鈉泵功能改變及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷中的作用*

王海華, 王海珍， 史 娜， 王竹青， 王耀軍， 周萍萍， 王 靜

(1. 皖南醫(yī)學院1生理學教研室， 2. 臨床醫(yī)學系， 安徽 蕪湖 241002)

鈉泵功能改變及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷中的作用*

王海華1△, 王海珍1， 史 娜1， 王竹青2， 王耀軍2， 周萍萍1， 王 靜1

(1. 皖南醫(yī)學院1生理學教研室， 2. 臨床醫(yī)學系， 安徽 蕪湖 241002)

目的：探討鈉泵活性改變及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)在大鼠離體心臟再灌損傷中的作用及其機制。方法：將60只雄性SD大鼠隨機分為6組(n=10)：正常對照組(NC組)、缺血/再灌損傷組(I/R組)、哇巴因-缺血/再灌損傷組(OUA-I/R組)、地高辛抗血清-缺血/再灌損傷組(Anti-Dig-I/R組)、Src抑制劑PP2-哇巴因-缺血/再灌損傷組(PP2-OUA-I/R組)、PLC抑制劑U73122-哇巴因-缺血/再灌損傷組(U73122-OUA-I/R組)。建立全心缺血30 min，再灌注120 min的Langendorff大鼠離體心臟缺血再灌損傷模型。檢測各組相同時間點心功能恢復率、冠脈流出液中乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)活性，心肌中Na+-K+-ATP酶活性和鈣離子水平。流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡率，Western blot檢測心肌鈉泵α1亞基、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)及凋亡蛋白Bcl-2/Bax的表達。結(jié)果：與I/R組相比，給予哇巴因預處理可使心功能恢復率明顯下降，心肌酶漏出增多，Na+-K+-ATP酶的活性降低，心肌細胞內(nèi)鈣水平升高，細胞凋亡率增多，心肌鈉泵α1亞基和Bcl-2表達降低，GRP78、CHOP和Bax表達升高；而Anti-Dig-I/R組與I/R組相比各指標均明顯改善；給予Src抑制劑PP2或PLC抑制劑U73122后，哇巴因?qū)π募〉膿p傷作用被部分阻斷，表現(xiàn)為心功能恢復率升高，心肌酶漏出減少，Na+-K+-ATP酶的活性明顯恢復，Ca2+水平下降，細胞凋亡率下降，心肌鈉泵α1亞基和Bcl-2表達增多，GRP78和Bax表達減少。結(jié)論：鈉泵功能改變和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激共同參與大鼠離體心臟缺血再灌損傷，鈉泵通路(Src和PLC)介導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是引起大鼠離體心臟缺血再灌損傷細胞凋亡機制之一。

鈉泵；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激；離體心臟；缺血/再灌注；細胞凋亡；大鼠

【DOI】 10.12047/j.cjap.5428.2017.010

心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)損傷是影響臨床再灌注療效的一個重要因素，進一步明確其發(fā)病機制，減少心肌I/R損傷，是現(xiàn)代心臟病學研究的熱點之一。鈉泵又稱Na+-K+-ATP酶，是三聚體膜蛋白，α亞基為催化亞基單位，β亞基為調(diào)節(jié)亞基單位，γ亞基是FXYD蛋白家族成員之一，可以調(diào)節(jié)Na+-K+-ATP酶同細胞內(nèi)Na+和細胞外K+的親和力。鈉泵α亞基調(diào)節(jié)酶的催化活性，也是強心苷的結(jié)合位點[1]。鈉泵除了離子泵功能外，它還是一種重要的細胞受體，與強心苷類物質(zhì)結(jié)合后，可活化酪氨酸蛋白激酶(sarcoma,Src), 磷脂酶C-γ(phospholipase C，PLC)信號轉(zhuǎn)導通路，從而誘導細胞凋亡或改變細胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)[2,3]。Huang H[4]等發(fā)現(xiàn)與正常組相比，局灶性腦缺血再灌注過程中Na+-K+-ATP酶的活性顯著下降，而且鈉泵活性的抑制可能參與了Bcl-2/Bax比例失衡及神經(jīng)元細胞凋亡的過程。Nawada R[5]等發(fā)現(xiàn)缺血預處理改善心肌細胞I/R損傷與增加鈉泵的活性有關(guān)。國內(nèi)學者研究發(fā)現(xiàn)，慢性間歇性低壓低氧可增加鈉泵的活性、上調(diào)鈉泵α亞基表達對豚鼠心肌細胞I/R損傷起保護作用，鈉泵抑制劑削弱了慢性間歇性低壓低氧對心肌細胞I/R損傷的保護作用[6]。

