快速溶劑萃取-層析柱凈化-氣相色譜質(zhì)譜法測(cè)定土壤中對(duì)苯二甲酸二（2-乙基己基）酯含量

包蘇英，王 瑞，徐琳燕，楊 悅

（杭州中一檢測(cè)研究院有限公司,浙江 杭州 310052）

鄰苯二甲酸酯增塑劑因其生殖毒性和致癌性，受到歐盟、美國(guó)等的限用和禁用，目前正在研究開(kāi)發(fā)的代用增塑劑品種，包括對(duì)苯二甲酸酯[1]。本文主要研究土壤中對(duì)苯二甲酸二 （2-乙基己基）酯的檢測(cè)方法，該法經(jīng)驗(yàn)證后也可適用于其他對(duì)苯二甲酸酯的檢測(cè)。對(duì)苯二甲酸二（2-乙基己基）酯是一種重要的增塑劑原料，類似于鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯的功能，廣泛應(yīng)用于軟質(zhì)聚氯乙烯及電纜料中，具有揮發(fā)性低、低溫下柔軟性好、耐水、耐油等特點(diǎn)[2]。

土壤中樣品提取方法主要有微波萃取（MAE）、超聲提?。║E）、索氏提取（SOX）、液液萃取 （LLE）、固相萃取 （SPE）和超臨界流體萃取（SFE）等[3-5]，這些方法存在萃取時(shí)間長(zhǎng)、有機(jī)溶劑用量大、操作過(guò)程復(fù)雜、實(shí)際應(yīng)用效果不理想等缺點(diǎn)。Ezzell等[6]在1995年提出了快速溶劑萃取法（ASE），具有萃取速度高，溶劑用量少，操作簡(jiǎn)單，使用方便靈活，操作安全可靠，萃取殘留少，該提取方法已被美國(guó)EPA3545收錄為處理固體樣品的標(biāo)準(zhǔn)方法之一[7]，目前廣泛應(yīng)用于土壤、沉積物和固體廢物中半揮發(fā)性有機(jī)物的樣品前處理[8-9]。我國(guó)于2016年3月將該方法納入到環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)（HJ 783-2016），該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了提取土壤和沉積物中有機(jī)物的加壓流體萃取方法[10]。我國(guó)于2017年9月實(shí)施的《土壤和沉積物 半揮發(fā)性有機(jī)物的測(cè)定 氣相色譜-質(zhì)譜法 HJ 834-2017》適用于測(cè)定土壤和沉積物中的鄰苯二甲酸酯類[11]，但該標(biāo)準(zhǔn)還沒(méi)有驗(yàn)證對(duì)苯二甲酸二（2-乙基己基）酯的檢測(cè)方法。

土壤中樣品凈化方法有硫酸磺化、氧化鋁柱、硅膠層析柱、硅酸鎂層析柱、凝膠滲透色譜凈化等[12-14]，適合于對(duì)苯二甲酸酯類的凈化方式有氧化鋁柱、硅酸鎂層析柱、凝膠滲透色譜。但氧化鋁柱凈化操作比較復(fù)雜、穩(wěn)定性不高[15]；凝膠滲透色譜凈化時(shí)間長(zhǎng)，儀器成本高[16]；硅酸鎂層析柱相對(duì)具有萃取效率高、應(yīng)用范圍廣泛，使用方便簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，所以本方法建議選擇硅酸鎂層析柱凈化樣品。目前在國(guó)內(nèi)主要應(yīng)用于鄰苯二甲酸酯類、有機(jī)氯農(nóng)藥、多環(huán)芳烴、苯胺類、亞硝基胺類、鹵代醚烴類等凈化處理。

筆者利用快速溶劑萃取-層析柱凈化-氣相色譜質(zhì)譜法測(cè)定土壤中DIOP的含量，該方法具有操作簡(jiǎn)單，速度快、提取效率高、凈化完全、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足土壤中DIOP的含量檢測(cè)要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

