利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增技術(shù)（Xpert M TB/R I F）快速診斷淋巴結(jié)核及其耐藥性

孫海柏，張麗霞，秦中華，郭明日，張東，白虹

（1.天津市醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，天津300070；2.天津市海河醫(yī)院，天津300350）

利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增技術(shù)（Xpert M TB/R I F）快速診斷淋巴結(jié)核及其耐藥性

孫海柏1，張麗霞2，秦中華2，郭明日2，張東2，白虹1

（1.天津市醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，天津300070；2.天津市海河醫(yī)院，天津300350）

目的探討Xpert MTB/RIF試驗在診斷淋巴結(jié)核及其對利福平耐藥的意義。方法選取156例疑似膿腫性淋巴結(jié)核患者的膿液分別進行960液體變色培養(yǎng)基培養(yǎng)、涂片鏡檢、傳統(tǒng)比例法藥敏試驗以及Xpert MTB/RIF試驗檢測，分析Xpert MTB/RIF試驗檢測MTB及其耐藥性的敏感性和特異性。結(jié)果以液體變色培養(yǎng)基培養(yǎng)試驗作為金標準，Xpert MTB/RIF試驗檢測淋巴結(jié)核的敏感性和特異性分別為（95.42%，84.00%），Kappa值為0.77，兩者一致性較好。以傳統(tǒng)比例法藥敏試驗為金標準，Xpert MTB/RIF試驗檢測利福平耐藥的敏感性和特異性分別為（70.0%，98.42%）兩種方法檢測結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論Xpert MTB/RIF試驗檢測淋巴結(jié)核及其耐藥性與傳統(tǒng)的檢測方法比較具有較高的敏感性和特異性，并且檢測時間短、及時的優(yōu)點。

淋巴結(jié)核；利福平耐藥；敏感性；特異性；Xpert MTB/RIF

頸部淋巴結(jié)核是結(jié)核分枝桿菌侵入頸部淋巴結(jié)所致的一種淋巴結(jié)病變，按病程可分為結(jié)節(jié)型、浸潤型、膿腫型及潰瘍型[1]。以膿腫性淋巴結(jié)核最為常見，治療不及時或不理想結(jié)核桿菌還要破壞掉病變處大量組織甚至骨組織，留下功能障礙，所以尋找及時準確快速的實驗室診斷方法至關(guān)重要。利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增技術(shù)（Xpert mycobacterium tuberculosis/rifampicin,Xpert MTB/RIF）檢測痰標本中結(jié)核分枝桿菌與TB培養(yǎng)法有較高一致性[2]。本文利用目前快速檢測結(jié)核菌的方法Xpert MTB/RIF對患者的膿液直接進行檢測，并對其敏感性和特異性進行分析。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2013年8月-2016年10月于天津市海河醫(yī)院確診淋巴結(jié)核的住院患者156例：單純頸部淋巴結(jié)結(jié)核例58例，淋巴結(jié)結(jié)核合并肺結(jié)核89例，腋窩淋巴結(jié)結(jié)核合并肺結(jié)核2例，腹股溝淋巴結(jié)結(jié)核合并肺結(jié)核7例。納入標準：淺表淋巴結(jié)經(jīng)B超檢查提示淋巴結(jié)有液化、壞死，或肉眼見膿腫和（或）竇道形成未進行過抗結(jié)核治療的首診患者；其中，男性41例，女性115例；年齡17～80歲。

1.2 儀器與試劑

PLR-線性探針雜交酶顯色法診斷試劑盒（Geno Type MTBDR pIus，德國Hain Life-science公司），Hotstar Taq酶（德國Qiagen公司），MGIT960液體培養(yǎng)基及藥敏管（美國BD公司）；Hain GT Blot-48全自動雜交儀（德國Hain Lifescience公司），聚合酶鏈式反應(yīng)儀（Polymerase chain reaction，PCR）（德國Hain Lifescience公司），Eppen-dorf 5804R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），生物安全柜（山東省青島市海爾公司）。