細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成及合成后折疊等[7]。各種原因，如缺氧、氧化應激和脂質(zhì)過氧化等均可導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白積聚或細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)[8,9]。ERS激活的信號通路未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)與心肌I/R損傷的發(fā)病密切相關(guān)[10]。心肌I/R時的氧化應激、Ca2+超載及氧自由基生成等均可以誘導ERS[11]。持續(xù)的ERS可以通過激活下游的信號通路誘導細胞凋亡，如誘導C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)表達或活化c-jun氨基末端激酶(c Jun N-terminal kinases, JNK)，從而抑制抗凋亡基因Bcl-2，使得Bcl-2/Bax對抗失衡，導致細胞凋亡[12,13]。

文獻報道鈉泵α亞基可直接與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)三磷酸肌醇受體(inositol triphosphate acceptor, IP3R)相互作用[14]。沉默鈉泵α1亞基使IP3R重新分布，影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放；過表達鈉泵α1亞基能恢復IP3R分布，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+信號[15]。Saini-Chohan等報道抑制心肌細胞鈉泵導致細胞內(nèi)Ca2+增加與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有關(guān)[16]。鈉泵損傷與ERS均參與了心肌I/R損傷過程的發(fā)生發(fā)展，二者有何內(nèi)在聯(lián)系，鮮有文獻報道。本文通過復制大鼠離體心臟再灌損傷模型，探討鈉泵功能改變和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在心肌I/R損傷的相關(guān)性，為心肌I/R損傷防治提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組與處理

60只SD雄性大鼠(240±20)g購自合肥蜀山實驗動物中心，合格證號：SCXK(蘇)2009-0001。分成6組(n=10)：(1)正常對照組(NC組)：大鼠心臟富氧K-H液灌流210 min；(2)缺血/再灌損傷組(I/R組)：大鼠心臟富氧K-H液預灌60 min，缺血30 min，富氧K-H液再灌120 min；(3)哇巴因-缺血/再灌損傷組(OUA-I/R組)：大鼠心臟富氧K-H液預灌30 min，富氧含哇巴因(10 μmol/L)K-H液灌流30 min，其余步驟同I/R組；(4)地高辛抗血清-缺血/再灌損傷組(Anti-Dig-I/R組)：大鼠心臟富氧K-H液預灌30 min，富氧含地高辛抗血清(10 nmol/L) K-H液預灌30 min，其余步驟同I/R組；(5)Src抑制劑PP2-哇巴因-缺血/再灌損傷組(PP2-OUA-I/R組)：大鼠心臟富氧K-H液預灌10 min，富氧含PP2(1 μmol/L) K-H液灌流灌流20 min，其余步驟同OUA-I/R組；⑹PLC抑制劑U73122組-哇巴因-缺血/再灌損傷組(U73122-OUA-I/R組)：大鼠心臟富氧K-H液預灌10 min，富氧含U73122(10 μmol/L) K-H液灌流灌流20 min，其余步驟同OUA-I/R組。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑與儀器 哇巴因為白色粉末，購自美國Sigma公司，將其溶解至無水乙醇中配成10-3mol/L的母液，-20℃避光保存以備用[14]；地高辛抗血清(兔抗anti-digoxin Whole serum) 購自北京邦定泰克生物技術(shù)有限公司，Na+-K+-ATP酶酶聯(lián)免疫試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、鈣測定試劑盒、Na+-K+-ATP酶試劑盒購自南京建成生物工程研究所，鈣熒光探針(Fluo-3,AM)、Annexin V-FITC(細胞凋亡檢測試劑盒)購自北京泛博生物化學有限公司，Na+-K+-ATPase α1抗體購自美國Santa cruz公司，Rabbit-Anti-GAPDH，Lot NO.10A46、Bcl-2 Antibody、Bax Antibody、CHOPAntibody和GRP78 Antibody購自博士德生物工程有限公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)購自合肥博美生物科技有限責任公司。Medlab-U/8c生物信號采集系統(tǒng)和Langendorff灌流裝置(南京美易有限公司)；UV-3200PCS可見紫外分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；D3024R高速微量冷凍離心機；美國賽默飛Multiskan GO全自動酶標儀；倒置熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)、Model-680型酶標儀、Western blot全套設(shè)備(美國Bio-Rad公司)、SK-1型快速混勻器(江蘇金壇市榮華儀器制造廠)、DYY-2D型電泳儀(北京市六一儀器廠)、熒光化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(上海勤翔科學儀器有限公司)、ACEA NovoCyteTM流式細胞儀(美國艾森生物公司)。

