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    淋巴結(jié)核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞以及血漿IFN-γ和IL-10水平及其臨床意義

    2016-01-20 01:02:40張國英鈕曉紅徐衛(wèi)平
    檢驗醫(yī)學(xué) 2015年1期
    關(guān)鍵詞:淋巴結(jié)核緩沖液結(jié)核病

    張國英, 鈕曉紅, 徐衛(wèi)平, 夏 廈

    (南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗科,江蘇 南京 210014)

    淋巴結(jié)核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞以及血漿IFN-γ和IL-10水平及其臨床意義

    張國英,鈕曉紅,徐衛(wèi)平,夏廈

    (南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗科,江蘇 南京 210014)

    摘要:目的研究淋巴結(jié)核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)和干擾素γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素10(IL-10)水平的變化及臨床意義。方法采用流式細(xì)胞儀對100例淋巴結(jié)核患者及30名正常人外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg和IFN-γ、IL-10水平進(jìn)行檢測。結(jié)果淋巴結(jié)核患者組與正常對照組比較,外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg和IL-10水平均升高(P<0.05),而IFN-γ水平則降低(P<0.05)。在干酪樣型、增殖型和混合型3種類型的淋巴結(jié)核病之間各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論淋巴結(jié)核患者細(xì)胞免疫功能明顯異常。CD4+CD25highFoxP3+Treg和IFN-γ、IL-10在淋巴結(jié)核的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用。

    關(guān)鍵詞:CD4+CD25highFoxP3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞;干擾素γ;白細(xì)胞介素10;淋巴結(jié)核

    中圖分類號:

    文章編號:1673-8640(2015)01-0031-05R446.63

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:碼:A

    DOI:10.3969/j.issn.1673-8640.2015.01.008

    Abstract:ObjectiveTo study the changes of peripheral blood CD4+CD25highFoxP3+regulatory T lymphocytes (Treg) and interferon gamma (IFN-γ), interleukin 10 (IL-10) levels of patients with lymph tuberculosis and their clinical significance. MethodsThe levels of peripheral blood CD4+CD25highFoxP3+Treg, IFN- γ and IL-10 of 100 lymph tuberculosis patients and 30 healthy subjects were determined by flow cytometry. ResultsCompared with the healthy controls, the levels of peripheral blood CD4+CD25highFoxP3+Treg and IL-10 levels in lymph tuberculosis group increased with statistical significance (P<0.05), while IFN-γ level decreased (P<0.05). Among the caseous, proliferation and mixed types of lymph tuberculosis, there was no significant difference (P>0.05). ConclusionsCellular immune function is significantly abnormal in patients with lymph tuberculosis. CD4+CD25highFoxP3+Treg, IFN- γ and IL-10 play important roles in the onset process of lymph tuberculosis.

    基金項目:南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展項目(QYK11146)

    作者簡介:張國英,女,1978年生,碩士,副主任技師,主要從事微生物與免疫學(xué)研究。

    收稿日期:(2014-01-21)

    Levels of CD4+CD25highFoxP3+regulatory T lymphocytes in peripheral blood and plasma IFN-γ, IL-10 of patients with lymph tuberculosis and their clinical significanceZHANGGuoying,NIUXiaohong,XUWeiping,XIAXia.(DepartmentofClinicalLaboratory,NanjingHospitalofIntegratedTraditionalandWesternMedicine,NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,JiangsuNanjing210014,China)

    Key words: CD4+CD25highFoxP3+regulatory T lymphocyte; Interferon gamma; Interleukin 10; Lymph tuberculosis

    結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)感染引起的慢性傳染病,其中,淋巴結(jié)核病是指發(fā)生于全身淋巴結(jié)的結(jié)核病,如頸部淋巴結(jié)核、腸系膜淋巴結(jié)核等,約占結(jié)核病的10%。對這類結(jié)核病的研究,目前仍相對較少。臨床上因此漏診率、誤診率較高[1]。