1.3 試驗方法

BACTEC MGIT960液體培養(yǎng)及耐藥性檢測、痰抗酸染色均按照結(jié)核病診斷細菌學檢驗規(guī)程進行操作，線性探針法檢測淋巴結(jié)核及其對利福平耐藥性，按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，配對計數(shù)資料χ2檢驗，行×列表資料χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，Kappa一致性系數(shù)，敏感性及特異性分析。

2 結(jié)果

2.1 患者M G I T960液體培養(yǎng)、Xpert M TB/R I F檢測以及抗酸染色淋巴結(jié)核膿標本情況

3種方法所需檢測時間分別為（4～8周、2h及2h），陽性率分別為（83.90%，82.80%和69.23%），χ2=12.39，P＜0.01以MGIT960液體培養(yǎng)為金標準，Xpert MTB/RIF檢測的敏感性與特異性分別為（95.42%和84.00%），Kappa值為0.77，一致性較好（見表1）。

表1156 例患者M G I T960培養(yǎng)檢測及Xpert M TB/R I F陰陽性比較例

2.2 Xpert M TB/R I F法等級與抗酸染色陽性等級

采用行×列表資料χ2檢驗，χ2=72.66，P＜0.01，故兩種檢測的方法等級比較差異有統(tǒng)計學意義，其中Xpert MTB/RIF“極低”級中5例抗酸染色為陰性的情況，Xpert MTB/RIF低組“低”級中6例抗酸染色為陰性的情況，Xpert MTB/RIF“中”級以及“高”級中未出現(xiàn)抗酸染色陰性的例數(shù)（見表2）。

表2156 例標本抗酸染色法陽性級別與Xpert M TB/R I F法檢測結(jié)果比較例

2.3 Xpert M TB/R I F技術(shù)與傳統(tǒng)比例法藥敏試驗?zāi)退幮詸z測結(jié)果

156例檢測標本以藥敏試驗檢測結(jié)果為金標準，采用Xpert MTB/RIF技術(shù)檢測156例菌株的RFP耐藥性，其中有19例標本在檢測中未檢測出來，137例標本檢測后敏感性、特異性分別為（70.00%和98.42%），檢測結(jié)果（χ2=0.50）（見表3）。

表3137 例菌株比例法藥敏試驗利福平耐藥性與Xpert M TB/R I F方法利福平耐藥性檢測比較例

2.4 Xpert M TB/R I F法對利福平耐藥基因突變位點檢測

分析線性探針法檢測為陽性的9例標本耐藥基因突變位點分析結(jié)構(gòu)圖（見表4）。

表4 Xpert M TB/R I F耐藥基因突變位點分析及構(gòu)成比

3 討論

本研究選取肺外結(jié)核中的淋巴結(jié)核病為例，用Xpert MTB/RIF與金標準的檢測方法MGIT960培養(yǎng)法、抗酸染色法進行比較分析，本實驗中抗酸染色的的陽性率僅為69.23%較低，傳統(tǒng)結(jié)核菌培養(yǎng)法雖然敏感性及特異性較高，結(jié)核分枝桿菌（結(jié)核桿菌）生長營養(yǎng)要求高，繁殖速度慢所以其檢測時間較長，需4～8周，不能及時為臨床提供治療依據(jù)，痰涂片對標本含菌量要求高，導(dǎo)致其診斷結(jié)核病的敏感性較低，在MTB培養(yǎng)陽性標本中敏感性僅為45%～48%[3-6]Xpert MTB/RIF利福平耐藥性遺傳學基礎(chǔ)是rpoB基因內(nèi)81bp利福平耐藥決定區(qū)（RIF）的突變[7]。Xpert MTB/RIF技術(shù)是利用MTB耐藥性與基因突變有關(guān)的分子機制，以rpoB基因為靶基因，設(shè)計引物探針選擇性覆蓋rpoB基因利福平耐藥決定區(qū)81 bp核心區(qū)，以檢測標本是否含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群以及利福平是否耐藥[8]。整個實驗僅需要2 h，儀器自動檢測是否為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTB）及是否對利福平耐藥。因此，該方法適合于各種標本類型進行檢測，所以對肺外結(jié)核病的早期診斷及其耐藥性的檢測占很大優(yōu)勢。

