人腸道病毒D68型在兒童急性呼吸道感染中的臨床特征與分子生物學(xué)特征分析

郝金斗 李明珠 劉培輝

人腸道病毒D68型在兒童急性呼吸道感染中的臨床特征與分子生物學(xué)特征分析

郝金斗 李明珠 劉培輝★

目的 了解人腸病毒D68（EV-D68）在兒童急性呼吸道感染（acute respiratory tract infection，ARTI）中的臨床特征及分子流行病學(xué)特征。 方法 采集2014年3月至2016年3月年深圳市婦幼保健院住院及門診年齡1月至14歲符合急性呼吸道感染（ARTI）患兒共13 472份咽拭子分泌物，使用EV通用核酸試劑盒進(jìn)行腸道病毒檢測(cè)，EV病毒通用核酸陽(yáng)性標(biāo)本通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增并測(cè)序分型。 結(jié)果 在13 472份鼻咽部拭子標(biāo)本中，EV陽(yáng)性病例1 222例，陽(yáng)性率為9.10%，EV-D68感染患兒7例，陽(yáng)性率0.05%，其VP1擴(kuò)增序列分離的5株D68均與進(jìn)化簇1病毒序列具有高同源性，2例與進(jìn)化簇2有高同源性。 結(jié)論 EV-D68可能是急性呼吸道感染的一種新的主要病原體，感染高峰季節(jié)可能在秋冬季節(jié)，以急性下呼吸道感染（acute lower respiratory tract infections，ALRTI）為主要表現(xiàn)。

腸道病毒；急性呼吸道感染；腸道病毒D68

人類腸道病毒（human enterovirus，HEV）屬小RNA病毒科腸道病毒屬，可分為脊髓灰質(zhì)炎病毒、?？刹《?、柯薩奇病毒和新型腸道病毒。目前基于對(duì)VP1基因序列的進(jìn)化研究，又可分為EV-A、 EV-B、EV-C、EV-D4組［1］。近年來(lái)，腸道病毒尤其新型腸道病毒引起的急性呼吸道感染越來(lái)越引起關(guān)注，有研究表明在病因明確的上呼吸道感染疾病中，大約15%由HEV感染造成，其中腸道病毒D68型（EV-D68）是最主要型別［2-3］。EV-D68為正向單鏈RNA病毒，與D70、D94、D111、D120同屬于EV-D組。1962年，EV-D68首次被分離發(fā)現(xiàn)，2014年在美國(guó)的密蘇里州和伊利諾伊州引起嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)病例，并引發(fā)全國(guó)范圍內(nèi)的流行［4］。

在開展新型腸道病毒在急性呼吸道感染的研究中，我們發(fā)現(xiàn)了EV-68感染的急性呼吸道感染兒童，總結(jié)其臨床特點(diǎn)及分子生物學(xué)特征如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2014年3月至2016年3月年深圳市婦幼保健院住院及門診年齡1月至14歲符合急性呼吸道感染（acute respiratory tract infection，ARTI）患兒13 472例作為研究對(duì)象，性別不限。ARTI包括上呼吸道感染及下呼吸道感染。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近3月反復(fù)呼吸道感染或免疫缺陷者；②病程≥7 d。急性呼吸道感染診斷標(biāo)準(zhǔn)及疾病譜按照第八版《褚福棠實(shí)用兒科學(xué)》［5］。

1.2 標(biāo)本與病例信息采集

（1）咽拭子標(biāo)本采集：入院48 h內(nèi)，常規(guī)消毒后通過(guò)抽吸器取患兒的鼻咽深部分泌物，采集后置入-20℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。?）在采集符合標(biāo)準(zhǔn)的住院兒童呼吸道標(biāo)本后，醫(yī)生或護(hù)士使用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)問(wèn)卷，收集病例的基本人口統(tǒng)計(jì)學(xué)信息、臨床癥狀、體征、血常規(guī)、臨床生化檢查、細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果、影像學(xué)檢查、主要診斷、治療和預(yù)后等信息。采用EpiData3.0軟件錄入相關(guān)數(shù)據(jù)，建立數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3 研究方法