    結(jié)核分枝桿菌為胞內(nèi)寄生菌,機(jī)體的免疫清除作用主要依賴于分泌干擾素γ(interferon gamma,IFN-γ)的CD4+和CD8+效應(yīng)性T細(xì)胞。CD4+CD25highFoxP3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T lymphocyte,Treg)是SAKAGUCHI等首先描述的在胸腺內(nèi)發(fā)育成熟的抑制自身免疫和移植排斥反應(yīng)的一群細(xì)胞,占CD4+T細(xì)胞總數(shù)的5%~10%[2],能夠分泌白細(xì)胞介素10(interleukin 10,IL-10)等抑制因子,從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[3]。

    本研究分別采用流式細(xì)胞術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測淋巴結(jié)核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg和IFN-γ、IL-10水平,并探討其臨床意義。

    材料和方法

    一、研究對象

    淋巴結(jié)核組:選取2012年4月至2013年4月在南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院住院就診的淋巴結(jié)核患者100例,男39例,女61例,年齡(44±17)歲,根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會2005年《臨床診療指南·結(jié)核病分冊》關(guān)于淋巴結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]確診,并排除由瘰疬分枝桿菌等引起的非結(jié)核性分枝桿菌淋巴結(jié)炎患者。其中干酪樣型21例、增殖型32例、混合型47例。正常對照組:選取健康體檢者30名,其中男16名,女14名,年齡(37±19)歲。

    二、標(biāo)本采集

    采集外周靜脈血5 mL,肝素鋰抗凝。分成2管,一管2 mL用于CD4+CD25highFoxP3+Treg檢測,另一管及時分離血漿,貯存于-80 ℃冰箱,用于檢測IFN-γ、IL-10水平。

    三、方法

    1. CD4+CD25highFoxP3+Treg的檢測在2 mL肝素抗凝血中加入2 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)稀釋全血,將全血混合液緩慢加至2 mL Ficoll液上,使其分層。1 000×g離心20 min,吸取中間白膜層單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),并用PBS洗滌1次(600×g離心5 min)。每管加入100 μL制備好的PBMC(1×106/mL),并加入20 μL CD4-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocynate,FITC)/CD25-藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)混合液,4 ℃下避光孵育30 min;經(jīng)流式染色緩沖液洗滌后加入1 mL Fixation/Permeabilization緩沖液,4 ℃下避光孵育45 min破膜。用破膜緩沖液洗滌2次后加入20 μL FoxP3-藻紅蛋白-菁藍(lán)色素?zé)晒馑?phycoerythrin cyanine 5,PECy5)(同型對照管加入20 μL IgG2a-PECy5),于4 ℃避光孵育30 min。經(jīng)破膜緩沖液洗滌2次后用500 μL 流式染色緩沖液重懸,上流式細(xì)胞儀(FACS Canto Ⅱ型,美國BD公司)檢測。

    2. IFN-γ、IL-10的檢測用ELISA進(jìn)行檢測,試劑盒購自法國DIACLONE公司,用BIO-RAD EVOLIS全自動酶免疫分析儀進(jìn)行測定。

    四、統(tǒng)計學(xué)方法

    結(jié)果

    一、 淋巴結(jié)核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg和IFN-γ、IL-10水平

    與正常對照組比較,淋巴結(jié)核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg和IL-10水平均升高(P<0.05),而IFN-γ水平則降低(P<0.05)。 見表1、圖1和圖2。

    二、不同類型淋巴結(jié)核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg和IFN-γ、IL-10水平

    干酪樣型、增殖型和混合型淋巴結(jié)核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg、IFN-γ和IL-10水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

    表1淋巴結(jié)核組及正常對照組外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg和IFN-γ、IL-10的水平比較

    組別 例數(shù)CD4+CD25highFoxP3+Treg(%)IFN-γ(pg/mL)IL-10(pg/mL)淋巴結(jié)核組1002.32±0.2916.62±1.6316.74±2.21正常對照組302.01±0.4919.07±2.8514.50±1.56

    注:與正常對照組比較,*P<0.05

    圖1 淋巴結(jié)核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg的流式圖

    圖2 正常對照組外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg的流式圖

    組別 例數(shù)CD4+CD25highFoxP3+Treg(%)IFN-γ(pg/mL)IL-10(pg/mL)干酪樣型組212.29±0.5216.28±0.7517.05±2.13增殖型組322.36±0.1417.19±3.3516.01±2.45混合型組472.31±0.3016.51±1.6216.95±2.09

