咖啡駝孢銹菌PCR分子檢測體系的建立

汪涵 吳偉懷 李樂 梁艷瓊 鄭金龍 習(xí)金根 李銳 黃興 賀春萍 易克賢

摘 要 由專性寄生菌咖啡駝孢銹菌（Hemileia vastatrix）引起的咖啡葉銹病是影響咖啡產(chǎn)量的最主要真菌病害。為建立對咖啡駝孢銹菌具有高特異性、高靈敏度、易操作的分子檢測方法，本研究通過對咖啡駝孢銹菌DNA核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1～ITS4序列與其近源序列作多重比較分析，獲得其特異性區(qū)域，并于特異性區(qū)域設(shè)計了1對引物Hv-ITS-F/R。利用該特異引物，通過對咖啡駝孢銹菌、咖啡褐斑病菌、咖啡銹菌重寄生菌、咖啡炭疽菌以及不同屬其它真菌基因組DNA進行PCR擴增。結(jié)果表明：此引物對僅能從咖啡駝孢銹菌基因組DNA中擴增出396 bp的特異條帶，對其它相似或相近的病原真菌則無擴增條帶。靈敏度試驗結(jié)果表明，在DNA水平上檢測濃度可達10 pg/μL。進一步通過田間健康與疑似發(fā)病植株的檢測，結(jié)果呈現(xiàn)出很好的應(yīng)用前景。由此表明，該引物對能有效地用于咖啡組織中駝孢銹菌的檢測。

關(guān)鍵詞 咖啡；咖啡駝孢銹菌；PCR；分子檢測

中圖分類號 S763.15 文獻標識碼 A

PCR-Based Molecular Detection of Hemileia vastatrix in Coffee

WANG Han1，2， WU Weihuai2 *， LI Le1，2， LIANG Yanqiong2， ZHENG Jinlong2， XI Jingen2，

LI Rui2， HUANG Xing2， HE Chunping2 **， YI Kexian2 **

1 Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Environment and Plant Protection Institute， CATAS / Ministry of Agriculture Key Laboratory for Monitoring and Control of

Tropical Agricultural and Forest Invasive Alien Pests / Hainan Key Laboratory for Detection and Control of Tropical

Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract Coffee leaf rust caused by Hemileia vastatrix（Hv）is a serious fungal disease worldwide and has great impact on the coffee yield. The study was aimed to establish a rapid molecular biological way with the characteristics of high specificity， high sensitivity and simple operation. Based on the differences in the sequences of internal transcribed spacer（ITS）ITS1-ITS4 sequence ribosomal DNA of Hv in coffee and the other closely related species， a pair of primers Hv-ITS-F/R were designed and a PCR assay was developed in the study. Among Hv， Cerospora coffeicola Berket Cooke， hyperparasites fungi of Hv， Colletotrichum kahawae and other fungi species， only a single PCR band of 396 bp amplified with DNA extracted from all isolates of Hv in coffee， while other tested isolates had no corresponding band. The detection sensitivity could be up to 10 pg/μL genomic DNA. The results showed that the PCR-based assay would provide a rapid and sensitive method for the Hv detection of naturally infected coffee tissues. It has great significance for early diagnosis and rapid detection of coffee leaf rust early disease， and the research of growth and decline trends and disease epidemiology.

Key words Coffee； Hemileia vastatrix； polymerase chain reaction； molecular detection

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.09.016

咖啡為茜草科（Rubiaceae）咖啡屬（Coffea）植物[1]。 在世界三大飲料作物（咖啡、茶葉、可可）中，咖啡其產(chǎn)量、產(chǎn)值及消費量均居三大飲料作物之首?？Х热~銹病是阿拉比卡小粒種咖啡（Coffea arabica L.）的主要病害。該病由咖啡駝孢銹菌（Hemileia vastatrix Berkeley and Broome）引起，主要侵染咖啡葉片，漿果和枝條很少發(fā)病，感病后葉背面最初出現(xiàn)淺黃色水漬狀小病斑，周圍有淺綠色暈圈[2]。當病斑擴大到5～8 cm時葉背就產(chǎn)生橙黃色粉狀孢子堆。隨著病斑的擴大，幾個病斑連成不規(guī)則形的大斑，晚期干枯成深褐色病斑在葉片兩面均可見。嚴重時，引起咖啡樹大量落葉枝條干枯，甚至整株枯死[3-4]。在適宜的氣候條件下，該病可以導(dǎo)致葉片損失最多可達50%，漿果損失可高達70%[5]。

