舌下含服粉塵螨滴劑脫敏治療對特應(yīng)性皮炎患者中輔助性T細胞作用的研究

曾美李慶祥 黃文富 陳俊釗 劉金花 王翠彥

舌下含服粉塵螨滴劑脫敏治療對特應(yīng)性皮炎患者中輔助性T細胞作用的研究

曾美★李慶祥 黃文富 陳俊釗 劉金花 王翠彥

目的 探討舌下含服粉塵螨滴劑脫敏治療對特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）患者輔助性T細胞（T helper cells，Th）的作用。方法 用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）方法檢測AD患者舌下含服粉塵螨滴劑組（sublingual immunotherapy，SLIT組）和對照組治療前后的外周血Th1（IFN-γ）、Th2（IL-4）、Th17（IL-17）的水平，用流式細胞技術(shù)檢測兩組治療前后的調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg）數(shù)量。然后用兩獨立樣本t或校正t（t’）檢驗對兩組患者治療前和治療后的組內(nèi)以及治療后組間的IFN-γ、IL-4、IL-17和Treg水平分別進行對比研究。結(jié)果 SLIT組治療后IL-4、IL-17較治療前明顯下降，IFN-γ和Treg較治療前明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。且SLIT組治療后較對照組治療后IL-4、IL-17下降更明顯，IFN-γ升高更明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。SLIT組治療后Treg細胞數(shù)量較對照組治療后升高更多，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論 在AD患者中，舌下含服粉塵螨滴劑治療能降低其外周血IL-4、IL-17，升高IFN-γ和Treg水平而達到治療的目的。

特應(yīng)性皮炎；輔助性T細胞；粉塵螨滴劑；調(diào)節(jié)性T細胞

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種慢性、瘙癢性、復(fù)發(fā)性的炎癥性皮膚病。既往有研究表明輔助性T細胞（T helper cells，Th）參與了AD的發(fā)病［1-3］。輔助性T細胞根據(jù)釋放細胞因子不同可分為不同的亞型：Th1、Th2、調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg）和Th17。

粉塵螨是誘發(fā)AD的重要變應(yīng)原之一，已有學者研究顯示在AD同類疾病過敏性鼻炎患者中粉塵螨是最重要過敏原［4］。舌下含服粉塵螨滴劑在過敏性疾病中的安全性和有效性已被大量學者研究證實［5-7］。但在特應(yīng)性皮炎患者中，舌下含服粉塵螨滴劑的免疫學機制尚不明確，其對Th細胞的影響亦未見文獻報道［8］。本文擬通過以下研究以探討舌下含服粉塵螨滴劑對AD患者輔助性T細胞的影響，從而更好地指導(dǎo)臨床治療。

1 對象和方法

1.1 研究對象

所選病例為2015年2月至2016年4月就診于我院皮膚科門診的AD患者52例。其中男24例，女28例。入選標準：①符合Hanifin和Rajka診斷標準［9］；②年齡4歲以上；③患者本人或兒童的監(jiān)護人同意參加實驗（簽署知情同意書）；④過敏原檢測（皮膚點刺試驗）顯示粉塵螨陽性，粉塵螨點刺（++）以上，且為單一粉塵螨陽性或屋塵螨、粉塵螨均陽性。排除標準：①入選前2周內(nèi)有局部外用藥物史者；②入選前2周內(nèi)有口服抗阻胺藥物史者；③患有系統(tǒng)性疾病者；④有系統(tǒng)使用免疫抑制劑及糖皮質(zhì)激素史者；⑤孕婦或哺乳期婦女。采用隨機雙盲對照的方法將52例AD患者分為舌下含服粉塵螨滴劑組（sublingual immunotherapy，SLIT組）和對照組，每組26例。SLIT組：男11例，女15例，年齡4～52歲，平均年齡27.5歲；對照組男13例，女13例，年齡5～55歲，平均年齡29.1歲。兩組患者年齡性別差異均無統(tǒng)計學意義。兩組患者治療前均進行SCORAD（Scoring Atopic Dermatitis）［10］積分，SLIT組（31.34±7.12）分，對照組（33.56±8.69）分，兩組治療前基線差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本次倫理由惠州市中心人民醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2 儀器試劑和試驗藥物

