長鏈非編碼RNA SPRY4-IT1對髓母細(xì)胞瘤增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的影響*

史鵬飛， 吉海龍， 羅永康， 毛天明， 陳 茜， 周開宇△

(1． 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)學(xué)院， 浙江溫州 325000； 2. 浙江省臺州市立醫(yī)院神經(jīng)外科， 3. 病理科， 臺州 318000)

長鏈非編碼RNA SPRY4-IT1對髓母細(xì)胞瘤增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的影響*

史鵬飛1， 吉海龍2， 羅永康2， 毛天明2， 陳 茜3， 周開宇1△

(1． 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)學(xué)院， 浙江溫州 325000； 2. 浙江省臺州市立醫(yī)院神經(jīng)外科， 3. 病理科， 臺州 318000)

目的：探討長鏈非編碼RNA SPRY4-IT1(LncRNA)對髓母細(xì)胞瘤增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的影響。方法：髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞分為對照組和si-SPRY4-IT1組，分別利用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000將陰性對照熒光序列和SPRY4-IT1-siRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，采用Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中SPRY4-IT1的表達(dá)情況，CCK-8實驗及平板克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖能力的變化，以細(xì)胞體外侵襲、遷移實驗分別檢測細(xì)胞侵襲、遷移能力的變化,Western blot檢測SPRY4-IT1對基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9蛋白的影響。結(jié)果：si-SPRY4-IT1組SPRY4-IT1 mRNA表達(dá)水平、細(xì)胞體外增殖能力、細(xì)胞侵襲、遷移能力、細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)均較對照組明顯降低(P<0.05)，而MMP-9蛋白表達(dá)未見明顯變化。結(jié)論：干擾長鏈非編碼RNA SPRY4-IT1在髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞中的表達(dá)能顯著抑制細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。

髓母細(xì)胞瘤；長鏈非編碼RNA(LncRNA)；SPRY4-IT1；增殖；侵襲遷移

【DOI】 10.12047/j.cjap.5441.2017.020

髓母細(xì)胞瘤是兒童小腦最常見的侵襲性胚胎性腫瘤,約占兒童小腦腫瘤的40%，顱內(nèi)腫瘤的20%[1]。由于髓母細(xì)胞瘤對放、化療敏感,腫瘤手術(shù)切除后行放、化療仍是髓母細(xì)胞瘤主要的治療方法,但過度放、化療對兒童聽力、認(rèn)知能力、內(nèi)分泌及血管系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p害并有繼發(fā)性惡性腫瘤的副作用,腫瘤遠(yuǎn)期生存率及生活質(zhì)量較差[2，3]，5年無進展長期生存率不到70%[4]。因此，深入探討髓母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制對髓母細(xì)胞瘤的早期診治及改善預(yù)后具有重要意