使用EV通用核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎㄖ猩酱髮W(xué)達(dá)安基因股份有限公司）由深圳市婦幼保健院檢驗(yàn)科對(duì)所采集標(biāo)本統(tǒng)一檢測(cè)。EV病毒通用核酸陽(yáng)性標(biāo)本統(tǒng)一由廣州云諾生物公司進(jìn)一步測(cè)序分型。方法采用傳統(tǒng)RT-PCR和測(cè)序。RTPCR采用222：5′-CICCIGGIGGIAYRWACAT-3’和292：5’-MIGCIGYIGARACNGG-3′引物［7］，擴(kuò)增VP1基因部分片段，長(zhǎng)度為358 bp。產(chǎn)物以Sanger法測(cè)序后，所得序列以BLAST工具在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列對(duì)比分析得到分型結(jié)果。

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析

測(cè)序所得核苷酸VP1部分序列使用BioEdit程序進(jìn)行比對(duì)，系統(tǒng)進(jìn)化樹由MEGA程序（Version6.0）構(gòu)建。采用neighbor-joining方法，bootstrap值為1 000［8］。

圖1 7例EV-D68部分VP1基因序列測(cè)序結(jié)果與Fermon原型株及國(guó)內(nèi)分離株的的比對(duì)Figure 1 Partial VP1 gene from the seven EV-D68 were compared with EV-D68 isolated from China（Shenzhen and Beijing）and the original Strain Fermon

圖2 7例分離株VP1部分基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析圖Figure 2 Phylogenetic analysis of partial VP1 gene sequence of enterovirus D68 isolated from the seven samples

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用EpiData3.0軟件錄入相關(guān)數(shù)據(jù)，建立數(shù)據(jù)庫(kù)。

2 結(jié)果

2.1 EV檢測(cè)及EV-D68的鑒別

在13 472份鼻咽部拭子標(biāo)本中，EV陽(yáng)性病例1 222例，陽(yáng)性率為9.10%，發(fā)現(xiàn)EV-D68感染患兒7例，陽(yáng)性率0.05%，7例EV-D68病例其VP1擴(kuò)增序列與Fermon原型株及國(guó)內(nèi)分離株的比對(duì)情況見(jiàn)圖1所示。本次研究分離到的VP1序列基本與2015年所報(bào)道的深圳分離株序列一致，與Fermon株序列有較多差異。

2.2 EV-D68的系統(tǒng)進(jìn)化分析

此前已有研究者對(duì)EV-D68進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，并分為群1、2、3三個(gè)進(jìn)化簇，如圖2所示。此次分離的7株D68中5株與進(jìn)化簇1病毒序列具有更高同源性，2株與進(jìn)化簇3有更高同源性。

2.3 臨床特征及流行病學(xué)分析

7例EV-D68感染患者均系住院病人，男女比例4∶3，發(fā)病年齡7月～6歲1月，中位數(shù)年齡2歲6月，主要癥狀包括：咳嗽伴喘息（3例）、咳嗽伴腹瀉（2例）、發(fā)熱伴喘息（1例）、咳嗽（1例）；上呼吸道感染2例（喘息性支氣管炎及急性支氣管炎各1例），下呼吸道感染5例（肺炎4例，毛細(xì)支氣管炎1例）。2014 年9月及10月各1例，2014年11月2例，2015年10月及12月2016年1月各發(fā)現(xiàn)1例。由于感染例數(shù)有限，不足以做臨床特征的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 討論

