小鼠剪尾出血模型的優(yōu)化

田 靖, 崔慶華, 郭 平, 張志曉, 馮子良, 鄭 穎, 范泉水

(成都軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心, 昆明 650032)

小鼠剪尾出血模型的優(yōu)化

田 靖, 崔慶華, 郭 平, 張志曉, 馮子良, 鄭 穎, 范泉水

(成都軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心, 昆明 650032)

目的 探討小鼠剪尾出血模型在凝血藥物體內(nèi)評(píng)價(jià)過程中應(yīng)用的可行性。方法 對(duì)傳統(tǒng)鼠尾出血模型實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行考察和比較分析，對(duì)小鼠剪尾模型制備方法進(jìn)行優(yōu)化，建立了一種可快速準(zhǔn)確檢測(cè)鼠尾出血量和出血時(shí)間的方法。并利用商品化凝血酶藥物蘇靈驗(yàn)證了該方法在凝血藥物藥效學(xué)評(píng)價(jià)中的有效性，對(duì)鼠尾出血量(出血時(shí)間)與小鼠凝血時(shí)間指標(biāo)的敏感性比較也顯示了此模型的優(yōu)越性。結(jié)果 優(yōu)化后的鼠尾出血模型可對(duì)小鼠出血量進(jìn)行低至微升級(jí)的精確檢測(cè)，通過一定時(shí)間間隔的出血量來確定出血終點(diǎn)的方法，很大程度上消除了實(shí)驗(yàn)中的人為誤差。該模型操作簡(jiǎn)便、易于使用，可以敏感且有效模擬體外創(chuàng)傷的動(dòng)物模型，在評(píng)價(jià)凝血藥物的藥效中發(fā)揮作用。結(jié)論 小鼠剪尾出血模型可以敏感反應(yīng)凝血藥物的體內(nèi)作用，可作為凝血藥物初步篩選和評(píng)價(jià)的有效工具。

小鼠剪尾出血模型; 創(chuàng)傷模擬; 出血量; 出血時(shí)間

鼠尾出血模型造模簡(jiǎn)單方便、易于觀察，在動(dòng)植物凝血活性成分的評(píng)價(jià)以及白血病藥物的研發(fā)中發(fā)揮著重要作用。然而，小鼠尾部出血模型使用40多年來，不同實(shí)驗(yàn)室在小鼠出血模型的制備方法上存在一些差異，這些差異體現(xiàn)在造模和檢測(cè)的各個(gè)細(xì)節(jié)，由于沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)來說明這些操作的合理性和必要性，使得該模型制備缺乏規(guī)范，限制了鼠尾出血模型的廣泛應(yīng)用。

本文作者認(rèn)為，小鼠尾部出血造模這一過程實(shí)際上對(duì)小鼠尾部靜脈、動(dòng)脈和組織均造成損傷，可視為一種較為理想的體外創(chuàng)傷模型。作者試圖在小鼠清醒狀態(tài)下剪尾造模，確保室溫條件下鼠尾平放、血液自由流動(dòng)，用濾紙采集血液，準(zhǔn)確檢測(cè)出血量，以出血量值判定出血時(shí)間，彌補(bǔ)出血時(shí)終點(diǎn)判定模糊等人為誤差，從而使該模型能夠有效反應(yīng)藥物對(duì)小鼠出血量和出血時(shí)間的影響。本文通過對(duì)小鼠鼠尾出血模型的造模過程以及研究方法的優(yōu)化，使其能夠很好模擬生物創(chuàng)傷出血過程，以探討該模型在凝血藥物篩選和評(píng)價(jià)中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠，4～5周齡, 體質(zhì)量18～22 g，購自中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK-2012-0011]; 飼養(yǎng)于昆明醫(yī)科大學(xué)SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[SYXK(滇)K2015-0002]。