咖啡葉銹病對咖啡種植產(chǎn)業(yè)的危害長達幾個世紀，該病曾對斯里蘭卡及拉丁美洲等多個咖啡種植國家，造成了嚴重的經(jīng)濟損失[6]。近年中國咖啡產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，僅2014年，中國咖啡種植面積達到12.86萬hm2，年產(chǎn)咖啡豆12.6萬t，均創(chuàng)歷史新高[7]。據(jù)報道，在2015年，僅云南小?？Х鹊姆N植面積已經(jīng)超過12萬hm2，產(chǎn)量達13萬t[8]。然而，由咖啡駝孢銹菌（Hemileia vastatrix）引起的咖啡葉銹病是中國咖啡種植區(qū)最嚴重的毀滅性病害，嚴重威脅咖啡產(chǎn)業(yè)穩(wěn)定、健康和安全發(fā)展[9]。

目前，咖啡葉銹病的防治措施主要有：選育抗病品種、生物防治、化學(xué)防治以及農(nóng)業(yè)生態(tài)調(diào)控4個方面[5]。及早發(fā)現(xiàn)病害，因地制宜采取相應(yīng)的防控措施，才能有效地對病害進行控制，減少產(chǎn)量損失。迄今為止，對咖啡駝孢銹菌的檢測與鑒定，仍然依賴常規(guī)的形態(tài)學(xué)并結(jié)合傳統(tǒng)鑒別寄主技術(shù)的方法。該方法比較費時費力，且不同環(huán)境條件下的病菌形態(tài)會有所差異，需要具備專業(yè)的分類學(xué)知識以及豐富的經(jīng)驗[10-12]。同時，咖啡駝孢銹菌是一種專性寄生真菌，傳統(tǒng)診斷方法具有一定的局限性，以致于難以滿足快速、高通量鑒定與檢測的實際需求。近年來隨著核酸分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以PCR技術(shù)為代表的分子檢測方法得到迅速發(fā)展和應(yīng)用。因其具有快速、準確、靈敏且不需要進行病原菌的分離培養(yǎng)等特點，已廣泛應(yīng)用于植物病害檢測及其病原菌鑒定等方面。然而，在咖啡駝孢銹菌檢測方面，國內(nèi)還未見有簡單易行、準確靈敏的分子檢測技術(shù)。因此，有必要研發(fā)一種能快速、準確檢測咖啡駝孢銹菌的現(xiàn)代分子診斷與檢測技術(shù)，為咖啡駝孢銹菌的潛伏、發(fā)生、群體分布及消長動態(tài)提供可靠的監(jiān)測手段，進而為有效預(yù)測與防治咖啡銹病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本實驗所采用來自云南咖啡產(chǎn)區(qū)的咖啡駝孢銹菌（Hemileia vastatrix）菌株，并以咖啡炭疽菌（Colletotrichum kahawae），咖啡銹菌重寄生菌（hyperparasites of Hv），咖啡褐斑病菌（Cerospora coffeicola Berket Cooke），雞蛋花鞘銹菌（Coleosporium plumierae）、甘蔗赤腐病菌（Colletotrichum falcatum）、甘蔗黑穗病菌（Ustilago scitaminea）、甘蔗環(huán)斑病菌（Leptosphaeria sacchari Breda）、以及劍麻斑馬紋病菌（Phytophthora nicotianae Breda）等作為對照菌株。供試菌株具體寄主及來源詳見表1。所有菌株均保存在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所。

1.1.2 試劑 EcoTaq PCR SuperMix購于全式金生物技術(shù)（北京）有限公司，西班牙瓊脂糖（Biowest regular agarose G-10），10×rTaq Buffer，2.5 mmol/L dNTPs，rTaq DNAPolymerase均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 采集已嚴重發(fā)銹病的咖啡與雞蛋花葉片，于實驗室利用接種刀片刮下其表面附著的夏孢子堆。所得的孢子堆，直接采用真菌DNA提取試劑盒（E.Z.N.ATM Fungal DNA kit，Omega公司，美國）提取上述菌株的DNA。其它菌株則采用菌絲體通過上述試劑盒進行DNA提取。