1.2.2 離體心臟缺血/再灌注損傷模型的建立 開胸取大鼠心臟，恒溫(37℃)、恒壓(8.33 kPa)，以富氧(充以95% O2和5% CO2飽和氣體)K-H液于Langendorff灌流裝置上行主動脈逆灌，通過自制乳膠小球囊從左心耳置入左心室，經(jīng)壓力換能器檢測心室內(nèi)壓變化，實驗前調(diào)節(jié)左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)在0～10 mmHg為準，待心跳節(jié)律及心功能指標穩(wěn)定后開始實驗，灌流順序為富氧K-H液灌流60 min(預灌)，全心停灌30 min(缺血)，富氧K-H液再灌流120 min(復灌)。

1.2.3 心功能指標及冠脈流出液生化指標檢測 經(jīng)生物信號采集處理系統(tǒng)分別記錄預灌穩(wěn)定點，缺血期，再灌5 min、15 min、30 min、60 min、90 min、120 min時間點心率(heart rate，HR)、左室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure，LVDP)和左室內(nèi)壓最大上升/下降速率(maximal rise/fall rate of left ventricular pressure，±dp/dtmax)，以穩(wěn)定點心功能指標值為基礎(chǔ)值(100%)，缺血期及再灌各時點心功能值與其基礎(chǔ)值相比，計算其恢復率。同時分別收集上述各時間點冠脈流出液，檢測其中LDH和CK活性的變化。

1.2.4 心肌鈣水平及Na+-K+-ATP酶活性的檢測 各組心臟灌注完畢，取心尖部組織，稱重0.2 g，與預冷的勻漿介質(zhì)(Tris 1.21 g/L，EDTA 37.23 mg/L，蔗糖34.2 g/L，再以200 mmol/L的HCl滴定至pH 7.4)1∶9配比，制備10%的心肌勻漿，超速冷凍離心10 min，取上清液置保存于-20℃冰箱，用于檢測各組心肌Na+-K+-ATP酶活性。

1.2.5 心肌細胞內(nèi)鈣離子水平及細胞凋亡檢測 各組心臟灌注完畢，用無鈣臺式液[(mmol/L):NaCl 115, KCl 5.4, MgCl21, NaH2PO41, HEPES 5, glucose 10, 以NaOH調(diào)整pH 7.4]灌流5 min停搏心臟，灌注心肌消化酶(0.4 mg/ml的II型膠原酶、0.04 mg/ml的胰蛋白酶)循環(huán)灌注約20 min。心肌消化酶灌注結(jié)束,在臺式液中剪碎心肌并逐級復鈣,用 200目濾網(wǎng)濾過 ,室溫下保存至少1 h后，吸取急性分離后的心肌細胞懸液, 種植于培養(yǎng)皿中進行實驗。利用Fluo-3AM檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。按照Annexin V-FITC/PI 雙染法凋亡試劑盒說明，采用流式細胞術(shù)檢測心肌細胞凋亡率。

1.2.6 Western blot分析 各組心臟灌注完畢，用含蛋白酶抑制劑的裂解液裂解后提取細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，按每孔加入約50 μg蛋白的上樣量加樣，進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h。一抗[Na+/K+-ATPase α1抗體稀釋濃度(1∶200)；GRP78抗體稀釋濃度(1∶200)；GAPDH抗體稀釋濃度(1∶500)； Bcl-2抗體稀釋濃度(1∶500)；BAX 抗體稀釋濃度(1∶500)]4℃孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化酶標記羊抗兔二抗(1∶2 000)室溫下孵育 2 h，洗膜后 ECL 試劑顯影，用凝膠成像系統(tǒng)攜帶的白色光源拍照，用Quantity One生物圖像處理軟件進行灰度分析，以GAPDH蛋白條帶作內(nèi)參照。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。組間比較用單因素方差分析(One way ANOVA)，兩兩比較用S-N-K法，采用Graph Pad prism 5 軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 鈉泵功能改變對大鼠離體心臟I/R損傷心功能的影響