快速溶劑萃取儀：ASE-350型，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：QP2020 GC-MS型，日本島津科技公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：Rotavapor R-215型，瑞士步琦儀器公司；氮吹濃縮儀：N-EVAP112型，美國(guó)Oranomation公司；硅酸鎂層析柱：市售或自備填充填料；

對(duì)苯二甲酸二（2-乙基己基）酯標(biāo)準(zhǔn)品：純度98.2%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；菲-d10標(biāo)準(zhǔn)液：濃度為5000 mg/L，美國(guó)o2si公司；二氯甲烷、丙酮、正己烷均為農(nóng)殘級(jí)，甲醇為色譜級(jí)；無(wú)水硫酸鈉、乙醚均為優(yōu)級(jí)純；硅藻土、玻璃纖維濾膜等。

1.2 土壤樣品制備

將樣品放在陶瓷盤(pán)或不銹鋼盤(pán)上，除去土壤中的枝棒、葉片、石子等，自然干燥不影響分析目的時(shí)，可采用自然通風(fēng)干燥（也可采用冷凍干燥或無(wú)水硫酸鈉干燥），用球磨機(jī)研磨成細(xì)小顆粒，再過(guò)250μm（60目）的金屬篩，按照HJ/T 166進(jìn)行四分法取樣，裝入棕色玻璃瓶中，密封貼上標(biāo)簽，再放入冰箱中于-20℃冷凍保存，待用。

1.3 樣品前處理

1.3.1 快速溶劑的萃取

取洗凈的萃取池?cái)Q緊底蓋，將專用的玻璃纖維濾膜裝入其底部，頂部放置專用漏斗，先加入少許硅藻土，再加入事先稱好的10.00 g土壤樣品（如需內(nèi)標(biāo)菲-d10一并加入試樣中），最后再用硅藻土混合輕微搖晃，將其兩端壓實(shí)密封好，移去漏斗，擰緊頂蓋。將其豎直平穩(wěn)放入快速溶劑萃取儀樣品盤(pán)上。用合適的萃取溶劑進(jìn)行加壓流體萃取，萃取結(jié)束后，收集萃取液。（快速溶劑萃取條件設(shè)置：萃取壓力：1600 psi（約為 11.0336 MPa）；預(yù)萃取平衡：5 min；靜態(tài)萃取時(shí)間：5 min；萃取溫度：100℃；沖洗體積：為萃取池溶劑的60%；靜態(tài)循環(huán)次數(shù)：2次。）

1.3.2 硅酸鎂柱的凈化

在凈化之前，將樣品萃取液濃縮至2 mL，并將提取液溶劑轉(zhuǎn)換為正己烷。用40～60 mL正己烷預(yù)淋洗凈化柱（洗脫速度2 mL/min），棄去這部分洗脫液，在柱上端加入約2 g銅粉，再加入10 mL正己烷至剛好浸沒(méi)銅粉時(shí)關(guān)閉活塞。定量轉(zhuǎn)移2 mL樣品萃取液至柱上，再用2 mL正己烷清洗并完成轉(zhuǎn)移，打開(kāi)活塞，當(dāng)銅粉層剛暴露于空氣中之前，加40 mL正己烷洗脫柱子，棄去此正己烷洗脫液。用100 mL乙醚-正己烷混合溶劑（20+60）洗脫柱子，收集全部流出液，待用。

1.3.3 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮

先用無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)濾凈化流出液，將流出液放在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（旋轉(zhuǎn)速度120 r/min，溫度設(shè)定為 40℃，壓力為 3.85×104Pa）上濃縮至2 mL，并用少量二氯甲烷-丙酮混合溶劑將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶底部沖洗2次，再將全部的濃縮液轉(zhuǎn)移到氮吹儀的定量濃縮管中，再用氮吹濃縮至1 mL，供分析。