研究結(jié)果顯示，Xpert MTB/RIF與MGIT960培養(yǎng)法對于MTB的檢測率差異無統(tǒng)計學意義，MGIT 960培養(yǎng)和藥敏結(jié)果為參照，Xpert MTB/RIF診斷淋巴結(jié)核的敏感性與特異性分別為（95.42%和84.00%）較高Kappa值為0.77，一致性較好，Xpert MTB/RIF對利福平檢測的敏感性/特異性分別為70.00%和98.42%，Kappa值2.54。表明兩種方法對利福平耐藥性的檢測具有極好的一致性。與國內(nèi)穆成等[9]報道的關(guān)于結(jié)核分支桿菌的檢測的敏感性90.6%稍微偏低，特異性98.7%相近。

本研究中Xpert MTB/RIF檢測中與痰抗酸染色比較分析有11例標本痰涂片為陰性而Xpert MTB/ RIF檢測為陽性可能與留取的標本中捕獲到的結(jié)核菌量較少有關(guān)系。Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥性與MGIT960藥敏不一致的情況，可能是由于rpoB區(qū)內(nèi)其他突變所致或者由于其他基因突變導(dǎo)致，理論上標本中含有一種以上的MTB混合培養(yǎng)或污染時，若其中一種具有突變探針未涵蓋的突變，將出現(xiàn)野生型帶型[10]，所以不能完全排除部分突變?yōu)闊o義突變的原因。

[1]伏志杰,劉麗.對36例膿腫型頸淋巴結(jié)核治療的觀察[J].中國實用醫(yī)藥,2016,11(21)：40-41.

[2]鄒遠嫵,劉尚武,朱蕾,等.檢測結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性在結(jié)核病輔助診斷中的臨床價值[J].臨床肺科雜志,2015,20(3)：568-570.

[3]VAN RIE A,PAGE-SHIPP L,SCOTT L,et al.Xpert MTB/RIF for point-of care diagnosis of TB in high-HIV burden,resourelimited countries：hype or hope[J].Expert Review of Molecular Diagnostics,2014,10(7)：937-946(10).

[4]劉家云,郝曉柯.結(jié)核病實驗室診斷方法新進展[J].臨床檢驗雜志, 2013,32(2)：115-117.

[5]全國結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組,第四次全國結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查報告[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2002,25(1)：3-7.

[6]BEHR M A,WARVEN S A,SALAMON H,et al.Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patioents smear-negative for acidfast bacilli[J].Lancet,1999,353(9151)：444-449.

[7]KIM B J,LEE K H,YUN Y J,et al.Simultaneous identification of rifampin-resistant mycobacterium tuberculosis and nontuberculousmycobacteriaby polymerasechainreaction-singlestrand conformation polymorphism and sequence analysis of the RNA polymerasegene(rpoB)[J].Journal of MicrobiologicalMethods, 2004,58(1)：111-118.

[8]BOEHME C C,NABETA P,HILLEMANN D,et al.Rapid molecular detectionof tuberculosis and rifampin resistance[J].New England Journal of Medicine,2010,363(11)：1005-1015.

[9]穆成,王志銳,趙慧,等.GenoType MTBDRplus從涂陽痰標本中檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的效果評價[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2013, 23(26)：1601-1602.

[10]郭明日,王冰冰,張麗霞,等.PCR一線性探針雜交酶顯色法在結(jié)核病診斷與耐藥性檢測中的應(yīng)用研究[J].中華醫(yī)院感染學雜志,2016,26(7)：1483-1485.

R522

B

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.08.028

1005-8982（2017）08-0137-03

2016-11-01

白虹，E-mail：hongbai25@163.com