預灌穩(wěn)定點各心功能指標組間無顯著差異；除NC組外，缺血30 min，各組的LVDP、HR、+dp/dtmax、-dp/dtmax均顯著下降(P<0.01)；同NC組相比，再灌各時間點，I/R組大鼠心功能恢復率明顯低下(P<0.01)；同I/R組相比，OUA-I/R組、PP2-OUA-I/R組、U73122-OUA-I/R組的心功能恢復率均明顯降低, Anti-Dig-I/R組則顯著升高(P<0.01)；與 OUA-I/R組相比，PP2-OUA-I/R組、U73122-OUA-I/R組再灌注過程中的心功能恢復率明顯改善(P<0.01，表1-3)。

GroupStabilizingpointIschemia 30min Reperfusion5min15min30min60min90min120minNC100100.70±0.9697.59±1.7395.29±2.2793.42±2.3089.87±2.0485.72±2.5182.64±2.85I/R1006.62±0.53**46.58±4.02**56.37±4.55**59.64±3.82**56.33±5.01**45.26±3.79**36.47±5.42**OUA-I/R1006.12±0.51**32.90±2.61**##44.53±1.31**##43.07±2.21**##30.80±1.67**##22.48±1.41**##18.07±1.30**##Anti-Dig-I/R1006.32±0.73**57.44±2.20**##73.47±3.93**##79.04±1.98**##79.98±2.31**##73.17±2.58**##66.07±3.53**##PP2-OUA-I/R1006.13±0.62**40.77±1.48**##△△51.40±1.25**##△△49.13±1.18**##△△39.67±2.11**##△△32.41±2.80**##△△25.67±1.13**##△△U73122-OUA-I/R1005.99±0.21**37.97±1.50**##△△47.76±1.91**##△△47.15±1.43**##△△36.25±1.75**##△△30.46±2.54**##△△23.54±2.18**##△△

NC: Normal control group; I/R: Ischemia/reperfusiongroup; OUA-I/R: Ouabain-I/R group; Anti-Dig-I/R: Anti-digoxin antiserum-I/R group; PP2-OUA-I/R: PP2 (Src kinase inhibitor)-ouabain-I/R group; U73122-OUA-I/R: U73122 (PLC inhibitor)-ouabain-I/R group; LVDP: Left ventricular developed pressure; HR: Heart rate

**P<0.01vsNC group;###P<0.01vsI/R group;#△△P<0.01vsOUA-I/R group

GroupStabilizingpointIschemia 30min Reperfusion5min15min30min60min90min120minNC100101.07±1.1698.43±2.2394.24±1.7890.18±1.6785.85±1.8583.88±1.1179.88±0.59I/R1006.29±0.39**44.25±1.79**53.57±1.46**58.95±1.42**54.73±1.24**47.76±1.69**41.40±2.16**OUA-I/R1005.73±0.38**32.40±2.56**##40.46±1.96**##43.16±1.56**##39.35±2.06**##33.87±2.56**##30.40±2.58**##Anti-Dig-I/R1005.85±0.40**52.63±2.34**##59.01±3.90**##66.90±1.93**##64.86±1.06**##60.59±1.67**##57.07±0.91**##PP2-OUA-I/R1005.90±0.18**38.15±1.64**##△△47.21±1.91**##△△49.47±3.11**##△△46.92±1.30**##△△40.20±2.58**##△△35.25±0.77**##△△U73122-OUA-I/R1005.88±0.12**36.42±1.90**##△△44.81±1.78**##△△47.26±1.16**##△△43.92±0.98**##△△37.86±1.65**##△△33.53±1.04**##△△

