不同因素對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠模型效果的影響

宋 瑩, 郭雅娟, 黃銘倩, 梁金強(qiáng), 黃芝瑛

(中山大學(xué) 1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心; 2. 藥學(xué)院, 廣州 510006)

不同因素對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠模型效果的影響

宋 瑩1, 郭雅娟2, 黃銘倩1, 梁金強(qiáng)1, 黃芝瑛2

(中山大學(xué) 1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心; 2. 藥學(xué)院, 廣州 510006)

目的 探究環(huán)磷酰胺(CY)劑量和檢測(cè)終點(diǎn)對(duì)BALB/c小鼠免疫抑制模型效果的影響。方法 將BALB/c小鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組、CY 40 mg/kg組、CY 60 mg/kg組，此三組均設(shè)末次給藥后第5日為檢測(cè)終點(diǎn)，并設(shè)CY 60 mg/kg-2組，末次給藥后第3日為檢測(cè)終點(diǎn)，檢測(cè)終點(diǎn)時(shí)進(jìn)行血液學(xué)檢查，測(cè)定脾臟、胸腺的臟器重量，檢測(cè)T、B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能改變。結(jié)果 與對(duì)照組相比，各模型組上述檢測(cè)指標(biāo)均有不同程度的改變; 比較各模型組結(jié)果，當(dāng)檢測(cè)終點(diǎn)相同時(shí)，60 mg/kg劑量造模效果更好; 固定CY劑量，選擇末次給藥第3日為檢測(cè)終點(diǎn)效果更優(yōu)。結(jié)論 CY劑量和檢測(cè)終點(diǎn)的不同會(huì)影響B(tài)ALB/c小鼠免疫抑制模型效果，選擇60 mg/kg CY劑量的造模效果優(yōu)于40 mg/kg; 末次給藥后第3日更適合作為免疫評(píng)價(jià)模型的檢測(cè)終點(diǎn)。

環(huán)磷酰胺(CY); 檢測(cè)終點(diǎn); 免疫抑制; 小鼠模型

目前市場(chǎng)上提高人體免疫力的保健品層出不窮，建立快速、靈敏的免疫抑制模型對(duì)藥品、保健品的免疫學(xué)評(píng)價(jià)有重要意義。環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide, CY)是一種烷化劑類化療藥物，臨床上常用于抗腫瘤，此外CY還具有較強(qiáng)的免疫抑制作用，是制備免疫抑制模型常用的陽性藥[1]。但是目前尚無較統(tǒng)一的免疫抑制模型造模條件，而條件設(shè)置對(duì)藥品、保健品等的免疫學(xué)評(píng)價(jià)效果有明顯影響。本文旨在探索CY劑量高低以及檢測(cè)終點(diǎn)不同對(duì)免疫抑制模型效果的影響，為藥品、保健品等的免疫學(xué)效果評(píng)價(jià)建立合適的模型提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c小鼠32只，11～12周齡，雌雄各半，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK (粵)2013-0002]。