1.2 藥物、試劑和儀器

蘇靈, 代號(hào)Saculin, 購自北京康辰藥業(yè)有限公司; NaOH, 購自廣東光華化學(xué)廠有限公司; EDTANa2, 購自美國Sigma公司; 生理鹽水, 購自昆明南疆制藥廠; Stat Fax?2100型酶標(biāo)儀, 購自美國Awareness technology公司; NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)(型號(hào)ND2000), 購自美國Thermo scientific公司; 水浴鍋，購自金壇市杰瑞爾電器有限公司，型號(hào)HH-2J; #4濾紙，購自美國Whatman公司; 2.5 mL注射器，購自江西洪達(dá)醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司; 96孔板，購自廣州潔特生物過濾制品有限公司。

1.3 血液樣品最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定

小鼠眼眶內(nèi)眥取血法采集小鼠新鮮血液1 mL，用質(zhì)量濃度為4%EDTANa2抗凝，取20 μL小鼠抗凝血液溶解于2 mL質(zhì)量濃度為10%的NaOH裂解液中, 震蕩試管，使血細(xì)胞充分裂解30 min，得血液裂解樣品。取2 μL裂解液，用NanoDrop對(duì)其進(jìn)行蛋白吸收波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，將明顯吸收峰處波長(zhǎng)確定為最大吸收波長(zhǎng)。

1.4 血液裂解標(biāo)準(zhǔn)品吸光度曲線繪制

分別取小鼠抗凝血2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL、16 μL和18 μL加入到2 mL質(zhì)量濃度為10%NaOH溶液中, 充分裂解30 min, 以質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%NaOH溶液為空白對(duì)照, 用NanoDrop依次測(cè)定其在418 nm處吸光值, 繪制擬合曲線, 計(jì)算R2值。將各樣品依次加入到96孔板中, 200μL/孔,每個(gè)濃度重復(fù)三孔, 用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品在450 nm、405 nm、492 nm波長(zhǎng)以及雙波長(zhǎng)405 nm/630 nm、450 nm/630 nm處吸光值, 繪制擬合曲線, 計(jì)算R2值。

1.5 出血量檢測(cè)方法建立以及回收率檢測(cè)

將#4濾紙剪成15 mm×15 mm方塊，在濾紙上分別滴加抗凝血3 μL、9 μL和18 μL, 使濾紙片充分吸收血液后將濾紙片放入含有2 mL質(zhì)量濃度為10% NaOH裂解液的試管中，室溫下充分震蕩，觀察濾紙片纖維完全松散，濾紙片上血液完全溶解為止。靜止試管30 min，取上清200 μL/孔測(cè)定450 nm/630 nm處的吸光值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回收血液量，計(jì)算回收率。同以上方法，檢測(cè)微量血液(0.4 μL～1.8 μL)的回收血液量，計(jì)算回收率。

1.6 小鼠出血量與出血時(shí)間檢測(cè)

小鼠20只，雌雄各半，按照體質(zhì)量隨機(jī)分為2組，每組10只，尾靜脈給藥，樣品組給予生理鹽水配制的蘇靈(0.62 U/kg)，對(duì)照組給予相應(yīng)體積的生理鹽水。用藥30 min后將小鼠用固定器固定，用含有乙醚的棉球?qū)π∈筮M(jìn)行吸入性麻醉，使其減少自主行動(dòng)后將鼠尾平放于桌面上, 用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇消毒鼠尾，待酒精揮發(fā)后在鼠尾末端5 mm處用滅菌的手術(shù)刀片割斷，立即用15 mm×15 mm定量濾紙片吸取斷尾處血液(不要直接接觸到尾部)并開始計(jì)時(shí)，每2 min將吸取血液的濾紙片放入裝有2 mL 質(zhì)量濃度10% NaOH溶液的玻璃試管中，稍微震蕩, 待濾紙片上血液完全溶解后, 靜置30 min后加入96孔板，用分光光度計(jì)檢測(cè)450 nm/630 nm吸光度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出每分鐘內(nèi)的流血量(μL)，以累積出血量計(jì)算出每只小鼠的出血總量。當(dāng)每2 min流出血液少于1 μL判定為出血終止，記錄出血終止前2 min時(shí)間點(diǎn)為出血時(shí)間。同時(shí)按照常規(guī)方法記錄小鼠實(shí)際出血時(shí)間，以濾紙片上肉眼未見血點(diǎn)為出血終止。