+dp/dtmax: Maximal rise rate of left ventricular pressure

**P<0.01vsNC group;###P<0.01vsI/R group;#△△P<0.01vsOUA-I/R group

GroupStabilizingpointIschemia 30min Reperfusion5min15min30min60min90min120minNC10099.92±1.7797.41±2.9094.33±3.0087.96±2.2084.35±2.2281.61±2.4177.56±2.25I/R1005.95±0.39**42.90±1.06**51.80±2.28**59.59±2.04**56.11±1.51**49.63±2.51**44.33±3.04**OUA-I/R1005.73±0.25**32.60±1.894**##41.31±1.48**##41.45±1.68**##38.83±1.20**##34.55±2.12**##30.19±2.26**##Anti-Dig-I/R1005.76±0.30**52.77±1.73**##62.80±2.70**##74.71±2.96**##74.32±2.15**##71.17±1.99**##65.40±2.38**##PP2-OUA-I/R1006.02±0.18**##△△38.75±0.93**##△△46.65±1.75**##△△47.53±1.32**##△△45.70±1.48**##△△43.08±1.17**##△△39.03±1.62**##△△U73122-OUA-I/R1005.98±0.15**##△△36.39±1.41**##△△45.27±0.85**##△△45.44±1.45**##△△42.72±1.40**##△△40.41±1.54**##△△36.80±1.42**##△△

-dp/dtmax: Fall rate of left ventrxcular pressure

**P<0.01vsNC group;###P<0.01vsI/R group;#△△P<0.01vsOUA-I/R group

2.2 冠脈流出液中乳酸脫氫酶及肌酸激酶活性的組間變化

預灌穩(wěn)定點各組冠脈流出液中LDH及CK水平均無明顯差異；除NC組外，缺血30 min，各組冠脈流出液中 LDH及CK漏出明顯增多(P<0.01)；同NC組相比，再灌注期間，I/R組冠脈流出液中 LDH及 CK水平顯著升高(P<0.01)；同 I/R組相比，OUA-I/R組、PP2-OUA-I/R組、U73122-OUA-I/R組冠脈流出液中 LDH及 CK水平均明顯下降, Anti-Dig-I/R組則明顯升高(P<0.01)；與 OUA-I/R組相比，PP2-OUA-I/R組、U73122-OUA-I/R組冠脈流出液中LDH及CK水平明顯升高(P<0.01，表4、表5)。

2.3 大鼠心肌Na+-K+-ATP酶的活性、線粒體Ca2+濃度及細胞鈣離子活性的組間變化

與NC組相比，I/R組心肌組織中Na+-K+-ATP酶活性明顯降低，心肌線粒體內(nèi)Ca2+濃度明顯升高(P<0.01)；同I/R組相比，OUA-I/R組、PP2-OUA-I/R組、U73122-OUA-I/R組Na+-K+-ATP酶的活力均明顯降低,心肌線粒體內(nèi)Ca2+濃度明顯升高, Anti-Dig-I/R組Na+-K+-ATP酶的活力明顯升高，線粒體內(nèi)Ca2+濃度則明顯下降(P<0.01)；與 OUA-I/R組相比，PP2-OUA-I/R組、U73122-OUA-I/R組Na+-K+-ATP酶的活力明顯升高，心肌線粒體內(nèi)Ca2+濃度明顯下降(P<0.05，P<0.01)；與NC組比，I/R組熒光強度增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與 I/R 組比，OUA-I/R組、PP2-OUA-I/R組、U73122-OUA-I/R組均熒光強度明顯增強, Anti-Dig-I/R組則明顯減弱(P<0.01)；與 OUA-I/R組相比，PP2-OUA-I/R組、U73122-OUA-I/R組熒光強度明顯減弱(P<0.01，表6)。

GroupStabilizingpointIschemia 30min Reperfusion5min15min30min60min90min120minNC20.37±1.9321.52±1.2020.99±2.6622.59±2.2222.99±2.2424.46±2.3323.77±2.1524.02±1.96I/R22.11±0.7863.67±2.21**119.81±2.54**79.03±3.29**77.24±2.31**74.57±2.12**60.10±2.72**45.86±3.01**OUA-I/R21.05±1.4862.78±2.73**165.28±5.84**##108.94±5.21**##102.79±3.99**##98.48±2.86**##88.76±4.17**##75.67±3.49**##Anti-Dig-I/R21.52±0.5760.89±4.76**95.21±4.00**##66.97±2.38**##66.54±2.61**##61.61±4.00**##47.78±3.29**##33.98±2.15**##PP2-OUA-I/R21.73±1.4263.47±3.77**140.66±1.75**##90.94±1.64**##89.52±1.50**##85.16±1.77**##72.37±1.20**##59.32±1.17**##U73122-OUA-I/R19.97±1.1364.16±2.69**147.49±5.86**##95.06±1.24**##91.78±1.58**##88.24±1.45**##75.98±3.40**##63.53±2.82**##

