藏藥臭蒿及其近緣種藥材的ITS2 DNA條形碼鑒別

任瑤瑤　江南屏　劉睿穎　宋良科　譚睿　顧健

[摘要] 臭蒿Artemisia hedinii有清熱涼血，退黃，消炎的功能，在藏藥中占有重要地位。蒿屬植物種類繁多，在青藏高原分布廣泛，且其外形較為相似，傳統(tǒng)鑒定方法難以準(zhǔn)確快速鑒定。文章以ITS2序列為DNA條形碼，建立了一種快速準(zhǔn)確鑒定臭蒿及其易混蒿屬藏藥植物的方法。從青藏高原采集蒿屬藏藥21個(gè)樣品，分別提取樣品DNA，對(duì)ITS2目標(biāo)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序，獲得其ITS2序列信息；并從GenBank上下載同屬序列11條；運(yùn)用MEGA 6.0對(duì)所有32條ITS2序列進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算種間種內(nèi)遺傳距離，構(gòu)建Neighbor Joining（NJ）系統(tǒng)進(jìn)化樹，并比較樣本ITS2序列間的二級(jí)結(jié)構(gòu)差異。結(jié)果顯示：臭蒿、牛尾蒿、黃花蒿、艾蒿的遺傳距離較近，但四者種間最小距離均遠(yuǎn)大于種內(nèi)最大距離，NJ樹顯示4種蒿屬植物種內(nèi)之間各單獨(dú)形成一個(gè)分支，ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)也顯示出差異。以ITS2序列作為DNA條形碼，可達(dá)到對(duì)臭蒿及其近緣蒿屬藏藥植物進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的識(shí)別和鑒定的目的，準(zhǔn)確地弄清物種之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的目的，為該屬藥用植物的質(zhì)量控制、安全用藥及合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 臭蒿； 藏藥； DNA條形碼； ITS2； 二級(jí)結(jié)構(gòu)； 鑒定； 資源利用

ITS2 sequence analysis and identification of medicinal Artemisia plants

REN Yaoyao1， JIANG Nanping1， LIU Ruiying1， SONG Liangke1， TAN Rui1*， GU Jian2*

（1. School of Life Science and Engineering， Southwest Jiaotong University， Chengdu 610031， China；

2. School of Pharmacy， Southwest University for Nationalities， Chengdu 610041， China）

[Abstract] Artemisia hedinii occupies an important position in the Tibetan medicine. Plants in Artemisia vary a lot and are widely distributed in the QinghaiTibet Plateau， many plants in Artemisia look similar， making traditional identification methods laborious. In this article， ITS2 sequences were used as DNA barcoding to identify four kinds of confusable Tibetan medicine plants in Artemisia， aiming to establish a rapid and accurate identification methods. Twentyone samples in Artemisia were collected from the QinghaiTibet Plateau， ITS2 sequence PCR amplification and sequencing were conducted after the extraction of DNA. Another 11 sequence downloaded from Genbank were added to the analysis. Genetic distance calculation and analysis， building Neighbor Joining （NJ） phylogenetic tree were conducted by MEGA 6.0， also comparison of secondary structures of ITS2 sequences among samples. A. hedinii， A. annua， A. dubia and A. argyi shared close genetic distance， but the maximum distance between the four species was much greater than the minimum distance within each species， NJ tree showed that the four species went to four separate branches， differences among secondary structures of ITS2 sequences also made it clear to identify these medical plants. It could be an accurate and rapid method for identification and recognition， as well as the evolutionary relationships between the species by using ITS2 sequence as DNA barcode for plants of Tibetan Artemisia. The study provides theoretical basis for quality control， medication safety and rational exploitation.