1.2.2 咖啡銹菌ITS序列片段克隆與測序 利用真菌ITS序列擴增通用引物ITS1/ITS4[13]。采用20 μL反應(yīng)體系：14.2 μL ddH2O，2 μL 10×rTaq Buffer，1.6 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.2 μL rTaq DNA Polymerase（5 U/μL），各0.5 μL 10 μmol/L的上下通用引物，1 μL DNA模板（30 ng/μL）。PCR反應(yīng)在Mastercycler gradient Mastercycler PCR擴增儀上進行，擴增程序為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，15 ℃保存。擴增結(jié)束后取8 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測其擴增結(jié)果。隨后將4 μL PCR擴增產(chǎn)物與T1載體連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌培養(yǎng)，采用OMEGA的質(zhì)粒DNA提取試劑盒，提取構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA，委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司廣州實驗室測序。

1.2.3 引物設(shè)計 將克隆獲得的駝孢銹菌序列通過軟件DNAStar5.0將兩端拼接在一起，并進行手動檢查和確認。于NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行同源性搜索。下載同源性較高的其它菌株序列利用DNAStar5.0進一步進行多重比較，于咖啡駝孢銹菌特異性區(qū)域參考引物設(shè)計原理設(shè)計引物。

1.2.4 特異性檢測 利用上述設(shè)計的特異引物，并以表1中各菌株DNA為模板并以滅菌ddH2O為陰性對照，進行PCR擴增，以檢測其特異性。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同1.2.2，PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 靈敏度檢測 將咖啡駝孢銹菌菌株基因組DNA濃度調(diào)整為10 ng/μL，按10的數(shù)量級逐步向下稀釋至10-5 ng/μL作為模板，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與1.2.2相同，PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6 田間疑似發(fā)病咖啡植株檢測 采集田間發(fā)病典型癥狀或疑似癥狀的咖啡植株葉葉片，切取病健交界處組織塊，采用CTAB法[14]提取發(fā)病組織和健康植株葉片的基因組DNA，以此基因組DNA（30 ng/μL）為模板，并以咖啡銹病菌重組質(zhì)粒DNA為陽性對照，利用所設(shè)計的引物對進行PCR擴增實驗。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同1.2.2，PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異引物的設(shè)計

咖啡駝孢銹菌Hv ITS基因序列與其它高同源性ITS序列的多重比對結(jié)果表明，咖啡駝孢銹菌ITS2區(qū)域為特異性區(qū)域（圖1），最終于該區(qū)域合適位點設(shè)計了1對咖啡駝孢銹菌的特異性引物Hv-ITS-F/R。具體而言，上游正向引物Hv-ITS-F序列：5′-GGTACACCTGTTTGAGAGTATG-3′；下游反向引物Hv-ITS-R序列：5′-CAAAATATGTCATA

CCTCTCATTCT-3′，其包含引物序列在內(nèi)的片段大小分別為396 bp。將設(shè)計的引物于NCBI網(wǎng)站中進行同源性搜索，結(jié)果無論是正向還是反向引物二者均僅與咖啡駝孢銹菌擁有100%的同源性。

2.2 引物特異性檢測

利用設(shè)計的特異性引物Hv-ITS-F/R對供試菌株（表1）的基因組DNA進行PCR擴增，以驗證引物的特異性。試驗結(jié)果與設(shè)計分析的相吻合，引物對Hv-ITS-F/R僅能從咖啡駝孢銹菌DNA中擴增出一條396 bp特異性條帶，測序比對后與咖啡駝孢銹菌ITS片段序列完全一致，而從其它菌株中均擴增不到任何條帶，表明引物對Hv-ITS-F/R可特異性地檢測咖啡駝孢銹菌（圖2）。

2.3 引物的靈敏性檢測

利用引物對Hv-ITS-F/R，以1 μL各濃度梯度咖啡駝孢銹菌DNA為模板，進行常規(guī)PCR；如圖3所示，當咖啡駝孢銹菌的DNA濃度大于或等于10 pg/μL時，利用引物對Hv-ITS-F/R可以特異性的擴增得到396 bp的DNA條帶，但當濃度小于10 pg/μL后，則擴增不到條帶，由此表明，該引物對可以檢測到咖啡駝孢銹菌基因組DNA濃度≥10 pg/μL。