LDH: Lactate dehydrogenase

**P<0.01vsNC group;###P<0.01vsI/R group;#△△P<0.01vsOUA-I/R group

GroupStabilizingpointIschemia 30min Reperfusion5min15min30min60min90min120minNC21.45±1.1321.43±1.2422.81±1.0022.67±1.25222.82±1.9823.03±2.3523.55±2.4222.46±2.68I/R21.29±1.5645.03±2.89**89.51±2.34**73.15±2.86**66.15±1.77**54.09±1.86**48.00±3.11**41.90±1.56**OUA-I/R21.06±1.3947.07±4.60**113.83±3.50**##102.38±3.79**##95.78±2.66**##83.76±2.66**##74.88±3.15**##62.88±2.75**##Anti-Dig-I/R20.48±1.045.45±2.76**73.51±3.15**##61.79±1.75**##54.14±2.57**##44.70±1.70**##39.25±1.43**##33.12±1.53**##PP2-OUA-I/R20.52±1.5445.02±3.20**101.15±2.38**##△△91.51±1.28**##△△83.58±2.33**##△△70.07±1.33**##△△61.76±3.15**##△△52.17±3.68**##△△U73122-OUA-I/R20.96±1.2946.65±3.12**104.78±3.17**##△△94.14±1.81**##△△86.92±3.87**##△△72.46±2.85**##△△65.25±3.44**##△△55.49±2.18**##△△

CK: Creatin Kinase

**P<0.01vsNC group;###P<0.01vsI/R group;#△△P<0.01vsOUA-I/R group

GroupNa+-K+-ATPase(ng/ml)Ca2+c(mmol/g·prot)FluorescenceintensityofCa2+NC22.01±2.170.57±0.0617.85±1.28I/R13.75±0.92**1.37±0.08**38.57±1.32*OUA-I/R9.48±0.43##1.95±0.07##56.92±1.39##Anti-Dig-I/R16.25±0.53##1.07±0.04##△30.26±2.41##PP2-OUA-I/R11.66±0.53##△△1.64±0.08△△40.98±1.73##△△U73122-OUA-I/R10.98±0.72##△1.70±0.07△47.00±1.47##△△

*P<0.05,**P<0.01vsNC group;###P<0.01vsI/R group;#△P<0.05,△△P<0.01vsOUA-I/R group

2.6 流式細胞術(shù)檢測心肌細胞凋亡

與NC組比，I/R組心肌細胞凋亡率明顯升高(P<0.01)；與 I/R 組比，OUA-I/R組、PP2-OUA-I/R組、U73122-OUA-I/R組心肌細胞凋亡率均明顯升高, Anti-Dig-I/R組則明顯降低(P<0.01)；與 OUA-I/R組相比，PP2-OUA-I/R組、U73122-OUA-I/R組凋亡細胞所占比例明顯降低(P<0.01，圖1)。

2.7 鈉泵α1亞基、GRP78、CHOP及凋亡蛋白Bcl-2/Bax表達的組間變化

Westen blot結(jié)果顯示：同NC組相比，I/R組心肌鈉泵α1亞基和Bcl-2表達明顯下降，GRP78、CHOP和Bax表達明顯升高(P<0.01)；同I/R組相比，OUA-I/R組、PP2-OUA-I/R組、U73122-OUA-I/R組心肌鈉泵α1亞基和Bcl-2表達降低, GRP78、CHOP和BAX表達升高；而 Anti-Dig-I/R組心肌鈉泵α1亞基和Bcl-2表達升高，GRP78、CHOP和Bax表達降低，差異顯著(P<0.01)；與OUA-I/R組相比，PP2-OUA-I/R組、U73122-OUA-I/R組心肌鈉泵α1亞基和Bcl-2表達升高(P<0.01)，GRP78、CHOP和Bax表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，表7，圖2)。