1.2 藥物、試劑與儀器

CY(批號(hào)04131204), 山西普德藥業(yè)股份有限公司; 質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%氯化鈉注射液(批號(hào)B14070303),江西科倫藥業(yè)有限公司; CD3e-PerCP(批號(hào)5079796)、CD4-FITC(批號(hào)5040579)、CD8a-PE(批號(hào)5047674)、CD19-FITC(批號(hào)5138957)、CD25-APC (批號(hào)5329646)、CD69-APC(批號(hào)3207812)、CD80-PE(批號(hào)3234833)、CD86-APC(批號(hào)4076926)、IFN-γ-APC(批號(hào)5245918)、IL-4-PE(批號(hào) 5119577)、Transcription Factor Buffer Set(批號(hào)5275574)、裂解液(批號(hào) 4189857)、細(xì)胞固定液(批號(hào) 4098726); Leukocyte Activation Cocktail(批號(hào)5215748)均為美國(guó)BD公司; 磷酸鹽緩沖液(批號(hào)NAA1316)、胎牛血清(批號(hào) NYB0814)，賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司; RPIM-1640培養(yǎng)基(批號(hào)1687968)，美國(guó)life technologies公司; LPS(批號(hào)025M4040V)、Con-A(批號(hào) SLBN0358V)，美國(guó)Sigma公司; CFSE細(xì)胞增殖熒光染料(批號(hào) E10114-1641)，美國(guó)eBioscience公司; CCK-8法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(批號(hào) 20160325), 凱基生物技術(shù)有限公司。Accuri C6流式細(xì)胞儀, 美國(guó)BD公司; L535R-1型冷凍離心機(jī), 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司; Genius 3型漩渦混合器, 德國(guó)艾卡儀器設(shè)備有限公司; Ascent型多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)賽默飛公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組及給藥 將BALB/c小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組、CY40 mg/kg組、CY60 mg/kg組以及CY60 mg/kg -2組, 每組8只, 雌雄各半。模型組均腹腔注射CY, 連續(xù)3 d，除CY60 mg/kg -2組為末次給藥后第3日解剖測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)外，其余3組為末次給藥后第5日解剖測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定 試驗(yàn)結(jié)束后測(cè)定動(dòng)物的脾臟、胸腺系數(shù)[=臟器質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)][2]。其余血液學(xué)及免疫學(xué)指標(biāo)按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 60 mg/kgCY造模效果優(yōu)于40 mg/kg劑量

兩個(gè)劑量對(duì)BALB/c小鼠都可以造成免疫抑制，60 mg/kg CY組的造模效果更優(yōu)。與對(duì)照組相比，60 mg/kg CY組胸腺和脾臟系數(shù)下降趨勢(shì)更為明顯(表1)。外周血中網(wǎng)織紅細(xì)胞比例(RET%)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)和單核細(xì)胞比例(MONO%)顯著降低(P＜0.05)(表2); NK細(xì)胞的活性明顯受到抑制，脾B淋巴細(xì)胞的增殖速度也大大降低，且隨著CY劑量增大降低幅度越大(表3)。

2.2 末次給藥后第3日為檢測(cè)終點(diǎn)優(yōu)于末次給藥后第5日

末次給藥后第3日的60 mg/kg CY-2組脾臟受損更為嚴(yán)重(雌雄小鼠的胸腺和脾臟系數(shù)分別為0.170±0.030、0.186±0.027和0.189±0.012、0.156±0.021)。血常規(guī)結(jié)果也顯示末次給藥后第3日WBC[雌(3.47±0.48)× 109/L、雄(2.20±0.53) ×109/L]和RET%(雌0.31±0.03、雄0.43±0.02)下降更為嚴(yán)重。小鼠外周血中CD4+/CD8+比例在末次給藥后第3日增長(zhǎng)的程度更強(qiáng)，Th1、Th2細(xì)胞的比例則下降更為明顯; 脾細(xì)胞懸液中T淋巴細(xì)胞的比例也顯著上升，活化比例下降，但是B淋巴細(xì)胞的活化比例顯著上升(表4)。

表 1 CY劑量不同對(duì)免疫抑制模型臟器系數(shù)的影響Table 1 The effect of different dosages of CY on immune organ coefficient of immunosuppressed mice model

表 2 CY劑量不同對(duì)免疫抑制模型血常規(guī)的影響Table 2 The effect of different dosages of CY on blood routine examination of immunosuppressed mice model

表 3 CY劑量不同對(duì)免疫抑制模型免疫細(xì)胞的影響Table 3 The effect of different dosages of CY on immunocytes of immunosuppressed mice model

續(xù)表3

表 4 末次給藥后第3日為檢測(cè)終點(diǎn)時(shí)免疫抑制小鼠模型的免疫細(xì)胞Table 4 The immunocytes of immunosuppressed mice model tested at 3 days after the last administration