1.4 儀器工作條件

1.4.1 色譜

色譜柱：SH-Rxi-5Sil MS型色譜柱 （30 mm×0.25 mm×0.25 μm）；柱流量：0.95 mL/min，流量控制方式：線速度（36 cm/s）；吹掃流量：3 mL/min；進(jìn)樣口溫度：270℃；進(jìn)樣時(shí)間：1 min；進(jìn)樣體積：1μL；不分流進(jìn)樣；升溫程序：初始溫度為80℃，保持1 min，以25℃/min速率升溫至270℃，保持8 min。

1.4.2 質(zhì)譜

離子化方式：EI離子源；采集方式：SCAN；掃描范圍：45～450 m/z；掃描間隔：0.30 s；定量方式：目標(biāo)離子（m／z）為 149，定性離子為 167，261；溶劑延遲：4.5 min；離子源溫度：230℃；接口溫度：280℃。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液和工作溶液的制備

1.5.1 DIOP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的制備

準(zhǔn)確稱取0.0453 g的DIOP純品放置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋定容至刻度線，搖勻，制得相應(yīng)質(zhì)量濃度為4448μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，并于4℃冰箱中避光保存，有效期為3個(gè)月。

1.5.2 DIOP中間儲(chǔ)備溶液的制備

準(zhǔn)確移取1.124 mL DIOP儲(chǔ)備液 （4448μg/mL）用甲醇溶解稀釋并定容至5 mL容量瓶中，搖勻，制得濃度為1000μg/mL的中間儲(chǔ)備液，并于4℃冰箱中避光保存，有效期為1個(gè)月。

1.5.3 內(nèi)標(biāo)菲-d10中間儲(chǔ)備溶液的制備

準(zhǔn)確移取1 mL菲-d10標(biāo)液 （5000 mg/L）置于5 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容搖勻，制得濃度為1000μg/mL的中間儲(chǔ)備液，于4℃冰箱中避光保存，有效期為1個(gè)月。

1.5.4 DIOP的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備

分別準(zhǔn)確移取 10μL、20μL、50 μL、100μL、200μL、500μL的 DIOP中間儲(chǔ)備液 （1000μg/mL）于10 mL容量瓶中，依次加入50μL內(nèi)標(biāo)菲-d10儲(chǔ)備液（1000μg/mL）混勻，用二氯甲烷稀釋定容至標(biāo)線，配制成濃度依次為1.0μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL、50.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列，取1.00 mL上述標(biāo)準(zhǔn)系列于2 mL進(jìn)樣瓶中，以1.0μL進(jìn)樣體積分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的選擇

2.1.1 快速溶劑萃取條件

加壓溶劑萃取效果主要通過(guò)萃取溫度、萃取溶劑和在萃取池中添加吸附劑三者的有效結(jié)合來(lái)完成。本文分別對(duì)萃取溫度80℃，100℃，120℃進(jìn)行試驗(yàn)，可得出DIOP回收率分別為75.8%、91.2%、94.5%，故萃取池溫度設(shè)定為100℃。分別對(duì)二氯甲烷、丙酮、二氯甲烷+丙酮三種萃取溶劑進(jìn)行試驗(yàn)，可得出DIOP的回收率分別為86.3%、90.4%、89.7%，雖然丙酮的萃取回收率高，但考慮到其易制毒性，故仍選擇二氯甲烷和丙酮（1∶1）作為萃取劑；同時(shí)選擇在萃取池中加入硅藻土和無(wú)水硫酸鈉作為吸附劑，可大大提高其萃取效率，弗羅里硅藻土填料對(duì)樣品中的極性雜質(zhì)有很強(qiáng)的吸附作用，可以有效地去除土壤中的干擾物質(zhì)[16]；在萃取池中加入銅粉，可起到在萃取液里達(dá)到脫硫效果。