[Key words] Artemisia hedinii； Tibetan medicine； DNA barcode； ITS2； secondary structure； identification； resource utilization

藏藥是中華民族醫(yī)藥的一塊瑰寶，主要分布在青藏高原，藏藥植物資源種類繁多，其使用歷史悠久、療效確切、文化底蘊(yùn)深厚，引起了廣泛關(guān)注。我國蒿屬植物種類繁多，據(jù)《中國植物志》載：蒿屬植物全球約300 余種，我國有186 種，44 變種，遍布全國[1]。多種蒿屬植物具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，可供食用、藥用、防風(fēng)固沙等用途，且多為著名的藏藥，其根或全草入藥[23]。蒿屬藏藥植物的主要化學(xué)成分是揮發(fā)油、萜類、黃酮類、香豆素類、色原酮類等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蒿屬藏藥植物多具有清熱解毒、抗菌消炎、祛風(fēng)除濕、通經(jīng)活絡(luò)、活血、止血等功效 [48]。蒿屬藏藥在青藏高原分布廣泛，青藏高原東緣藏藥植物長期生存于高海拔、強(qiáng)輻射、大溫差、高寒缺氧、無染污的高原地理環(huán)境中，所含藥物的活性成分較高[9]，具有較高的藥用價(jià)值。

臭蒿Artemisia hedinii首見于《中國民族藥志》，藏藥名桑子那布，有清熱涼血，退黃，消炎的功能，主治“赤巴”病，急性黃疸性肝炎，膽囊炎等[10]，藏醫(yī)謂之上品，在藏藥中占有重要地位，在青海多作為牛尾蒿習(xí)用。牛尾蒿A. dubia Wall.為藏醫(yī)常用的藥材，藏藥名普爾芒那保，是菊科植物牛尾蒿和無毛牛尾蒿的干燥地上部分，主要分布于內(nèi)蒙古、四川、甘肅、云南和西藏等地。具有清熱解毒，殺蟲利濕的功效，用于蟲病，疫疽，皮膚病和咽喉疾病等的治療[1112]。黃花蒿A. annua，藏藥名克朗，全草味苦，具清熱解毒，涼血消腫，退虛熱，解暑，止血，治結(jié)核病潮熱、瘧疾、傷暑低熱無汗、浮腫，各種出血等[13]。

因形態(tài)上的相似，蒿屬藏藥材易被混淆，而臭蒿、牛尾蒿等蒿屬藥材在藏藥中占有較重要地位，因此對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定很有必要。DNA條形碼技術(shù)是通過測定植物DNA序列進(jìn)行比較來反映其遺傳差異，以進(jìn)行物種分類和鑒定[14]。ITS2 序列是位于nrITS 序列上5.8～26S核糖體DNA 的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，包含5.8S 和26S 兩端的保守區(qū)，該序列最早被應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育和物種的分類研究中[1517]，ITS2序列包含豐富的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)，可以用于物種鑒定，對(duì)植物有較高的鑒別能力[1820]。采集青藏高原的蒿屬藏藥臭蒿、黃花蒿、艾蒿、牛尾蒿為樣本，以ITS2序列作為DNA條形碼，對(duì)其進(jìn)行鑒定以弄清幾種蒿屬植物之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，以期建立一種快速準(zhǔn)確鑒定蒿屬藏藥的方法，這將對(duì)蒿屬藏藥的深入研究、資源保護(hù)和安全利用具有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值。

1 材料

從四川?。ò?、甘孜州）、青海、甘肅、西藏等地收集蒿屬藏藥植物或藥材樣品21份，其中臭蒿A. hedinii樣品13份，牛尾蒿A. dubia樣品3份，艾蒿A. argyi樣品3份，黃花蒿A. annua樣品2份，經(jīng)西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院宋良科副教授鑒定，保存于西南交通大學(xué)標(biāo)本室，樣本來源及其ITS2序列信息見表1。同時(shí)在GenBank數(shù)據(jù)庫中下載蒿屬植物ITS2序列11條（臭蒿樣品1條，牛尾蒿1條，艾蒿樣品3條，黃花蒿6條），ITS2序列信息見表2。

2 方法

2.1 樣品 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序 取藥材干重組織約30 mg，加入液氮充分碾磨，使用植物DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取總DNA。以樣品DNA作為模板，對(duì)ITS2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，正向引物ITS2F，5′ATGCGATACTTGGTGTGAAT3′；反向引物ITS3R，5′GACGCTTCTCCAGACTACAAT 3′。PCR反應(yīng)體系參照PCR反應(yīng)試劑盒（TaKaRa 寶生物工程大連有限公司）的說明。PCR反應(yīng)條件：①94 ℃變性5 min；②94 ℃變性30 s；③56 ℃退火30 s；④72 ℃延伸7 min；⑤重復(fù)上述步驟40次；⑥72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物送至北京梓熙生物科技有限公司進(jìn)行測序。