儀器：全自動酶標儀芬蘭產(chǎn)Multiskan MK3型、全自動洗板機芬蘭產(chǎn)wenwash-4 MK2型（芬蘭雷勃），流式細胞儀BD FACSCantoTMⅡ（BD公司，美國）。

試劑：人白介素4（interleukin-4，IL-4）、人干擾素（interferon-γ，lFN-γ）、人白介素17（interleukin-17，IL-17）、ELISA試劑盒均由武漢華美生物工程有限公司進口分裝自美國CUSABIO公司。CD3 （FITC-A）、CD45（PerCP-A）、CD4（APC-A）、CD25 （PE-Cy7-A）以及不同熒光標記的同型對照均購自美國BD公司。

試驗藥物：粉塵螨滴劑（浙江我武生物科技股份有限公司），鹽酸西替利嗪分散片（宜昌長江藥業(yè)有限公司），糠酸莫米松乳膏（上海先靈葆雅制藥有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 治療方法

對照組僅給予口服鹽酸西替利嗪分散片及外用糠酸莫米松乳膏治療，SLIT組在給予口服鹽酸西替利嗪分散片及外用糠酸莫米松乳膏治療的同時，給予粉塵螨滴劑舌下含服脫敏治療，治療時間半年。SLIT組脫敏治療分為遞增期和維持期，治療疫苗使用粉塵螨滴劑。遞增期1～3周，第1～3周分別服用粉塵螨滴劑1號（1 μg/mL）、2號（10 μg/ mL）和3號（100 μg/mL），1～3號從第1天到第7天服用劑量分別為1、2、3、4、6、8、10滴；第4周開始，兒童患者使用4號（333 μg/mL）維持，qd，每次3滴。14歲及以上患者從第6周開始使用5號（1 000 μg/mL）維持，qd，每次2滴，直至療程結(jié)束。服用方法：滴于舌下含1～3 min后吞咽，每天固定時間服用1次。

1.3.2 療效判定標準

有效率采用SCORAD計分系統(tǒng)［10］，評價患者的病情嚴重程度。通過計算評分下降指數(shù)來評價療效。評分下降指數(shù)=［（治療前SCORAD積分-治療后SCORAD積分）／治療前SCORAD積分］×100%。評分下降指數(shù)≥90%為痊愈，評分下降指數(shù)60%～89%為顯效，評分下降指數(shù)20%～59%為好轉(zhuǎn)，評分下降指數(shù)≤19%為無效。總有效率=［（痊愈+顯效）/總例數(shù)］× 100%［10］。

1.3.3 ELISA方法

每位患者治療前和治療后各抽取靜脈血5 mL室溫下靜置2 h，3 000 r/min離心15 min，分離血清于凍存管中-80℃冰箱保存。IL-4、IFN-r、IL-17用ELISA法按說明書步驟檢測。

1.3.4 流式細胞技術(shù)

外周血CD4+CD25+Treg的檢測：取EDTA抗凝血100 μL置于FCM測量管中，加入鼠抗人單克隆抗體CD3（FITC-A）、CD45（PerCP-A）、CD4（APCA）、CD25（PE-Cy7-A）各10 μL，充分混勻，在4℃冰箱中反應(yīng)30 min。FACS洗滌液（含0.5%BSA，0.01%疊氮鈉的PBS）洗滌2次，1 000 r/min離心3 min。再加入2 mL紅細胞裂解液，充分混勻，4℃冰箱中反應(yīng)10 min，直至細胞懸液變成真性溶液，1 000 r/min離心3 min。FACS洗滌液洗滌2次。1%多聚甲醛500 μL重懸固定，F(xiàn)ACSAria流式細胞儀檢測，BD FACS專用FACSDIVA軟件分析。設(shè)有mIgG-CD25同型對照。前向散射光（forward scatter，F(xiàn)SC）和CD45以淋巴細胞群設(shè)門，測定SLIT組和對照組CD4+CD25+細胞占CD3+細胞的百分率。