2.4 咖啡田間疑似發(fā)病植株檢測

采用常規(guī)PCR對采集的咖啡植株進行檢測，檢測結(jié)果表明，以健康咖啡嫩葉基因組DNA為模板時，引物Hv-ITS-F/R檢測不出任何條帶；以發(fā)病咖啡植株基因組DNA為模板時，引物Hv-ITS-F/R能檢測出清晰條帶，即能穩(wěn)定地擴增出一條分子量約為396 bp的特異條帶（圖4）。由此表明，該引物可以應(yīng)用到咖啡駝孢銹菌檢測中。

3 討論

病原菌檢測的傳統(tǒng)方法需經(jīng)過發(fā)病癥狀觀察、分離病原菌、生物學(xué)性狀測定以及回接至寄主等環(huán)節(jié)，這些方法雖能起到一定的鑒別作用，但耗時費力且受人為及環(huán)境因素的影響極大。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子診斷學(xué)逐步解決了上述不足，并以其高效簡便的優(yōu)點被科研單位廣泛使用。據(jù)不完全統(tǒng)計，中國應(yīng)用PCR及其相關(guān)技術(shù)而檢測的植物病害達50余種[15-16]。該技術(shù)已經(jīng)在煙草、大豆、苜蓿疫霉菌（Pytophthora）[17-18]，松干銹菌（Puccinia）[19]，棉花黃萎病菌（Verticillium spp.）[20]，梨輪紋病菌和炭疽病菌[21]，甘蔗黑粉菌[22]等病原真菌鑒定、分類及系統(tǒng)發(fā)育等方面得到廣泛地應(yīng)用。其中，由于核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列具有種間高度變異及種內(nèi)穩(wěn)定保守的特點，此區(qū)域常常被用來設(shè)計特異性引物對，進而用于病原真菌的鑒別與分類[11，23]。本研究通過對咖啡駝孢銹菌ITS序列進行比對分析，于咖啡駝孢銹菌ITS特異性區(qū)域，設(shè)計一對特異性引物，依此建立了一套省時、準確、快速、簡便的PCR檢測方法。利用該特異引物，通過對咖啡駝孢銹菌、咖啡褐斑病菌、咖啡重寄生菌、咖啡炭疽菌以及不同屬其它菌基因組DNA進行PCR擴增。結(jié)果表明，此引物對只能從咖啡駝孢銹菌基因組DNA中擴增出約396 bp的特異條帶，對其它相似或相近的病原真菌則無擴增條帶。靈敏度試驗結(jié)果表明，在DNA水平上檢測濃度可達10 pg/μL。相比之下，與巢式PCR檢測琯溪蜜柚黑斑病病原菌[24]等文獻報導(dǎo)中的PCR靈敏度檢測一致。

自然界中，咖啡駝孢銹菌的夏孢子侵入葉片并經(jīng)過大約20 d后而致其發(fā)病[2]。通過本研究建立的咖啡銹菌快速分子檢測技術(shù)可以縮短對咖啡駝孢銹菌的鑒定時間，靈敏、快速地鑒定出咖啡駝孢銹菌，克服了傳統(tǒng)鑒定方法步驟繁瑣、鑒定周期長等問題。本檢測體系可以檢測到侵染濃度≥10 pg/μL的咖啡駝孢銹菌基因組DNA，并且能在田間疑似癥狀的咖啡植株葉片基因組DNA檢測出條帶，可以滿足一般的咖啡銹病病原菌預(yù)測及診斷，為咖啡駝孢銹菌的潛伏、發(fā)生、群體分布及消長動態(tài)提供可靠的監(jiān)測手段，進而為病害的防控措施提供參考依據(jù)。值得注意的，本研究建立的咖啡駝孢銹菌普通PCR檢測體系，仍然存在如靈敏度不夠高，以及診斷過程中需要PCR擴增儀等儀器設(shè)備，以致于在基層條件不是很完善的情況下或者是需要更加精準度的情況下推廣起來受到限制。由此可見，關(guān)于咖啡駝孢銹菌的早期檢測體系，還需要進一步研究精度更高的咖啡駝孢銹菌巢式PCR檢測體系，以及更適合基層，更加靈敏的LAMP檢測體系，以滿足不同層次的檢測技術(shù)需求。這也是本課題即將開展的工作。

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