Groupα1/GAPDHGRP78/GAPDHCHOP/GAPDHBax/GAPDHBcl-2/GAPDHNC0.47±0.021.01±0.100.44±0.050.42±0.041.12±0.02I/R0.22±0.01**1.51±0.07**0.77±0.07**0.84±0.05**0.86±0.04**OUA-I/R0.10±0.01##2.08±0.06##1.11±0.06##1.32±0.06##0.59±0.06##Anti-Dig-I/R0.30±0.01##1.19±0.06##0.54±0.06##0.68±0.04##0.96±0.06##PP2-OUA-I/R0.16±0.01##△△1.75±0.07##△△0.87±0.07##△△1.09±0.03##△△0.76±0.05##△△U73122-OUA-I/R0.16±0.01##△△1.79±0.10##△△0.91±0.05##△△1.10±0.04##△△0.75±0.04##△△

**P<0.01vsNC group;###P<0.01vsI/R group;#△△P<0.01vsOUA-I/R group

3 討論

哇巴因[17]可與鈉泵的特異性位點可逆性結(jié)合，抑制其活性，但其對鈉泵的抑制作用與濃度有關(guān)，哇巴因有效控制心衰的血清游離濃度約為 1～10 nmol/L，而抑制 Na+-K+-ATP酶的濃度則遠遠大于10 nmol/L[18]，預實驗結(jié)果顯示高濃度哇巴因(10-6-10-4mol/L)灌流離體心臟30 min 后鈉泵活性明顯抑制，濃度10-4mol/L的哇巴因可使離體心臟持續(xù)室顫甚至停跳，哇巴因(10-5mol/L)為實驗選擇濃度。除了從植物提取和動物體內(nèi)獲得的強心苷類化合物外，人和動物體內(nèi)也會通過生物合成途徑生成內(nèi)源性洋地黃類物質(zhì)[17]，研究證實體內(nèi)許多病理生理過程與其密切相關(guān)[19]。亦有實驗表明,急性心肌梗死大鼠，血漿及心肌組織中內(nèi)洋地黃水平顯著增加, 心肌膜ATP酶活性明顯下降，地高辛抗血清能起到明顯拮抗作用，減輕心肌I/R損傷[20]。本實驗分別采用哇巴因和地高辛抗血清，觀察其對離體心臟的鈉泵功能影響，旨在探討鈉泵功能改變和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在離體心臟I/R損傷的內(nèi)在聯(lián)系及其可能機制。

GRP78又稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標志分子，早期ERS時GRP78與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)誤折疊及未折疊蛋白結(jié)合，減輕ER負荷，恢復其穩(wěn)態(tài)[21]。CHOP則是ERS反應中重要的凋亡信號轉(zhuǎn)錄因子，ERS時表達增加[22]，可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達誘導細胞凋亡，Bcl-2與Bax是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的下游信號分子，在JNK和CHOP的激活下，Bcl-2/Bax對抗失衡，從而誘導細胞凋亡[23]。同NC組相比，I/R組心肌鈉泵α1亞基和Bcl-2表達明顯下降，GRP78、CHOP和Bax表達明顯升高，同I/R組相比，OUA-I/R組、PP2-OUA-I/R組、U73122-OUA-I/R組心肌鈉泵α1亞基和Bcl-2表達降低, GRP78、CHOP和Bax表達升高，表明心肌I/R損傷的過程中，鈉泵功能改變和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及其凋亡通路均參與其中。

在鈉泵相關(guān)的通路(Src和PLC)中，鈉泵的α1亞基和Src之間至少是兩個位點的結(jié)合，α1亞基的CD2和CD3(CD2 和CD3分別位于的α1亞基A結(jié)構(gòu)域和N結(jié)構(gòu)域)分別與Src的 SH2和SH3結(jié)合[21]。Haas 等[23]觀察到被哇巴因活化的Src可以和EGFR胞內(nèi)區(qū)結(jié)合，并激活絲裂原激活的蛋白激酶，募集SH2包含蛋白(Shc)、Ras等調(diào)節(jié)蛋白至質(zhì)膜，進而活化Ras/Raf/MEK/ERK級聯(lián)反應。Haijiang Wu等[24]發(fā)現(xiàn)給予Src抑制劑PP2或p38MAPK抑制劑可以通過抑制CHOP的表達及上調(diào)Bcl-2/Bax來明顯減輕腎小管上皮細胞的凋亡；Ann L等[25]發(fā)現(xiàn)，PLC通路的激活可以通過IP3R使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣穩(wěn)態(tài)失衡，從而通過死亡受體及細胞色素c等通路介導細胞凋亡。文中給予Src通路抑制劑PP2和PLC通路抑制劑U73122后，PLC及U73122均部分阻斷了哇巴因?qū)︹c泵的抑制作用，表現(xiàn)為心功能恢復率升高，鈣超載現(xiàn)象明顯減輕，心肌細胞凋亡率改善，Na+-K+-ATP酶的活性和鈉泵α1亞基的表達均明顯升高，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志蛋白GRP78和CHOP表達下降，促凋亡因子Bax蛋白表達顯著下降，抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達顯著升高。表明鈉泵功能改變和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激共同參與大鼠離體心臟缺血再灌損傷，提示鈉泵通路(Src和PLC)介導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是引起大鼠離體心臟I/R損傷細胞凋亡的可能機制之一。