義。

在真核生物體內(nèi)存在著大量的無編碼蛋白能力的RNA，這些不具有編碼蛋白能力的RNA中其核苷酸鏈長度>200 nt為長鏈非編碼RNA[5](long non-coding RNA，LncRNA)。近年來關(guān)于LncRNA的研究進展迅速，SPRY4-IT1(基因號AK024556)作為LncRNA家族的一員也受到越來越多的關(guān)注，其在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移密切相關(guān)[6]，但SPRY4-IT1是否在髓母細(xì)胞瘤中也發(fā)揮著相似作用，目前尚未見相關(guān)報道。本研究旨在體外觀察SPRY4-IT1對髓母細(xì)胞瘤生物學(xué)功能的影響，為其用于臨床治療髓母細(xì)胞瘤提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞購自美國ATCC公司；siRNA(小干擾RNA序列為sense:GCUUUCUGAUUCCAAGGCCUAUUAA；Antisense：UUAAUAGGCCUUGGAAUCAGAAAGC)由上海生工公司合成；Lipofectamine 2000和RNA抽提試劑Trizol購自Invitrogen公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、OptiMate及磷酸鹽緩沖液(PBS)(Gibco)公司；Real Master Mix(SYBR Green)實時熒光定量PCR試劑盒、cDNA第1鏈合成試劑盒均(北京天根生化科技有限公司)；CCK-8試劑(日本同仁公司)；Transwell小室(3422，孔徑8.0 μm，直徑6.5 mm)(Corning公司)；Matrigel Basement Membrane Matrix (美國BD公司)；兔抗人MMP-2抗體(貨號ab37150)、MMP-9抗體(貨號ab38898)(abcam公司)；兔抗人GAPDH抗體(杭州賢至生物科技有限公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(北京索來寶生物科技有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(10% FBS)、1% 青霉素-鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基中,置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),根據(jù)具體情況換液,常規(guī)消化、傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板中。待細(xì)胞貼壁且融合度達(dá)到80%～90%時,將陰性對照熒光序列及SPRY4-IT1-siRNA分別由Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，并分別標(biāo)定為對照組和si-SPRY4-IT1組，具體操作為：取5 μl的Lipofectamine 2000和SPRY4-IT1-siRNA分別加入250 μl的OptiMate中并輕輕混勻，室溫靜置5 min后將兩種溶液混合，輕輕混勻后室溫靜置20 min；將6孔板中細(xì)胞常溫PBS漂洗2次，加入Lipofectamine 2000和SPRY4-IT1-siRNA混合液500 μl，并補足總體積為2 ml。陰性對照熒光序列轉(zhuǎn)染與SPRY4-IT1-siRNA轉(zhuǎn)染同時進行，過程全程避光，用錫箔紙包裹后置37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育6 h，隨后棄轉(zhuǎn)染液，PBS沖洗3～4次，更換正常DMEM培養(yǎng)基后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率并繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 熒光定量PCR檢測SPRY4-IT1表達(dá)量

收集轉(zhuǎn)染后24 h的各組髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞,預(yù)冷的PBS漂洗2次，按TRIzol試劑說明書提取總RNA，并用紫外分光光度計測定其A260/A280，比值在1.8～2.1之間為符合純度要求。根據(jù)第1鏈合成試劑盒說明書將提取各組RNA分別逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以GAPDH為內(nèi)參,依照熒光定量PCR試劑盒說明書配置8連管每孔20 μl反應(yīng)體系，每個標(biāo)本設(shè)3個副孔，進行熒光定量PCR擴增，具體操作程序為：首先配制反應(yīng)液：2×SuperReal PreMix Plus10 μl,正向引物0.5 μl,反向引物0.5 μl，cDNA模板2 μl，50×ROX Reference Dye 2 μl，然后加RNase-free ddH2O至20 μl。PCR反應(yīng)初始變性溫度為95℃ 3 min，95℃ 15 s，60℃ 25 s,70℃延伸25 s，40個循環(huán)。采用 2-ΔΔCt法計算每組相對表達(dá)量。引物序列如表1，均由上海生工公司合成。

Tab. 1 The sequence of SPRY4-IT 1 and GAPDH

1.4 CCK-8檢測細(xì)胞增殖

將對數(shù)期的髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞制成2×104cells/ml細(xì)胞懸液，取細(xì)胞懸液100 μl接種于96孔板中。細(xì)胞融合度達(dá)30%～50%時，參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染，對照組和si-SPRY4-IT1組每組設(shè)3個復(fù)孔，將轉(zhuǎn)染后時間設(shè)為0 h，轉(zhuǎn)染6 h后更換96孔板中的培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。CCK-8實驗分別在轉(zhuǎn)染0 h、24 h、48 h、72 h、96 h后進行。實驗前更換新的DMEM培養(yǎng)基，每孔加入10 μl CCK-8試劑，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育3 h，平板震蕩器上震蕩10 s，于酶標(biāo)儀上測對照組和si-SPRY4-IT1組細(xì)胞在450 nm處的吸光度。

1.5 平板克隆形成實驗

將轉(zhuǎn)染48 h后的對照組和si-SPRY4-IT1組細(xì)胞用PBS漂洗2次，用胰酶消化并制成細(xì)胞懸液，分別以200 cells/well接種于6孔板中，補足總體積2 ml并根據(jù)具體情況換液，2周后出現(xiàn)肉眼可見克隆時終止實驗。吸去培養(yǎng)液，PBS輕輕漂洗3次，4℃冰箱內(nèi)無水甲醇溶液固定20 min,0.1%結(jié)晶紫常溫下染色10 min后計數(shù)克隆數(shù)，顯微鏡下計算大于50個細(xì)胞的克隆數(shù)，算出克隆形成率，克隆形成率=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.6 細(xì)胞體外侵襲實驗