EV-D68是1962年在美國(guó)加尼福尼亞發(fā)現(xiàn)的一種腸道病毒，2014年在美國(guó)及加拿大引起嚴(yán)重呼吸道疾病的爆發(fā)，從而引起人們關(guān)注。美國(guó)疾病預(yù)防控制中心當(dāng)年共計(jì)檢測(cè)2 600個(gè)標(biāo)本，其中36%測(cè)試為EV-D68陽(yáng)性，所有確診感染病例均為兒童，共計(jì)14例死亡病例報(bào)告，但目前仍不確定病毒的致病途徑［9］。此后，歐洲、亞洲等國(guó)家均有EV-D68的病例報(bào)道［10-13］。根據(jù)病毒流行情況及研究人群不同，在流行爆發(fā)區(qū)域收集的呼吸道樣本中EV-D68陽(yáng)性率可達(dá)44%［4］。國(guó)內(nèi)目前報(bào)道的EV-D68陽(yáng)性率在0.2%～1%［14-15］。有研究［14］發(fā)現(xiàn)在北京7 945份咽拭子標(biāo)本中腸道病毒陽(yáng)性率6.99%（555/7 945），EVD68陽(yáng)性率0.2%（12/7 945）。本研究發(fā)現(xiàn)腸道病毒陽(yáng)性率9.1%（1 222/13 472），EV-D68陽(yáng)性率0.05% （7/13 472），EV-D68陽(yáng)性率較北京地區(qū)的研究結(jié)果低，可能與地區(qū)差異氣候、研究對(duì)象不同及標(biāo)本來(lái)源不同有關(guān)。EV-D68引起的急性呼吸道感染表現(xiàn)不同，既可以引起輕微的呼吸道感染，也可以引起嚴(yán)重的呼吸道感染，甚至死亡。在本研究中7例患者均表現(xiàn)為咳嗽、喘息，以下呼吸道感染多見(jiàn)，與既往報(bào)道一致［4，15］。但是由于EV-D68陽(yáng)性病例少，其感染與臨床特征之間的關(guān)系還需進(jìn)一步研究。Xiao等［15］研究也發(fā)現(xiàn)2014年9～10月重慶EVD68感染較前增多，本研究7例EV-D68患者均在發(fā)生秋冬季節(jié)，2014年美國(guó)EV-68爆發(fā)流行在9～10月份［4］，與本研究結(jié)果一致，提示秋冬季節(jié)可能是EV-D68感染高峰季節(jié)。雖然目前研究EV-D68感染率低，但還需要長(zhǎng)時(shí)間檢測(cè)人群中EV-D68的流行特征，以應(yīng)對(duì)其可能流行爆發(fā)情況。

本次鑒別出的5例EV-D68病毒VP1區(qū)域基因序列與2015年度在深圳市疾病控制中心分離到的病毒株［17］具有高度同源性（94%～96%），同屬于EV-D68病毒進(jìn)化樹中的進(jìn)化簇1；2014年檢出2例序列同屬于病毒進(jìn)化樹種的群3，與美國(guó)2014年分離株大多數(shù)屬于進(jìn)化簇3在基因組上具有高度同源性，同源性為89%～91%，提示可能與美國(guó)EV-D68的流行有關(guān)。深圳市EV-D68目前感染率低，仍處于散發(fā)，但是該病毒的進(jìn)化和變異明顯，且在國(guó)外曾形成局部爆發(fā)流行，需進(jìn)一步研究。但本研究由于樣本例數(shù)和臨床信息有限，不足做回顧性研究。還需進(jìn)一步收集多中心更多樣本的研究，包括不同年度樣本、樣本完整臨床信息、病例臨床癥狀及嚴(yán)重程度，以更好地掌握EV-D68的感染季節(jié)規(guī)律，以及不同基因譜的毒株與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

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The clinical and molecular characterizations of enterovirus D68 among children with acute respiratory infection

HAO Jindou，LI Mingzhu，LIU Peihui★
（Shenzhen maternity and children's hospital affiliated Southern medical university，Shenzhen，Guangdong，China，518028）

Objective To explore the clinical and molecular epidemiological characteristics of children with enterovirus D68 in acute respiratory tract infection(ARTI). Methods 13 472 cases which were diagnosed with acute respiratory tract infection in the outpatient and ward from March 2014 to March 2016 were screened for enterovirus(EV).The EV positive cases of enterovirus were collected to identify the types of enterovirus by RT-PCR and sequencing. Results 1 222 EV positive cases were found in 13 472 nasopharyngeal swab specimens,the positive rate was 9.10%;and 7 EV-D68 infection were detected,the positive rate was 0.05%.Compared to the Fermon prototype strain of the VP1 sequence,5 strains of EV-D68 have higher homology with group 1 virus sequence,while 2 with group 2 virus sequence. Conclusions EVD68 may be a new predominant pathogen in acute lower respiratory tract infection(ARTI).The infection peak season may be in autumn and winter season.ALRTI may be a clinical feature of EV-D68 infection.

Enterovirus;Acute respiratory infection;EV-D68

深圳市科創(chuàng)委項(xiàng)目資助（深圳市新型HEVs在小兒ARTI中的臨床及分子流行病學(xué)特征）（JCYJ20140414145619894）

南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院，廣東，深圳518028

★通訊作者：劉培輝，E-mail：lph521521@126.com