2.1.2 萃取液濃縮方法

目前濃縮技術(shù)主要有KD濃縮、氮?dú)獬簼饪s、負(fù)壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、負(fù)壓平行震蕩濃縮和負(fù)壓結(jié)合氮吹濃縮等幾種方式。本實(shí)驗(yàn)選擇負(fù)壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮和氮吹濃縮相結(jié)合的方法，旋轉(zhuǎn)濃縮設(shè)定轉(zhuǎn)速為120 r/min，負(fù)壓設(shè)定為3.85×104Pa，水浴溫度為40℃，溶劑置換氮吹濃縮，水浴溫度控制在35℃，氮吹速度維持液面處于輕微的波動(dòng)下為宜。經(jīng)驗(yàn)證，這兩種濃縮方式相結(jié)合的方法，即能提高濃縮萃取液的速度，節(jié)省時(shí)間，又能提高濃縮后目標(biāo)物的回收率，DIOP可達(dá)90%以上的回收率。

2.1.3 樣品凈化方法

參考環(huán)境保護(hù)部頒布的HJ 834-2017標(biāo)準(zhǔn)、美國(guó)EPA8270D中的柱凈化法[17]，根據(jù)吸附劑不同和洗脫溶劑不同會(huì)有很多種凈化方法。其中多種方法凈化結(jié)果均不理想，有的是吸附雜質(zhì)的能力差，有的雜質(zhì)會(huì)隨著淋洗液與目標(biāo)物一起被洗脫，有的是目標(biāo)物被吸附導(dǎo)致難以洗脫。最終通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)，硅酸鎂柱凈化對(duì)DIOP較為適合，DIOP的回收率達(dá)到85%以上，故選擇硅酸鎂柱凈化。

2.2 色譜條件的設(shè)定過(guò)程

色譜條件的設(shè)定主要取決于樣品的進(jìn)樣量、進(jìn)樣口的溫度以及柱溫的升溫程序，本文對(duì)進(jìn)樣量 1μL、2μL、5μL進(jìn)行試驗(yàn)，得到 DIOP的回收率分別為82.5%、83.9%、85.5%；分別對(duì)進(jìn)樣口溫度為260℃，270℃，280℃進(jìn)行試驗(yàn)，得到DIOP的回收率分別為78.5%、80.1%、84.5%；重復(fù)試驗(yàn)優(yōu)化柱箱溫度的升溫程序，考慮到進(jìn)樣體積太大，會(huì)產(chǎn)生溶劑效應(yīng)，易阻止樣品的解析和造成色譜柱的污染，結(jié)合樣品的分析時(shí)間和分離度，故最終設(shè)定進(jìn)樣體積：1μL；進(jìn)樣口溫度：270℃；初始溫度為80℃，保持1 min，以25℃/min速率升溫至270℃，保持8 min。因樣品中DIOP的含量一般不是很高，故選擇不分流進(jìn)樣，最大程度地達(dá)到較低的檢出限。

2.3 質(zhì)譜條件的設(shè)定過(guò)程

掃描方式的選擇是質(zhì)譜條件設(shè)置的關(guān)鍵，全掃描方式（SCAN）能夠適用于基質(zhì)復(fù)雜的樣品定性定量地分析，選擇性掃描方式（SIM）能夠達(dá)到更低的檢出限，本文考慮到實(shí)際樣品分析過(guò)程中，存在干擾和雜質(zhì)峰，故選擇全掃描方式（SCAN），掃描質(zhì)量數(shù)范圍：35～500 u；定量方式：定量離子（m／z）為 149。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

采用內(nèi)標(biāo)法定量，得到DIOP標(biāo)準(zhǔn)濃度系列與內(nèi)標(biāo)菲-d10（5μg/mL）的響應(yīng)值與面積比，響應(yīng)值定義為目標(biāo)離子的質(zhì)譜峰面積，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 DIOP標(biāo)準(zhǔn)濃度系列與菲-d10的響應(yīng)值與面積比