    討論

    MTB是一種胞內(nèi)寄生菌。機(jī)體在抵抗MTB感染的過程中,細(xì)胞免疫應(yīng)答發(fā)揮著重要作用,對結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸具有決定性意義[5]。而決定細(xì)胞免疫強(qiáng)弱的主要因素是血液中T淋巴細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞因子的水平[6]。

    CD4+CD25highFoxP3+Treg是一群具有免疫抑制效應(yīng)的T細(xì)胞亞群[7-9],在調(diào)節(jié)自身反應(yīng)性T細(xì)胞的功能,維持機(jī)體免疫平衡和自身耐受,防止自身免疫性疾病發(fā)生過程中起著重要作用。其數(shù)量和功能缺陷會導(dǎo)致自身免疫性疾病,而數(shù)量和功能過度,則會抑制效應(yīng)T細(xì)胞的功能而導(dǎo)致腫瘤等疾病的發(fā)生[8]。 本研究分析了100例淋巴結(jié)核患者外周血中CD4+CD25highFoxP3+Treg的水平,發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比,淋巴結(jié)核患者的CD4+CD25highFoxP3+Treg明顯升高,提示淋巴結(jié)核患者由于CD4+CD25highFoxP3+Treg的數(shù)量增加,抑制了體內(nèi)T效應(yīng)細(xì)胞的功能,從而使CD4+CD25highFoxP3+Treg參與淋巴結(jié)核病的發(fā)生。

    IFN-γ是一個由輔助T細(xì)胞(help T cell, Th)1分泌的重要細(xì)胞因子[10-11],能激活巨噬細(xì)胞,增加它們對MTB的殺菌能力,在局部抗結(jié)核感染的防御機(jī)制中起重要作用[12]。IL-10對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用主要表現(xiàn)為2個方面,一方面具有抑制細(xì)胞免疫的作用,即通過對Th發(fā)揮作用,抑制T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的分泌[13]。另一方面,IL-10還能促進(jìn)Th0向Th2轉(zhuǎn)化,誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞增殖分化,介導(dǎo)體液免疫。Th2的增高可下調(diào)Th1反應(yīng),抑制IFN-γ產(chǎn)生[14]。因此,IL-10可抑制細(xì)胞介導(dǎo)的抗MTB感染免疫反應(yīng)[15]。本研究通過檢測淋巴結(jié)核患者外周血IFN-γ、IL-10的水平發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,淋巴結(jié)核患者的IFN-γ水平顯著下降,而IL-10的水平顯著上升。提示在淋巴結(jié)核患者體內(nèi),CD4+CD25highFoxP3+Treg通過分泌IL-10等抑制性細(xì)胞因子,間接抑制IFN-γ等的水平,進(jìn)而發(fā)揮免疫抑制功能,導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫功能下降,引起MTB在體內(nèi)的慢性持續(xù)感染。

    淋巴結(jié)核按病理學(xué)分型可分為3種類型:干酪樣型、增殖型和混合型。本研究分別對3種類型的淋巴結(jié)核患者進(jìn)行外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg和IFN-γ、IL-10水平的檢測,發(fā)現(xiàn)3種類型之間無明顯差異。進(jìn)一步表明在淋巴結(jié)核病的發(fā)病過程中,CD4+CD25highFoxP3+Treg和IFN-γ、IL-10發(fā)揮了重要作用。本研究因檢測例數(shù)不多,故未按不同的病程、治療方案等分組進(jìn)行比較,今后仍需進(jìn)一步收集資料進(jìn)行研究。

    綜上所述,通過對淋巴結(jié)核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg以及血漿IFN-γ和IL-10水平的檢測,發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)核患者的細(xì)胞免疫功能明顯異常,在MTB感染引起淋巴結(jié)核的過程中,CD4+CD25highFoxP3+Treg和細(xì)胞因子IFN-γ、IL-10發(fā)揮了重要作用。

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    (本文編輯:姜敏)

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