將Matrigel從-20℃取出，4℃解凍后置于冰上，用無血清DMEM培養(yǎng)基將matrigel稀釋至50 mg/L，按每孔50 μl加入Transwell小室的上室，超凈臺內(nèi)風(fēng)干過夜。使用前每孔加入100 μl含1%牛血清白蛋白(1%BSA)的無血清DMEM培養(yǎng)液，37℃靜置1 h后吸去小室內(nèi)液體備用。Transwell小室杯孔直徑為6.5 mm，杯底由聚碳酸脂微孔濾膜封閉(微孔孔徑為8 μm)。用無血清DMEM培養(yǎng)液重懸轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，制成濃度為3×105cells/ml的細(xì)胞懸液，分別取200 μl接種于Transwell小室的上室，下室為500 μl含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，每組3個復(fù)孔。放入37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取出，用棉簽擦掉上層細(xì)胞，0.6 ml無水甲醇溶液于4℃冰箱中固定20 min，0.1%結(jié)晶紫常溫下染色10 min，PBS沖洗4～5次。倒置顯微鏡×100視野下隨機選取5個視野拍照并計數(shù)，最終以穿膜細(xì)胞的數(shù)目代表髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞的侵襲能力。

1.7 細(xì)胞體外遷移實驗

實驗中，transwell小室上面無Matrigel包被，穿膜時間為24 h，其余操作與細(xì)胞侵襲實驗相同，倒置顯微鏡×100視野下隨機選取5個視野拍照并計數(shù)，最終以穿膜細(xì)胞的數(shù)目代表髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞的遷移能力。侵襲、遷移抑制率(%)=(1-實驗組遷移細(xì)胞數(shù)/對照組遷移細(xì)胞數(shù))×100%。

1.8 Western blot

收集轉(zhuǎn)染72 h后的6孔板內(nèi)對照組和si-SPRY4-IT1組髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞，1.5 ml離心管中1 200 r/min離心3min，棄上清液，加1ml PBS吹打均勻，1 200 r/min離心3 min，棄上清液后PBS重復(fù)洗滌1次。對照組和si-SPRY4-IT1組各加入200 μl預(yù)冷的RIPA裂解液，置于冰上20 min使其充分裂解細(xì)胞。將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中，4℃，12 000 r/min離心5 min，取上清，用BCA法檢測蛋白濃度。于樣品中加入5×SDS凝膠電泳上樣緩沖液，100℃變性10 min。制作10%分離膠和5%濃縮膠的SDS -聚丙烯酰胺凝膠，每個槽孔取30 μg蛋白上樣，凝膠電泳分離后濕轉(zhuǎn)至PVDF上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光液反應(yīng)5 min，置于曝光儀中進行檢測。

1.9 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 si-SPRY4-IT1轉(zhuǎn)染效率檢測

Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染陰性對照熒光序列6 h后，吸去6孔板內(nèi)培養(yǎng)基并用PBS沖洗3～4次，100×熒光顯微鏡下可見到細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光。隨機選擇同一視野下的白光與熒光區(qū)域，比較每個區(qū)域的細(xì)胞數(shù)并拍照，以熒光下細(xì)胞數(shù)/白光下細(xì)胞數(shù)表示轉(zhuǎn)染效率。本實驗轉(zhuǎn)染效率高達(dá)90%(圖1)。

Fig. 1 Effective of control fluorescence siRNA were transfected into medulloblastoma cell line Daoy by Lipofectamine 2000 up a: Ordinary； b： Fluorescence ×100

2.2 si-SPRY4-IT1干擾效果檢測

提取轉(zhuǎn)染后24 h的各組髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，熒光定量PCR檢測各組SPRY4-IT1表達(dá)量。si-SPRY4-IT1組細(xì)胞SPRY4-ITI表達(dá)量(0.32±0.03)與對照組(1.00)比較明顯降低(P<0.01)。