1.4 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)用SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析，顯著性檢驗水平為α=0.05。計量資料以±s表示，兩獨立樣本的比較，服從正態(tài)分布者用t或校正t（t′）檢驗。兩組間有效率比較采用卡方檢驗。

2 結(jié)果

2.1 臨床療效結(jié)果

治療半年后，SLIT組有效率為61.54%，對照組有效率為23.07%，SLIT組有效率明顯高對于對照組，有統(tǒng)計學差異（χ2=7.87，P=0.005），見表1。

表1 SLIT組和對照組療效的比較Table 1 The comparison of curative effect between the SLIT group and the control one

2.2 IL-4、IFN-γ、IL-17及Treg的結(jié)果

SLIT組及對照組IL-4水平治療后較治療前均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。且兩組治療后相比：SLIT組較對照組降低更明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。SLIT組及對照組IFN-γ水平治療后較治療前明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），且兩組治療后相比，SLIT組較對照組升高更明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），詳見表2。

表2 SLIT組和對照組治療前后IL-4、IFN-γ的比較Table 2 The comparison of IL-4 and IFN-γ before and after treatment in the SLIT group and the control one

SLIT組IL-17水平治療后較治療前明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。SLIT組IL-17水平治療后較治療前明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），對照組IL-17水平治療后較治療前有所下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P= 0.299）。兩組治療后相比，SLIT組IL-17水平較對照組降低更明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P= 0.001）。CD3+CD4+CD25+Treg細胞：SLIT組治療前為（3.51±1.09）%；治療后為（5.32±1.27）%。治療后較治療前明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（t=-3.94，P＜0.01）。對照組治療前為（3.62± 1.49）%；治療后為（4.78±1.56）%。治療后比治療前有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義（t=-1.694，P=0.108）。兩組治療后相比：SLIT組較對照組升高更明顯，但差異無統(tǒng)計學意義（t=0.829，P= 0.418），詳見表3、圖1。

表3 SLIT組和對照組治療前后IL-17、Treg的比較Table 3 The comparison of IL-17 and Treg before and after treatment in the SLIT group and the control one

圖1 AD患者外周血CD3+CD4+CD25+Treg的流式結(jié)果Figure 1 The results of flow cytometry about CD3+CD4+CD25+Treg in peripheral blood of AD patients

3 討論

特應(yīng)性皮炎是一種復(fù)發(fā)性的以嚴重瘙癢為主要臨床表現(xiàn)的慢性過敏性皮膚病，其病因復(fù)雜，涉及多個方面，免疫和變態(tài)反應(yīng)是其中兩個重要的方面。既往研究表明，Th細胞參與了特應(yīng)性皮炎的發(fā)?。?1］。Th細胞是根據(jù)功能分類的T細胞亞群，對機體的特異性免疫和非特異性免疫均具有重要調(diào)節(jié)作用。據(jù)其分泌細胞因子的不同可分為Th1、Th2、Th17、Treg等亞型。IFN-γ、IL-4分別是Th1、Th2細胞的特征性細胞因子［12］。Th17和Treg 是Th細胞的兩個新亞型，是目前研究的熱點。它們在免疫應(yīng)答、自身免疫性疾病的發(fā)生中發(fā)揮著重要的意義。既往研究發(fā)現(xiàn)，在特應(yīng)性皮炎患者中，存在Th1/Th2［3］及Th17/Treg［13］的失衡。

