)特性分析

2.1.1 溫度對病原菌菌絲生長的影響 試驗結(jié)果表明，在10～35 ℃范圍內(nèi)，病原菌的菌絲均能生長，當(dāng)溫度低于5 ℃時，菌絲停止生長，在20～25 ℃生長最快，25 ℃時菌落直徑達50.20 mm，表明該病原的菌落最適生長溫度為20～25 ℃（圖1）。

2.1.2 pH值對病原菌菌絲生長的影響 不同pH值對菌絲生長具有不同影響。病原菌在pH值為3～11的范圍內(nèi)，其菌絲生長存在差異。其中pH值在6～9范圍內(nèi)，菌絲生長較快，但差異不顯著，連續(xù)培養(yǎng)7 d，菌落直徑范圍為52.90～55.70 mm；pH值為4或11的環(huán)境中，菌絲雖能正常生長，但生長很緩慢，且二者差異不顯著；pH值為3時，菌絲生長最慢，直徑僅為14.50 mm。其中，pH值為7和8時，最適合菌株生長，直徑達到56.60 mm和55.70 mm。適宜菌絲生長的pH值范圍5～10，最適pH值為6～8（圖2）。

2.1.3 碳源對病原菌菌絲生長的影響 分別以單糖、雙糖和多糖作為菌絲生長碳源，結(jié)果顯示，病原菌僅在以乳糖為碳源的培養(yǎng)基上不生長，在其他碳源上，菌絲生長趨勢均顯著優(yōu)于空白處理。其中，病原菌利用葡萄糖、半乳糖、木糖和蔗糖效率最高，四者間的利用率無顯著差異（圖3）。對可溶性淀粉、甘露醇及麥芽糖等碳源，其利用效果一般，其中以利用可溶性淀粉效率最差。由此可見，不同碳源對菌絲生長存在差異，病原菌對碳源的需求不嚴(yán)格。

2.1.4 氮源對病原菌菌絲生長的影響 數(shù)據(jù)顯示，病原菌對不同氮源利用的差異顯著，其中胰蛋白胨最適合菌絲生長，其次為硝酸鉀。在硝酸鈉和尿素中生長良好，硝酸鈣和谷氨酸利用效率差異不顯著，氯化銨的利用率最低（圖4）。由此可見，不同氮源對菌絲生長影響不同。

2.1.5 光照對病原菌菌絲生長的影響 光照處理7 d后，發(fā)現(xiàn)不同光照條件對病原菌菌絲生長無顯著差異（圖5）。在連續(xù)黑暗、光暗交替或連續(xù)光照下，菌絲的菌落生長速率基本一致，菌落直徑在51.00～52.40 mm之間。

2.1.6 培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響 結(jié)果表明，菌絲在PDA和PSA培養(yǎng)基中生長最好，但差異不顯著，培養(yǎng)7 d菌落直徑為55.00 mm；但在OMA和Czapek培養(yǎng)基上生長較慢（圖6）。可見，不同培養(yǎng)基對菌絲生長存在影響。

2.2 毒力測定結(jié)果

13種殺菌劑的毒力測定結(jié)果顯示，不同殺菌劑對病原物的毒力水平存在差異。其中甲基硫菌靈的毒力最強，EC50值為1.1007 mg/L，其次為咪酰胺，EC50值為1.4516 mg/L，而氨基寡糖素和多菌靈基本無效，EC50分別為442.089 1和 2 577.070 3 mg/L。EC50低于10 mg/L的藥劑有甲基硫菌靈、咪酰胺、丙環(huán)唑、氟硅唑和苯醚甲環(huán)唑；EC50為10～100 mg/L的藥劑有丙森鋅、三唑酮、代森聯(lián)、嘧菌酯和代森鋅（表2）。

3 討論

本文對油棕草莖點霉葉斑病病原菌（Phoma herbarum）進行生物學(xué)特性測定。結(jié)果表明，草莖點霉菌菌絲最適生長溫度為20～25 ℃，最適pH值為6～8；在PDA和PSA培養(yǎng)基中菌絲生長最快；光照對菌絲生長無影響；其菌絲能利用多種碳源、氮源，其中以葡萄糖、半乳糖、木糖和蔗糖為碳源生長最好，對氮源的利用效率以胰蛋白胨最高，該結(jié)果與谷祖敏[19]的報道基本一致。由此推測，從不同寄主植物上分離到的草莖點霉菌，其生物學(xué)特性差異較??；這為后期實驗病原菌選擇最優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)方案提供較好的參考意義。

通過對草莖點霉病原菌的室內(nèi)藥劑篩選實驗，發(fā)現(xiàn)甲基硫菌靈和咪鮮胺毒力最強，其EC50分別為1.100 7、1.451 6 mg/L，氨基寡糖素效果不明顯。谷祖敏等[20]對草莖點霉也進行了化學(xué)藥劑的篩選，結(jié)果表明，多菌靈、三唑銅和代森錳鋅都具有較好的抑菌效果。本研究除了使用該3種殺菌劑以外還進行了其他10種藥劑的篩選，并最終獲得了抑制效果較好的殺菌劑，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐提供理論指導(dǎo)，從而達到防治該病害，避免造成經(jīng)濟損失，為油棕推廣和種植提供積極意義。

相關(guān)研究報道，草莖點霉菌既可以作為植物致病菌，危害作物有地黃[21]、鴨跖草[22]、豌豆[24]、針葉樹種子[24]、Tedera等[25]，也可以作為某些作物如田間鴨跖草的寄生菌而成為一種較好的生物源材料[22，26]。不同種類農(nóng)藥對草莖點霉菌絲抑制效果存在差異的原因可能在于靶標(biāo)生物作用機理存在差異。本文只對菌絲的毒力效果進行評估，缺乏相關(guān)化學(xué)藥劑對其分生孢子萌發(fā)的毒力測定實驗。此外，本試驗涉及的殺菌劑毒力測定試驗均為室內(nèi)平板試驗，由于大田的生態(tài)環(huán)境和人為因素具有不確定性，因此篩選出藥劑有待選擇幾種優(yōu)化品種，進一步測定其田間防效。

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