2.3 干擾SPRY4-IT1表達(dá)對髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8實驗表明，與對照組相比，si-SPRY4-IT1組髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞增殖活力明顯下降(圖2a)。24 h時si-SPRY4-IT1組細(xì)胞增殖活力開始低于對照組，96 h si-SPRY4-IT1組(OD值1.477±0.144)與對照組(OD值2.209±0.137)差異最為明顯(P<0.05)。通過克隆形成實驗進一步檢驗了干擾SPRY4-1TI的表達(dá)后髓母細(xì)胞瘤Doay細(xì)胞的克隆形成能力受到抑制。si-SPRY4-IT1組細(xì)胞的克隆形成率為(36.33±3.79)%，對照組細(xì)胞的克隆形成率為(52.00±3.00)%，si-SPRY4-ITl組細(xì)胞克隆形成率顯著低于對照組細(xì)胞(P<0.05，圖2b)，表明干擾SPRY4-ITl的表達(dá)后細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制，與CCK-8實驗結(jié)果一致。

2.4 干擾SPRY4-IT1表達(dá)對髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞侵襲遷移能力的影響

細(xì)胞體外侵襲實驗結(jié)果顯示，Daoy細(xì)胞株侵襲能力明顯受到抑制,抑制率33.95%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。細(xì)胞體外遷移實驗顯示si-SPRY4-IT1組較對照組細(xì)胞遷移能力明顯受到抑制，抑制率42.49%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表2)。

2.5 干擾SPRY4-IT1表達(dá)對髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的影響

以GAPDH蛋白為內(nèi)參，Western blot實驗檢測干擾SPRY4-IT1的表達(dá)對髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶的影響(圖3)，結(jié)果顯示，si-SPRY4-IT1組(0.40±0.05)MMP-2表達(dá)量較對照組(1.00)明顯降低(P<0.05)，而MMP-9未見明顯變化。

GroupInvasion(cells/well)Metastasis(cells/well)Inhibition(%)Control215±7273±1233.95si-SPRY4-IT1142±8**161±12**42.49

**P<0.01vscontrol group

Fig. 3 Effect of interference SPRY4-IT1 expression on MMP-2 and MMP-9 of medulloblastoma cell line Daoy 1： Control group； 2： si-SPRY4-IT1 group

3 討論

隨著大規(guī)模高通量芯片和二代測序技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)在基因組中具有編碼能力的基因不足2%，大多數(shù)基因序列轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA[7]，其中就包括長鏈非編碼RNA。與短鏈非編碼RNA相比，長鏈非編碼RNA的認(rèn)識則經(jīng)歷了漫長的過程，最初認(rèn)為長鏈非編碼RNA只是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，是RNA聚合酶2轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能[8,9]。隨著研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明長鏈非編碼RNA在多種生物學(xué)過程中扮演著重要角色，例如，HOXC基因座能轉(zhuǎn)錄一種LncRNA HOTAIR，后者可募集染色質(zhì)重構(gòu)蛋白復(fù)合物PRC2并誘導(dǎo)HOXD基因座產(chǎn)生抑制性的染色體結(jié)構(gòu)，使HOXD基因座在長達(dá)40 kb的范圍內(nèi)抑制轉(zhuǎn)錄的發(fā)生[10]，在腎透明細(xì)胞癌中干擾SPRY4-IT1的表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[11]。