SLIT是一種安全、有效的免疫治療方法［14-15］。在我國，標準化的塵螨變應(yīng)原疫苗粉塵螨滴劑也于2006年被CFDA批準上市，舌下含服粉塵螨滴劑在特應(yīng)性皮炎中的安全性和有效性已被大量學者研究證實［5-7］，本研究結(jié)果同樣顯示SLIT組有效率明顯高對于對照組。但是其有效性的免疫學機制尚不完全清楚。本研究中采用舌下含服粉塵螨滴劑，濃度從低到高逐漸增加進行特異性脫敏治療，即通過抗原反復(fù)刺激機體從而增強機體對抗原的適應(yīng)性，使機體產(chǎn)生免疫耐受，從而達到不發(fā)生或發(fā)生輕微過敏癥狀的目的。Allam［16］認為SLIT的作用機制可能是通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞活化、調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞亞群的平衡、誘導(dǎo)阻斷性IgG4抗體產(chǎn)生并抑制IgE的合成來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，從而使患者對特異性變應(yīng)原產(chǎn)生長期耐受。本文研究發(fā)現(xiàn)，SLIT組治療后IL-4、IL-17較治療前明顯下降，IFN-γ和Treg較治療前明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。且SLIT組治療后較對照組治療后IL-4、IL-17下降更明顯，IFN-γ升高更明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Potter等［17］在變應(yīng)性鼻炎患者中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SLIT治療后，能引起外周血IL-4水平下降和IFN-γ水平升高。SLIT治療可能通過降低外周血Th2水平，升高Th1水平，使Th1/Th2平衡恢復(fù)，而達到治療的目的。近幾年國內(nèi)外大量研究得出，在AD患者皮損中和外周血單核細胞中能檢測到IL-17，并發(fā)現(xiàn)其水平與AD病情嚴重程度相關(guān)［18-19］，而同時檢測AD患者血漿中Th17細胞的數(shù)量明顯升高。本研究發(fā)現(xiàn)SLIT治療后可使IL-17水平下降，與Tian等［20］在兒童哮喘患者中經(jīng)SLIT治療后對IL-17的影響結(jié)果一致。我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)AD患者外周血中Treg數(shù)量下降參與了AD的發(fā)?。?1］。本研究中SLIT組治療后Treg細胞數(shù)量較對照組治療后升高更多，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），可能與樣本量較小有關(guān)。Stelmaszczyk等［22］同樣發(fā)現(xiàn)在患者特應(yīng)性皮炎等過敏性疾病的兒童患者中，經(jīng)變應(yīng)原特異性免疫治療后其Treg水平會升高。故在特應(yīng)性皮炎患者中，舌下含服粉塵螨滴劑能降低其外周血IL-4、IL-17水平，升高IFN-γ和Treg水平，從而促進Th1/Th2、Treg/Th17平衡的恢復(fù)，而達到治療的目的。

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The role on the T helper cells of sublingual immunotherapy for atopic dermatitis

ZENG Mei★，LI Qingxiang，HUANG Wenfu，CHEN Junzhao，LIU Jinhua，WANG Cuiyan
（Department of Dermatology，Huizhou municipal central Hospital，Huizhou，Guangdong，China，516000）

Objective To explore the role on the T helper cells（Th）in sublingual immunotherapy (SLIT)with standardized dermatophagoides farinae drops on patients with atopic dermatitis(AD). Methods Between the two AD groups before and after treatment:sublingual immunotherapy with standardized dermatophagoides farinae drops(SLIT group)and control one,serum concentrations of Th1（IFN-γ）、Th2(IL-4)、Th17（IL-17）were evaluated using enzyme-linked immuno sorbent assay(ELISA).The levels of CD4+CD25+Treg cells in peripheral blood were assessed by flow cytometry.Then the IFN-γ,IL-4,IL-17 and Treg levels were compared between the two groups before and after treatment,as well as between the groups after treatment with two independent samples t or corrected t(t')test. Results IL-17 and IL-4 in the SLIT group were significantly decreased after treatment versus before treatment,IFN-γ and Treg were significantly higher after treatment than before treatment as well,and the differences were significant(P＜0.05).Compared with the SLIT group and the control group after treatment,IL-17 and IL-4 decreased more significantly,IFN-γ increased more significantly,the difference was statistically significant(P＜0.05).After treatment,the number of Treg cells in SLIT group was higher than that in the control group,but the difference was not statistically significant(P＞0.05). Conclusion SLIT in patients with atopic dermatitis(AD)can reduce the level of IL-4,IL-17 in the peripheral blood and increase the level of IFN-γ and Treg,then finally achieve the purpose of treatment.

Atopic dermatitis;T helper cells;Dermatophagoides farinae drops;Regulatory T cells

惠州市中心人民醫(yī)院皮膚科，廣東，惠州516000

★通訊作者：曾美，E-mail：251872857@qq.com