2.2 數(shù)據(jù)處理 采用 CodonCode Aligner 對(duì)所得序列峰圖進(jìn)行校對(duì)拼接，去除引物區(qū)和低質(zhì)量的序列，由基于隱馬爾可夫模型（HMMer）的注釋方法切除ITS2兩端的5.8S和28S區(qū)域，獲得標(biāo)準(zhǔn)的ITS2間隔區(qū)序列[21]。所有ITS2序列用MEGA 6.0比對(duì)[22]，分析種內(nèi)、種間的遺傳變異[23]、利用Wilcoxon雙樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，采用相似性搜索法（BLAST1）和最小距離法（nearest distance）考察ITS2序列的鑒定成功率，計(jì)算K2P（Kimura 2parameter）遺傳距離、構(gòu)建Neighbor Joining（NJ）系統(tǒng)進(jìn)化樹[24] ，根據(jù)Koetschan等[25]建立的ITS2數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站預(yù)測ITS2序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果

3.1 種內(nèi)種間的變異分析 臭蒿、牛尾蒿、艾蒿、黃花蒿ITS2序列長度均為225 bp、GC量54.2%～56.9%，平均GC量為55.3%，見表1。應(yīng)用MEGA 6.0軟件對(duì)樣品進(jìn)行多序列比對(duì)，比對(duì)后的序列長度為225 bp。MEGA 6.0分析顯示，13個(gè)不同來源的臭蒿樣品可分為4個(gè)序列類型，其中5個(gè)樣品為A1型，與KU366642相同，1個(gè)A2型，3個(gè)A3型，4個(gè)A4型；艾蒿、牛尾蒿、黃花蒿樣品分別僅有1個(gè)系列類型，種間最多23個(gè)變異位點(diǎn)，見圖1。

3.2 K2P遺傳距離分析 研究發(fā)現(xiàn)物種間種內(nèi)距離越小、種間距離越大越適合條形碼鑒定[16]。利用MEGA 6.0軟件計(jì)算臭蒿、牛尾蒿、黃花蒿、艾蒿種內(nèi)和種間遺傳距離，見表3。結(jié)果可以看出，臭蒿、牛尾蒿、黃花蒿、艾蒿種內(nèi)種最大遺傳距離為0～0.004，種間最小遺傳距離為0.023～0.062，種間最小距離均遠(yuǎn)大于種內(nèi)最大距離，利用ITS2序列作為條形碼可將四者區(qū)分開。

3.3 NJ樹分析 根據(jù)ITS2序列對(duì)所有樣本構(gòu)建NJ系統(tǒng)聚類樹，見圖2，利用bootstrap 1 000次檢驗(yàn)各分支的置信度。從NJ進(jìn)化樹圖可以看出，臭蒿、牛尾蒿、黃花蒿、艾蒿各樣本種內(nèi)之間各單獨(dú)形成一個(gè)分支。牛尾蒿與艾蒿與臭蒿親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，臭蒿和黃花蒿的親緣關(guān)系較近，在NJ樹上聚為一大支，但分支之間bootstrap置信度在70%以上，物種之間可明顯區(qū)分開。3.4 ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析 根據(jù)Koetschan等建立的ITS2數(shù)據(jù)庫及其網(wǎng)站預(yù)測的臭蒿、牛尾蒿、艾蒿、黃花蒿ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)見圖3，從樣本的二級(jí)結(jié)構(gòu)中可以看出臭蒿、牛尾蒿、艾蒿、黃花蒿的ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)較為相似，均為一個(gè)中心環(huán)（主環(huán)）及4個(gè)螺旋區(qū)（helix）組成，每個(gè)螺旋上又有大小不同數(shù)目各異的莖環(huán)（loop）結(jié)構(gòu)。艾蒿在螺旋Ⅲ區(qū)上莖環(huán)（loop）數(shù)量不同，在中部位置多出1個(gè)莖環(huán)，Ⅰ區(qū)頸環(huán)結(jié)構(gòu)也有不同。牛尾蒿ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)在Ⅲ區(qū)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)較其他三者明顯不同。臭蒿與黃花蒿ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)極為相似，從結(jié)構(gòu)上無法將臭蒿與黃花蒿區(qū)分開，但結(jié)合K2P遺傳距離和NJ樹可將二者區(qū)分。