SPRY4-IT1最初是在動物脂肪組織中發(fā)現(xiàn)的長度為706 bp的具有二級發(fā)夾結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄本，在人胎盤、膀胱、大腦、腎臟、肝臟、肌肉、前列腺、胸腺等多種組織中都有不同程度的表達(dá)[12，13]。Joseph Mazar等通過PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)SPRY4-IT1轉(zhuǎn)錄本起始于SPRY4基因第一個內(nèi)含子并延續(xù)到其第三個外顯子，其前體在從細(xì)胞核進入細(xì)胞質(zhì)的過程中剪切掉一個長約244 nt的核苷酸序列后才成為成熟的SPRY4-IT1，在黑色素瘤中作用于lipin家族中的lipin 2引起肉毒酰膽堿及三酰甘油等明顯增加，而作為紅細(xì)胞膜外層脂類主要成分之一的磷脂酰膽堿顯著降低，最終導(dǎo)致細(xì)胞脂毒性[14，15]。在膠質(zhì)瘤中，干擾SPRY4-IT1能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長、遷移及EMT[6]。在胃癌組織中SPRY4-IT1表達(dá)明顯高于癌周組織，且與瘤體的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，體外實驗表明下調(diào)SPRY4-IT1使胃癌細(xì)胞的侵襲遷移及增殖能力均受到抑制，并且證明SPRY4-IT1通過cyclin D1、MMP2、MMP9分別影響細(xì)胞的增殖及遷移能力[16]。以往的研究表明SPRY4-IT1扮演者“癌基因”的角色，然而，Min Xie及其同事卻發(fā)現(xiàn)SPRY4-IT1在胃癌組織中表達(dá)下降，胃癌組織中SPRY4-IT1高表達(dá)患者中位生存時間較低表達(dá)者長，其體外實驗表明SPRY4-IT1抑制胃癌細(xì)胞生長[17]。SPRY4-IT1在髓母細(xì)胞瘤中的生物學(xué)功能仍不清楚。

本研究通過特異性siRNA干擾 SPRY4-IT1在髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞株中的表達(dá)，研究結(jié)果顯示干擾SPRY4-IT1的表達(dá)可顯著抑制髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，進一步實驗表明干擾SPRY4-IT1的表達(dá)能通過MMP-2影響細(xì)胞的侵襲遷移能力。SPRY4-IT1在影響髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞信號通路(如EMT信號通路)方面的深層次機制仍不清楚，SPRY4-ITl對髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞生物學(xué)行為影響的分子機制仍需進一步研究。

綜上所述，本研究確定了SPRY4-IT1對髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞侵襲、遷移及增殖的促進作用，并通過MMP-2影響髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞的侵襲遷移能力，為髓母細(xì)胞瘤的診斷和治療提供了新的候選分子，也為進一步研究長鏈非編碼RNA對髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響奠定了基礎(chǔ)。

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Effect of long noncoding RNA SPRY4-IT1 on proliferation and metastasis of medulloblastoma

SHI Peng-fei1, JI Hai-long2, LUO Yong-kang2, MAO Tian-ming2, CHEN Xi3, ZHOU Kai-yu1△

(1. the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000; 2. Department of Neurosurgery, 3. Department of Pathology, Zhejiang Taizhou Municipal Hospital, Taizhou 318000, China)

Objective: To investigate the effects of long non-coding RNA SPRY4-IT1 (LncRNA) on proliferation and metastasis of medulloblastoma cells. Methods: SPRY4-IT1siRNA and control fluorescence siRNA were transfected into medulloblastoma cell line Daoy with Lipofectamine 2000 and were divided into control group and si-SPRY4-IT1 group. Relative expression of SPRY4-IT1 mRNA were detected by real-time quantitative PCR. The change of cell proliferation were examined using CCK-8 kit and clone forming experiment.The change of cell invasion and metastasis were examined by matrigel invasion assay and cell metastasis experiment respectively, The expression of matrix metalloproteinase MMP-2 and MMP-9 were detected by Western blot. Results: In si-SPRY4-IT1 group,the SPRY4-IT1 mRNA expression level, cell proliferation in vitro,cell invasion and migration ability, MMP-2 protein expression were significantly lower than those in the control group. Conclusion: Interference SPRY4-IT1 expression has prominent inhibitory effect on the cell proliferation、invasion and metastasis of medulloblastoma cell line Daoy.

medulloblastoma; long noncoding RNA(LncRNA); SPRY4-IT1； proliferation； invasion and metastasis

浙江省中醫(yī)藥管理局科技計劃資助項目(2013ZA133,2015ZB133)；臺州市科技局科技計劃資助項目(14SF05)

2016-03-28 【修回日期】2016-10-24

R364.3

A

1000-6834(2017)01-078-05

△【通訊作者】Tel： 13957680507； E-mail： kerry2000year@163.com