3 討論

胸腺和脾臟是重要的免疫器官，是淋巴細(xì)胞發(fā)育的重要場(chǎng)所，常被用于評(píng)價(jià)免疫功能強(qiáng)弱; RET是晚幼紅細(xì)胞核脫核后到成熟的紅細(xì)胞之間的過渡細(xì)胞，與紅細(xì)胞免疫有密切的關(guān)系[3]，白細(xì)胞和單核細(xì)胞則是機(jī)體固有免疫的重要組成部分; NK細(xì)胞被認(rèn)為是機(jī)體天然免疫的第一道防線，它是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁[4]; 在機(jī)體受到外來物質(zhì)侵害時(shí)，T淋巴細(xì)胞能迅速增殖發(fā)揮免疫作用，因此T細(xì)胞的狀態(tài)與免疫功能密切相關(guān); CD4+CD25+Treg(regulatory T cells, Treg)免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，能抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞增殖，并抑制抗體的產(chǎn)生[5,6]，F(xiàn)oxp3為Treg細(xì)胞的特異性標(biāo)志[7], CD4+Th 淋巴細(xì)胞按其所產(chǎn)生的細(xì)胞因子種類不同可以分為Th1和Th2 淋巴細(xì)胞, 其中IFN-γ促進(jìn)Th 細(xì)胞分化為Th1, 主要參與細(xì)胞免疫; IL-4促進(jìn)Th細(xì)胞分化為Th2，主要參與體液免疫[8]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用多個(gè)指標(biāo)對(duì)免疫抑制的造模效果進(jìn)行評(píng)估，例如臟器系數(shù)和血常規(guī); 另外，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血或脾臟各淋巴細(xì)胞分群和活化狀態(tài)，該指標(biāo)靈敏度高，代表性強(qiáng)，是反映機(jī)體免疫功能的首選。

CY和糖皮質(zhì)激素類藥物是免疫抑制模型常用陽性藥物，各個(gè)藥物的給藥途徑、給藥劑量、給藥周期均可影響免疫抑制模型的效果，宋雁等[9]比較了不同途徑和劑量CY對(duì)模型的影響，該文建議一次性大劑量腹腔給予200 mg/kg CY造模。雖然不同的條件均可誘導(dǎo)免疫抑制模型，但是免疫抑制模型的應(yīng)用是較為廣泛的，而應(yīng)用時(shí)對(duì)免疫抑制模型效果的要求也有所區(qū)別，本實(shí)驗(yàn)是基于本實(shí)驗(yàn)室前期保健品免疫功效評(píng)價(jià)中出現(xiàn)的問題, 即給藥4周左右的小鼠用40 mg/kg CY劑量造模，末次給藥后第5日檢測(cè)時(shí)免疫抑制模型組與對(duì)照組較難出現(xiàn)免疫學(xué)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)學(xué)改變，為此進(jìn)行了本次探索。

在此類型評(píng)價(jià)中需要考慮到保健類藥品在功效方面可能會(huì)弱于相應(yīng)的藥品，在造模時(shí)既要考慮到免疫抑制效果的出現(xiàn)，又不能嚴(yán)重地抑制動(dòng)物的免疫功能而掩蓋保健藥物的潛在免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了CY劑量以及檢測(cè)終點(diǎn)的不同確實(shí)會(huì)對(duì)造模的效果產(chǎn)生影響。而對(duì)于保健品、食品等類型的免疫學(xué)評(píng)價(jià)中，經(jīng)常會(huì)遇到給藥一定周期如給藥4周來觀察藥物對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，此時(shí)在給藥結(jié)束前使用CY造模時(shí),本實(shí)驗(yàn)推薦選擇60 mg/kg CY劑量連續(xù)給藥3 d，其造模效果優(yōu)于40 mg/kg; 末次給藥后第3日更適合作為免疫學(xué)評(píng)價(jià)模型的檢測(cè)終點(diǎn)。

[1] Pelaez B, Campillo JA, Lopez-Asenjo JA, et al. Cyclophosphamide induces the development of early myeloid cells suppressing tumor cell growth by a nitric oxide-dependent mechanism[J]. J Immunol, 2001, 166(11):6608-6615.