4 結(jié)論

蒿屬植物在青藏高原分布相對(duì)豐富，其藥用價(jià)值也較高，是我國藏藥植物的主要類群。近年來隨著以不可持續(xù)的方式進(jìn)行的亂采濫挖，許多有較高藥用價(jià)值的蒿屬藏藥植物的種群數(shù)量急劇減少[2627]。對(duì)實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行鑒定可以有效保證研究的科學(xué)性，使分離出新化合物或發(fā)現(xiàn)具有獨(dú)特藥理活性的成分或毒性成分等結(jié)果更加可靠，避免因物種問題造成結(jié)論錯(cuò)誤或無法重復(fù)等現(xiàn)象發(fā)生[28]。因此蒿屬藏藥資源的快速準(zhǔn)確地識(shí)別和鑒定，無疑對(duì)蒿屬藥材的安全使用使用和蒿屬藏藥資源的合理開發(fā)及保護(hù)都十分必要。

ITS2 序列對(duì)植物具有良好的擴(kuò)增成功率和物種水平的鑒定成功率[30]，以ITS2 序列作為DNA條形碼對(duì)蒿屬植物的鑒定進(jìn)行研究可以達(dá)到即快速又準(zhǔn)確。結(jié)果顯示ITS2 序列對(duì)蒿屬植物臭蒿、牛尾蒿、黃花蒿、艾蒿具有較好的鑒定效果。無論從臭蒿及其近緣蒿屬藥材種內(nèi)、種間遺傳距離，還是基于ITS2條形碼序列構(gòu)建的NJ樹，均證實(shí)ITS2條形碼序列能夠準(zhǔn)確鑒別臭蒿及其蒿屬近緣種藥材。四者ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)差異較小，特別是臭蒿和黃花蒿極為相似，但結(jié)合遺傳距離和NJ樹仍可將二者區(qū)分開。分析不同地域的臭蒿樣品ITS2序列發(fā)現(xiàn)，臭蒿樣品的ITS2序列信息變化與其產(chǎn)地的不同并無關(guān)聯(lián)。因樣品采集數(shù)量有限，不能發(fā)現(xiàn)臭蒿樣品的ITS2序列信息與產(chǎn)地和海拔之間的關(guān)系，或是不同產(chǎn)地和不同海拔臭蒿之間的進(jìn)化關(guān)系。今后的研究中將著重研究資源的種型分布與地域、海拔以及相關(guān)環(huán)境之間的關(guān)系以及不同地域之間的植物資源進(jìn)化關(guān)系，為藥物資源的開發(fā)和保護(hù)提出新的思路和方法。

臭蒿作為具有清熱涼血、退黃、消炎作用的藏藥在青藏高原地區(qū)經(jīng)常與同為藏藥的蒿屬藥材牛尾蒿混用，但牛尾蒿主要用于清熱解毒、殺蟲利濕、蟲病、疫疽以及皮膚病和咽喉疾病，二者藥效和功能都相差較遠(yuǎn)，且研究表明二者化學(xué)成分也有較大差異[30]，因此為臭蒿和牛尾蒿在藏藥使用中應(yīng)準(zhǔn)確區(qū)分，建立快速識(shí)別和鑒定臭蒿藥材及其他因與其外形相似的蒿屬藏藥材對(duì)藏藥的正確、安全使用具有極大意義。辛天怡等[31]將二維DNA條形碼應(yīng)用于中藥材鑒定，對(duì)中藥材流通的數(shù)字化監(jiān)管的思路可借鑒到對(duì)藏藥資源的監(jiān)管中，特別是對(duì)某些易混藏藥材以及民間錯(cuò)誤使用的藏藥材進(jìn)行引導(dǎo)規(guī)范，對(duì)藏藥材的質(zhì)量監(jiān)督和安全使用具有積極意義。同時(shí)建立藏藥材和傳統(tǒng)中藥材的二維DNA條形碼，可進(jìn)一步研究藏藥材和傳統(tǒng)中藥材的區(qū)別與聯(lián)系，對(duì)比藏醫(yī)和傳統(tǒng)中醫(yī)的用藥習(xí)慣，深化藏醫(yī)和傳統(tǒng)中醫(yī)的交融。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]