1.7 小鼠凝血時(shí)間檢測(cè)

小鼠40只, 雌雄各半，隨機(jī)分為4組，每組10只。每組小鼠分別靜脈給予劑量為0.16 U/kg、0.64 U/kg和2.48 U/kg生理鹽水稀釋的蘇靈溶液，對(duì)照組給予生理鹽水。給藥30 min后小鼠眼眶內(nèi)眥取血并計(jì)時(shí)，丟棄第一滴血，取兩滴血液滴于37 ℃水浴保溫的玻片上，用針尖垂直挑動(dòng)血液，10 s挑動(dòng)一次，待出現(xiàn)第一絲纖維蛋白時(shí)停止計(jì)時(shí)，即為小鼠凝血時(shí)間。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

采用SAS 9.2軟件采用相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法進(jìn)行顯著性差異分析, P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血液裂解樣品最大吸收波長(zhǎng)確定

將溶解在質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% NaOH中的小鼠抗凝血樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描后發(fā)現(xiàn)該血液樣品在418 nm處具有最大吸收峰，掃描結(jié)果見圖1。

2.2 酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)吸光度的影響

圖 1 血液裂解樣品的蛋白廣譜掃描圖

血液標(biāo)準(zhǔn)樣品吸光度檢測(cè)及擬合曲線如圖2A和圖2B所示。通過比較同一樣品在不同檢測(cè)波長(zhǎng)下吸光值擬合曲線顯示，酶標(biāo)儀450 nm/630 nm吸光值曲線(R2=0.98485)具有良好的線性關(guān)系，而在450 nm、405 nm、492 nm和405 nm/630 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)則線性不佳。與NanoDrop分光光度計(jì)檢測(cè)到的418 nm吸光值曲線(R2=0.99434)相比，酶標(biāo)儀450 nm/630 nm吸光值曲線也最為接近，因此，可以用酶標(biāo)儀450 nm/630 nm處吸光值代替418 nm處吸光值，進(jìn)行大量樣品的吸光度檢測(cè)。

圖 2 血液樣品標(biāo)準(zhǔn)品在不同波長(zhǎng)檢測(cè)條件下的吸光度值

2.3 酶標(biāo)儀450 nm/630 nm波長(zhǎng)檢測(cè)血液樣品的回收率

對(duì)血液量檢測(cè)方法進(jìn)行了回收率驗(yàn)證, 血液量小于1 μL的微量血液樣本(0.4 μL～0.8 μL)的回收率在76.96%～93.28%, 血液量大于1 μL(1.0 μL～18 μL)時(shí), 樣品回收率在95.15%～113.49%, 表明本方法可以較為準(zhǔn)確檢測(cè)小鼠實(shí)際出血量, 并且對(duì)大于1 μL的血液樣本檢測(cè)準(zhǔn)確率更接近于真實(shí)值。

表 1 模擬血液樣品的回收率

2.4 鼠尾出血模型出血量和出血時(shí)間檢測(cè)的有效性驗(yàn)證

為了驗(yàn)證鼠尾出血時(shí)間和出血量檢測(cè)是否可以有效評(píng)價(jià)藥物的止血效果，評(píng)價(jià)了商品化藥品蘇靈給藥對(duì)這兩個(gè)指標(biāo)的影響。結(jié)果顯示, 0.62 U/kg劑量蘇靈(Saculin)(由臨床使用劑量換算)可以顯著縮短小鼠尾部出血總量(圖3)、顯著縮短出血時(shí)間(圖4),凝血效果顯著。出血準(zhǔn)確時(shí)間檢測(cè)直接統(tǒng)計(jì)，按照原方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表2)，結(jié)果也顯示與改進(jìn)后的出血時(shí)間統(tǒng)計(jì)方法得出結(jié)論一致。

圖 3 剪尾后小鼠出血量檢測(cè)(n=10)

圖 4 剪尾后出血小鼠出血百分比與時(shí)間曲線(n=10)