[2] 呂穎堅(jiān), 黃俊明, 蔡玟, 等. 環(huán)磷酰胺和氫化可的松建立免疫抑制模型方法比較[J]. 衛(wèi)生研究, 2012, 41(6):951-955.

[3] 門劍龍. 測(cè)定自身免疫溶血性貧血患者未成熟網(wǎng)織紅細(xì)胞指數(shù)的臨床價(jià)值[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志, 2004, 22(1):47-57.

[4] 楊穎, 蔡玟, 黃志彪, 等. 環(huán)磷酰胺致小鼠免疫功能低下模型建立與評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)公共衛(wèi)生, 2008, 24(5):581-583.

[5] Ralainirina N, Poli A, Michel T, et al. Control of NK cell functions by CD4+CD25+regulatory T cells[J]. J Leukoc Biol, 2007, 81(1):144-153.

[6] Wei H, Yang M, Zhao T, et al. Functional expression and characterization of grass carp IL-10: an essential mediator of TGF-beta1 immune regulation in peripheral blood lymphocytes[J]. Mol Immunol, 2013, 53(4):313-320.

[7] 王勝軍, 許化溪, 楊勝利. CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[J]. 細(xì)胞生物學(xué)雜志, 2005(27):61-65.

[8] 張李峰, 蒲建中, 鮑英存, 等. 比較同一復(fù)方中用紅芪與用黃芪對(duì)免疫抑制小鼠淋巴細(xì)胞和Th1/Th2型細(xì)胞因子的影響[J]. 免疫學(xué)雜志, 2012, 28(3):212-216.

[9] 宋雁, 賈旭東, 崔文明, 等. 不同途徑和劑量環(huán)磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型的對(duì)比研究[J]. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志, 2013, 25(3):218-225.

Effect of Different Factors on Cyclophosphamide Induced Immunosuppression Mice Model

SONG Ying1, GUO Ya-juan2, HUANG Ming-qian1, LIANG Jin-qiang1, HUANG Zhi-ying2
(1. Laboratory Animal Center, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510006, China; 2. School of Phamaceutical Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510006, China)

Objective To investigate the different dosages of cyclophosphamide (CY) and endpointdetection on the effects of immunosuppression model. Methods BALB/c mice were divided into 4 groups randomly: negtive control group (A), CY 40 mg/kg group (B), CY 60 mg/kg group (C), which were all tested at 5 days after the last administration, and CY 60 mg/kg group-2 (D) was tested at 3 days after. The animal’s body weight was measured every day, hematological parameters and immune organ index were detected when the experiments finished, as well as immune function was mediated by T or B lymphocytes testing. Results The different doses of CY and endpoint-detection have impact on the immunosurpression effect. 60 mg/kg CY has stronger immunosurpression effect when tested at 5 days after the last administration. The alteration of immune indicators were more obervious when tested at 3 days after the last administration compared with 5 days at the dosage of 60 mg/kg CY. Conclusion Dosages of CY and endpoint-detection have impact on immunosuppressed mice model. 60 mg/kg CY is more effective than 40 mg/kg CY, and the results are better when 3 days after the last administration is chosen as the endpoint-detection.

Cyclophosphamide (CY); Endpoint-detection; Immunosuppression; Mice model

Q95-33

A

1674-5817(2017)01-0036-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.01.008

2016-08-19

宋 瑩(1988-), 女, 碩士, 研究方向?yàn)樗幚砑岸纠韺W(xué) 。 E-mail:keaisongying@126.com

[通迅作者] 黃芝瑛, 教授。E-mail: hzhiying@mail.sysu.edu.cn