高效液相色譜法測定復(fù)方雙花利咽合劑中綠原酸的含量

周穎

摘 要：本文采用高校液相測定了復(fù)方雙花利咽合劑中綠原酸的含量，固定相為：安捷倫Cl8（4.6mm×250mm，5um），甲醇-乙腈-4%磷酸水（2：10∶88）為流動(dòng)相，檢測波長為327nm，流速1.0mL·min-1，柱溫：30℃。綠原酸在5～80μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。綠原酸的平均回收率為99.3%，RSD為0.83%（n=6）；此方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于復(fù)方雙花利咽合劑中綠原酸的含量測定。

關(guān)鍵詞：復(fù)方雙花利咽合劑；綠原酸；含量

金銀花為復(fù)方雙花利咽合劑主要成分之一。金銀花名出自《本草綱目》，由于忍冬花初開為白色，后轉(zhuǎn)為黃色，因此得名金銀花。金銀花自古被譽(yù)為清熱解毒的良藥。金銀花既能宣散風(fēng)熱，還善清解血毒，用于各種熱性病?！侗窘?jīng)逢原》記載：“金銀花，解毒去膿，瀉中有補(bǔ)，癰疽潰后之圣藥。但氣虛膿清，食少便瀉者勿用。痘瘡倒陷不起，用此根長流水煎浴，以痘光壯為效，此即水楊湯變法。”金銀花傷寒桿菌、副傷寒桿菌、溶血性鏈球菌、大腸桿菌、變形桿菌、綠膿桿菌、百日咳桿菌、霍亂弧菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、腦膜炎球菌等均有抑制作用。金銀花主要包括黃酮類、有機(jī)酸類、環(huán)烯醚萜類、三萜及三萜皂苷類、揮發(fā)油等多種類型成分，綠原酸是其主要有效成分之一。金銀花具有抗菌、抗腫瘤、降脂、抗生育、增強(qiáng)免疫、抗炎、利膽、保肝、抗病毒、止血、抗?jié)兊榷喾N藥理作用。本文采用高校液相測定了復(fù)方雙花利咽合劑中綠原酸的含量。

1 儀器與試藥

美國必能信超聲波清洗機(jī)（北京星越天成科技有限公司）；EX1600四元低壓梯度液相色譜儀（南京皓而普分析設(shè)備有限公司）；Aurora-F1實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)洗瓶機(jī)（杭州喜瓶者生物技術(shù)有限公司）；FA1204CFAC型全自動(dòng)內(nèi)校電子分析天平（北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司）；SUPREMA高速大容量離心機(jī)（天美（中國）科學(xué)儀器有限公司）；HH-601超級恒溫水浴鍋（常州市華怡儀器制造有限公司）；實(shí)驗(yàn)室用高純水制備器（北京科譽(yù)興業(yè)科技發(fā)展有限公司）；美析紫外可見分光光度計(jì)（美析（中國）儀器有限公司）。綠原酸對照品由中國藥品生物制品檢定所提供。乙腈（北京亞太龍興化工有限公司）、冰醋酸（青島市金宏鑫化工有限公司）、三乙胺（廣州市西隴化工有限公司）、甲醇（廣州市西隴化工有限公司）、磷酸（北京亞太龍興化工有限公司）、醋酸鈉（北京亞太龍興化工有限公司）。

2 含量測定

2.1 色譜條件：依據(jù)查閱文獻(xiàn)及考查的結(jié)果，確定色譜條件如下[3-5]。色譜柱為安捷倫Cl8規(guī)格為（4.6mm×250mm，5um）；甲醇-乙腈-4%磷酸水（2：10∶88）為流動(dòng)相；檢測波長為327nm。理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不得低于2000。

2.2 供試品溶液的制備

取復(fù)方雙花利咽合劑，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加人70%乙醇50ml，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）25分鐘，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20ml蒸至近干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取綠原酸對照品約5mg，用甲醇溶解并稀釋成每1ml中含20？g的溶液，作為對照溶液。

2.4 陰性溶液的制備

依照處方除金銀花以外藥材，按樣品制備工藝制成陰性對照樣品，照供試品溶液的制備方法制成陰性液，依上述方法測定，結(jié)果在綠原酸出峰處陰性液無色譜峰，結(jié)果陰性試驗(yàn)沒有干擾，表明本方法專屬性良好。

2.5 準(zhǔn)曲線的制備

制備濃度為5、10、20、40、60、80μg·mL-1的對照品溶液，分別精密吸取10μL注入HPLC，記錄色譜圖。以峰面積積分值A(chǔ)（μg）為橫坐標(biāo)，進(jìn)樣量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。試驗(yàn)表明，綠原酸對照品在5～80μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

依照2.4項(xiàng)下制備對照品溶液，精密吸取綠原酸對照品溶液10μL重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積積分值，對照品峰面積積分值的RSD為0.73%。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)精密度良好。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

分別稱取同批復(fù)方雙花利咽合劑樣品6份，分別依照2.3項(xiàng)下供試品制0.76%，結(jié)果表明，此含量測定方法的重現(xiàn)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

依照2.3項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液，分別在0，10，20，30分鐘精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，進(jìn)樣測定，供試品綠原酸峰面積積分值的RSD為0.67%。結(jié)果表明綠原酸至少在30分鐘內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 回收率試驗(yàn)

采用加樣回收試驗(yàn)，取已知含量的同一批供試品各6份，精密稱定，分精密添加一定量的綠原酸對照品，按供試品制備所述方法制備供試品溶液，測定含量（同時(shí)測定樣品含量），計(jì)算回收率。6次測定的平均回收率為99.3%，RSD為0.83%。

2.10 樣品含量測定

依照上述含量測定方法，測定復(fù)方雙花利咽合劑三批樣品中綠原酸的含量，含量為7.56mg/g、7.67mg/g、7.92mg/g。

3 討論

分別考察乙腈-水（35：65），甲醇-水（20：80），水-乙腈-三乙胺（82∶18：0.01），甲醇-水-冰醋酸（20∶80∶1）；甲醇-乙腈-4%磷酸水（2：10∶88），乙腈-1%冰醋酸溶液（20∶80）不同比例的流動(dòng)相，結(jié)果以甲醇-乙腈-4%磷酸水（2：10∶88）為流動(dòng)相，供試品各峰分離效果最好，故選用甲醇-乙腈-4%磷酸水（2：10∶88）為流動(dòng)相。此方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于復(fù)方雙花利咽合劑中綠原酸的含量測定。復(fù)方雙花利咽合劑中綠原酸的含量不少于7.0mg/g。

參考文獻(xiàn)

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