表 2 精確測(cè)定小鼠出血時(shí)間

2.5 鼠尾出血量和出血時(shí)間檢測(cè)與小鼠凝血時(shí)間指標(biāo)敏感性的比較

為了評(píng)價(jià)出血量和出血時(shí)間指標(biāo)在檢測(cè)藥物藥效中的敏感性方面是否具有優(yōu)勢(shì), 將這兩個(gè)指標(biāo)與凝血時(shí)間指標(biāo)進(jìn)行比較。結(jié)果顯示, 引起小鼠出血時(shí)間顯著縮短的蘇靈劑量(0.62 U/kg)對(duì)小鼠凝血時(shí)間并沒有顯著性影響, 隨著給藥劑量增加4倍(2.56 U/kg),凝血時(shí)間有縮短的趨勢(shì)，但與對(duì)照組比較無顯著性差異(圖5)。

圖 5 小鼠凝血時(shí)間(n=10)

3 討論

從模擬創(chuàng)傷的角度去看待小鼠尾部出血模型是本研究的出發(fā)點(diǎn)，作者對(duì)模型進(jìn)行了必要改進(jìn)，在檢測(cè)方法上也有所創(chuàng)新。

國內(nèi)在制作小鼠剪尾模型時(shí)通常不進(jìn)行麻醉,而國外剪尾模型中使用最多的麻醉劑如異氟醚(isoflurane)[1]、氯氨酮(ketamine)/美托咪定[2]、氯氨酮(ketamine)/甲苯噻嗪[3]、戊巴比妥鈉(pentobarbital sodium)[4]等在靜脈給藥麻醉時(shí)通常會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物體溫降低[5]或?qū)е率湛s壓改變[6]等情況而影響鼠尾出血量，本方法在滿足動(dòng)物福利的基礎(chǔ)上采用乙醚對(duì)小鼠進(jìn)行吸入麻醉，以最大限度減少麻醉劑對(duì)凝血參數(shù)的影響。鼠尾切口的選擇常按照距離尾尖2 mm～20 mm[4,7-9]、鼠尾直徑(3 mm)[10]處剪斷，或是只選擇性切斷尾部靜脈[11]，本方法通過嚴(yán)格控制小鼠體質(zhì)量達(dá)到盡量縮小鼠尾個(gè)體間差異，而5 mm剪尾位置的確定可以保證小鼠具有足量可供檢測(cè)的出血量外，不會(huì)對(duì)其生命或者健康造成影響。剪尾后觀察出血情況是將鼠尾平放于桌面或是將其垂直放入37℃生理鹽水[12,13]中，除了維持一個(gè)恒定的環(huán)境溫度外，還利于血液的收集，37℃水浴條件下觀察與室溫平放鼠尾觀察相比，前者可顯著縮短出血時(shí)間[14]，因此在室溫條件下收集血液、觀察出血時(shí)間可能比較接近自然創(chuàng)傷后出血和止血的生理過程。

采用濾紙浸潤面積[15]和濾紙稱重法來估算[16]出血量比較粗略。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠血液裂解液樣品在418 nm吸光度值的方法可以大大提高檢測(cè)精確性，并不同于文獻(xiàn)報(bào)道[17,18]的在550 nm左右進(jìn)行吸光度檢測(cè)的方法。為了達(dá)到出血量的大樣本檢測(cè), 降低方法對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備的要求, 作者探索了利用96孔板酶標(biāo)儀的現(xiàn)有波長(zhǎng)組合酶標(biāo)儀450 nm/630 nm雙波長(zhǎng)來代替418 nm檢測(cè)的吸光度值, 標(biāo)準(zhǔn)樣品在兩個(gè)吸光度條件下標(biāo)準(zhǔn)曲線可以較好重疊，并達(dá)到良好線性結(jié)果, 使血液檢測(cè)量可以達(dá)微升級(jí)。究其原因，450 nm波長(zhǎng)與418 nm波長(zhǎng)相接近, 用630 nm波長(zhǎng)抵消一部分背景之后，恰好能滿足418 nm波長(zhǎng)檢測(cè)的需要，這一推測(cè)已在實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證。