圖1 DIOP和菲-d10的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖與濃度比

DIOP標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與內(nèi)標(biāo)的濃度比為橫坐標(biāo)，以待測(cè)物質(zhì)目標(biāo)離子響應(yīng)值與內(nèi)標(biāo)目標(biāo)離子面積比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。DIOP的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性濃度范圍為0～50μg/mL，線性回歸方程Y=0.2499X，R=0.9965。

根據(jù)儀器最低可檢出DIOP的濃度或含量，按照HJ 168-2010《環(huán)境檢測(cè) 分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則》確定檢出限的方法，重復(fù)7次試驗(yàn)操作空白加標(biāo)樣品，將個(gè)測(cè)定結(jié)果換算為樣品種的濃度或含量，得出其標(biāo)準(zhǔn)偏差，計(jì)算本方法的檢出限為0.03 mg/kg，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 方法的檢出限結(jié)果（n=7）

2.5 質(zhì)譜色譜峰分析譜圖

用全掃描方式（SCAN）掃描得到總離子流圖（TIC），DIOP和菲-d10保留時(shí)間分別為8.971 min，14.615 min，見(jiàn)圖2。DIOP的質(zhì)譜圖確定定量離子（m／z）為 149，定性離子（m／z）為 167，261，見(jiàn)圖 3。菲-d10的質(zhì)譜圖確定（內(nèi)標(biāo)物）定量離子（m／z）為188，見(jiàn)圖 4。

圖2 DIOP和內(nèi)標(biāo)菲-d10（物）的TIC圖

圖3 DIOP離子質(zhì)譜圖

圖4 菲-d10（內(nèi)標(biāo)物）離子質(zhì)譜圖

2.6 方法的精密度和準(zhǔn)確度

稱量10.00 g制備好的土壤樣品，經(jīng)驗(yàn)證測(cè)定土壤本底值未檢出目標(biāo)物，可作為加標(biāo)基體樣品。在相同的條件下對(duì)空白土壤樣品分別進(jìn)行不同濃度的加標(biāo)試驗(yàn)，驗(yàn)證方法的精密度和準(zhǔn)確性。用同一臺(tái)設(shè)備和儀器條件下測(cè)定土壤樣品中的DIOP含量，分別稱取18份10.00 g土壤樣品，每6份分別加入低、中、高含量依次為0.16μg、1.00μg、2.00μg DIOP標(biāo)液后混勻試樣，按樣品前處理方法萃取、凈化樣品，濃縮定容后上機(jī)分析，測(cè)定基體加標(biāo)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）和平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表3，該相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差可認(rèn)為符合樣品前處理方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，該平均回收率結(jié)果可認(rèn)為符合土壤有機(jī)物檢測(cè)的加標(biāo)回收率質(zhì)量控制要求（70%～130%）。

由表3可知，三個(gè)水平加標(biāo)回收率為75.0%～116.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.55%～6.55%之間。所以本方法測(cè)定的方法精密度和準(zhǔn)確度分別滿足：質(zhì)控要求RSD≤15%，加標(biāo)回收率符合在70%～130%之間。

表3 方法的精密度和準(zhǔn)確度（n=6）

2.7 樣品分析

按本方法操作對(duì)某制藥廠附近的土壤樣品采集、預(yù)處理、萃取、凈化、濃縮及定容等，平行樣測(cè)定結(jié)果RSD均小于15%，符合檢測(cè)質(zhì)量控制和質(zhì)量保證，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 實(shí)際樣品中檢測(cè)DIOP的含量（mg/kg）

3 結(jié)論

土壤中的對(duì)苯二甲酸二（2-己基乙基）酯經(jīng)快速溶劑萃取儀ASE-350萃取，經(jīng)硅酸鎂層析柱凈化，采用全掃描方式采集-氣相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行定性定量測(cè)定。該方法具有萃取效果好，靈敏度高，重現(xiàn)性好，前處理操作簡(jiǎn)便及純化效果好等優(yōu)點(diǎn)。所以可用于分析土壤中DIOP含量的測(cè)定。