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Role of changes in sodium pump activity and endoplasmic reticulum stress in the ischemia/reperfusion induced injury of isolated hearts

WANG Hai-hua1△, WANG Hai-zhen1, SHI Na1, WANG Zhu-qing2, WANG Yao-jun2, ZHOU Ping-ping1, WANG Jing1

(1. Department of Physiology, 2. Department of Clinical Medicine, Wannan Medical College, Wuhu 241002, China)

Objective: To investigate the roles of change in sodium pump activity and endoplasmic reticulum stress (ERS) in ischemia/reperfusion (I/R) injury of the isolated rat hearts. Methods: Sixty male SD rats were randomly divided into 6 groups (n=10 each)：normal control group (NC), I/R group (I/R), ouabain-I/R group (OUA-I/R), anti-digoxin antiserum-I/R group (Anti-Dig-I/R), PP2 (Src kinase inhibitor)-ouabain-I/R group (PP2-OUA-I/R),U73122 (PLC inhibitor)-ouabain-I/R group (PP2-OUA-I/R). The isolated rat hearts were perfused on the Langendorff apparatus. Except for NC group, all the hearts were subjected to 30 min global ischemia and followed by 120 min reperfusion. The cardiac function indexes were recorded at the same time. The coronary effluent was collected for estimating the activity of lactate dehydrogenase (LDH) and creatine kinase (CK). The activity of Na+-K+-ATPase and intracellular calcium concentration in myocardial tissue were measured. Apoptosis was evaluated by Flow cytometric analysis. The expressions of sodium pump α1 subunit, glucose regulated protein(GRP78),C/EBP homologous protein (CHOP) and Bcl-2/Bax were determined by Western blot. Results: Pretreatment with ouabain significantly reduced the recovery of cardiac function, increased the levels of CK, LDH and intracellular calcium concentration, decreased the activity of Na+-K+-ATPase. In addition, ouabain markedly increased the myocardial apoptosis index, down-regulated the expressions of sodium pump α1subunit and Bcl-2, up-regulated the expressions of GRP78,CHOP and Bax; while these changes were significantly improved in the Anti-Dig-I/R group compared with those in the I/R group; PP2 or U73122 partially blocked the effects of ouabain on myocardial I/R injury. Compared with the OUA-IR group, the recovery of cardiac function, the activity of Na+-K+-ATPase and the expressions of sodium pump α1 subunit and Bcl-2 were significant higher, meanwhile the leakage of CK and LDH, intracellular calcium concentration, myocardial apoptosis index and the expressions of GRP78 and Bax were significantly lower in PP2-OUA-I/R and U73122-OUA-I/R group. Conclusion: Changes in sodium pump function and endoplasmic reticulum stress all participate in the process of I/R injury. Current findings further suggest that sodium pump mediates ERS by activating signals of Src and PLC pathway, which may be one of the mechanisms of apoptosis induced by I/R injury.

sodium pump; endoplasmic reticulum stress; ischemia/reperfusion injury; isolated heart; apoptosis; mouse

安徽省高校省級科學研究重點項目(KJ2016A729，KJ2013A251)；安徽省級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(AH201310368107)；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201510368009)

2016-02-06

2016-10-19

R73-3

A

1000-6834(2017)01-040-07

△【通訊作者】Tel: 13675536187； E-mail: wanghaihua9972@sina.com