各研究者判定出血終點(diǎn)以出血時(shí)間不長(zhǎng)于30 min[4]、60 min[19]或者30 s內(nèi)不出現(xiàn)反復(fù)出血為出血終止，而絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)方法中并沒有對(duì)出血終止的判定方法加以準(zhǔn)確說明。實(shí)際操作中, 對(duì)出血終點(diǎn)的判定往往不是特別清晰，小鼠由于個(gè)體差異會(huì)出現(xiàn)停止出血后再出血, 甚至多次反復(fù)出血的情況, 使出血時(shí)間指標(biāo)浮動(dòng)性變大，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。本方法將出血量與出血時(shí)間檢測(cè)相結(jié)合，以出血量判定出血時(shí)間。由于血液定量方法在檢測(cè)＞1 μL血液樣品時(shí)準(zhǔn)確性較高, 因此人為規(guī)定將鼠尾間隔2 min內(nèi)出血量＜1 μL的階段判定為出血終止，并用生存分析法對(duì)小鼠出血時(shí)間進(jìn)行顯著性差異分析。此方法可以很好代替?zhèn)鹘y(tǒng)精確測(cè)量出血時(shí)間的方法，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法的調(diào)整也可以更科學(xué)分析出血時(shí)間不屬于正態(tài)分布的時(shí)間相關(guān)數(shù)據(jù)。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中曾證實(shí)[20]蘇靈可以使小鼠剪尾出血時(shí)間和兔凝血時(shí)間顯著縮短，因此蘇靈可作為陽性藥物進(jìn)行方法學(xué)比較。結(jié)果顯示，能夠顯著縮短出血量和出血時(shí)間劑量的蘇靈并不能顯著縮短小鼠凝血時(shí)間，因此凝血時(shí)間指標(biāo)和出血時(shí)間(出血量)指標(biāo)的敏感性顯而易見。

然而，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法只能是對(duì)藥物藥效進(jìn)行一個(gè)初步的預(yù)判，不能代表藥物在人體的真實(shí)作用。因此應(yīng)該謹(jǐn)慎對(duì)待動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種屬類別、檢測(cè)指標(biāo)、檢測(cè)方法等多方面進(jìn)行考慮和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以求最大限度預(yù)測(cè)藥物對(duì)人體的作用。

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Improvement on Tail Tip Bleeding Model in Mice

TIAN Jing, CUI Qing-hua, GUO Ping, ZHANG Zhi-xiao, FENG Zi-liang, ZHENG Ying, FAN Quan-shui
( Institute of Military Medical, Chengdu Military Region’s Center for Disease Control & Prevention, Kunming 650032, China)

Objective The application of tail tip bleeding model in mice was explored to evaluate the hemostatic activity of some coagulation components. Method This tail tip bleeding model improved to be used as a trauma model in the aspect of coagulant evaluation was compared with the traditional operation process. The new method was established for fast quantitative detection of the blood loss and decided the bleeding time from the starting point when the tail was cut off to the end point when the blood loss was less than 1 μL in two minutes intervals. Saculin approved as a coagulant drug on sale in domestic market was used to verify the effectiveness of this assay. The sensitivity between coagulate time and blood loss (or bleeding time) is also compared in mice. Results The advanced tail tip bleeding model in mice can quantitative analysis blood loss and bleeding time in order to reduce the personal error to a great extent. This model is easy to use and can simulate the process of trauma properly. Conclusion The tail tip bleeding model in mice can reflect the action of the coagulant drug sensitively, which is a useful tool for screening and assessment of coagulants.

Tail tip bleeding model; Mice; Simulated trauma; Blood loss; Bleeding time

Q95-33

A

1674-5817(2016)06-0040-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.01.009

2016-08-08

全軍醫(yī)學(xué)科技青年培育項(xiàng)目(14QNP055)

田 靖(1982-), 女, 博士, 主治醫(yī)師, 從事生物毒素及其機(jī)制的研究。

E-mail: tianjing1980s@126.com

鄭 穎, 女, 博士, 主任醫(yī)師, 研究方向: 藥學(xué)和生物毒素學(xué)。E-mail: zhengyingcdc@163.com

范泉水, 男, 博士, 主任醫(yī)師, 研究方向: 病毒學(xué)和生物毒素學(xué)。E-mail: fqs168@126.com