枯草芽胞桿菌B006產(chǎn)表面活性素的培養(yǎng)條件優(yōu)化

王軍強(qiáng)王連國郭榮君馬桂珍李世東

（1. 淮海工學(xué)院化工學(xué)院，連云港 222005；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193）

枯草芽胞桿菌B006產(chǎn)表面活性素的培養(yǎng)條件優(yōu)化

王軍強(qiáng)1，2王連國1郭榮君2馬桂珍1李世東2

（1. 淮海工學(xué)院化工學(xué)院，連云港 222005；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193）

芽胞桿菌產(chǎn)生的環(huán)脂肽類生物表面活性素surfactin具有重要抗菌、促進(jìn)生物膜形成等功能，其含量和同系物組分構(gòu)成影響其功能。為了提高芽胞桿菌B006產(chǎn)生表面活性素的產(chǎn)量，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，測定了碳源、氮源和無機(jī)鹽等營養(yǎng)物質(zhì)及接種量、培養(yǎng)時(shí)間、裝液量和初始pH值對芽胞桿菌B006搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生表面活性素的影響；采用排油圈法測定發(fā)酵液中表面活性素的產(chǎn)量，采用HPLC-MS方法比較培養(yǎng)基優(yōu)化前后surfactin的產(chǎn)量和組分含量。結(jié)果表明，適合芽胞桿菌B006搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生表面活性素的培養(yǎng)基組成為：牛肉膏10 g/L 、玉米粉15 g/L、硝酸銨3 g/L 和氯化鈉3 g/L；適合的培養(yǎng)條件為：初始pH值7.0、接種量10%、裝液量60 mL/500 mL，發(fā)酵周期64 h。優(yōu)化后surfactin的產(chǎn)量約為314.73 mg/L，比優(yōu)化前提高了74.88%；surfactin各組分比例發(fā)生改變，其中C16和C17組分的含量明顯提高，為優(yōu)化前相應(yīng)組分含量的1.64和8.34倍。優(yōu)化的培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件可明顯提高芽胞桿菌B006菌株產(chǎn)生surfactin的產(chǎn)量，改變surfactin同系物組分的構(gòu)成，為利用芽胞桿菌B006進(jìn)行高活性表面活性素的工業(yè)生產(chǎn)和代謝調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。

枯草芽胞桿菌；表面活性素；正交實(shí)驗(yàn)；排油圈法

表面活性素（surfactin）是一種由芽胞桿菌產(chǎn)生的環(huán)脂肽類生物表面活性劑，由親水的肽鏈和親油的脂肪烴鏈兩部分組成。作為表面活性素，surfactin在環(huán)境保護(hù)、食品、化妝品、微生物采油及植物病害防治等領(lǐng)域展現(xiàn)出重要的應(yīng)用潛力。表面活性素具有很好的抗菌功能［1-4］，其作用機(jī)理不同于抗生素，主要通過作用于微生物的脂膜抑制微生物的生長，不易使微生物產(chǎn)生抗藥性，被認(rèn)為是可替代抗生素的新型抗菌劑，因而在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有更大的應(yīng)用前景。但目前surfactin的生產(chǎn)成本較高、產(chǎn)量較低而阻礙了其廣泛應(yīng)用。通過發(fā)酵配方及發(fā)酵條件的優(yōu)化，降低surfactin的生產(chǎn)成本，成為提高其產(chǎn)率的重要手段。

發(fā)酵培養(yǎng)過程中的通氣量、pH、溫度等培養(yǎng)條件影響surfactin的產(chǎn)量［5，6］。氧氣傳遞和營養(yǎng)物的傳質(zhì)過程明顯影響surfactin產(chǎn)量［7］，而溫度不僅影響脂肽類抗生素的產(chǎn)量，還影響其成分組成。Ohno等［8］研究發(fā)現(xiàn)，25℃培養(yǎng)有利于枯草芽胞桿菌RB14產(chǎn)生伊枯草菌素iturin，而30℃培養(yǎng)時(shí)surfactin的產(chǎn)量最高。培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)對surfactin的產(chǎn)生影響更大。Yeh等［9］研究表明葡萄糖是影響ATCC 21332 surfactin產(chǎn)生的重要因素；孫立軍等［10］研究表明，枯草芽胞桿菌ES-2的最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為谷氨酸鈉；貢國鴻等［11］研究發(fā)現(xiàn)碳源為可溶性淀粉，氮源為硝酸鈉時(shí)最利于E8菌株產(chǎn)surfactin；劉桂萍等［12］發(fā)現(xiàn)以豆油和廢油為碳源、尿素為氮源時(shí)，菌株LH3的surfactin產(chǎn)量最高，以葡萄糖為碳源時(shí)最差；Davis等［13］研究了培養(yǎng)基中碳氮源對B. subtilis ATCC 21332產(chǎn)surfactin的影響，結(jié)果表明以硝酸銨為氮源時(shí)，surfactin的產(chǎn)量最高；另外Mg2+、Mn2+和 Fe2+等無機(jī)鹽離子對surfactin的產(chǎn)生也至關(guān)重要［14，15］。上述結(jié)果表明，不同菌株對營養(yǎng)物質(zhì)的需求不同，適合的培養(yǎng)條件也有所不同［16，17］。

Surfactin是由多組分組成的同系物，雖然有研究報(bào)道有機(jī)酸［18］、氨基酸等影響其組分［16］，但有關(guān)工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)碳氮源對surfactin組分的研究較少。芽胞桿菌B006是一株高效生防芽胞桿菌，對黃瓜枯萎病、辣椒疫霉病等病害具有較好的防治效果［19，20］。該菌主要通過營養(yǎng)競爭和產(chǎn)生脂肽類抗生素拮抗病原菌的侵染和繁殖，其中表面活性素surfactin是其產(chǎn)生的重要的脂肽類抗生素。前期研究表明，菌株B006在肉湯培養(yǎng)液中和植物根際可產(chǎn)生surfactin［19］，在以琥珀酸作為單一有機(jī)酸的根分泌物培養(yǎng)液中產(chǎn)生的surfactin同系物的組分比例發(fā)生改變，10 μmol/L時(shí)即可促進(jìn)芽孢桿菌B168生物膜的產(chǎn)生，而來源于肉湯培養(yǎng)液中的surfactin需要50 μmol/L才能達(dá)到同等效果［21］，因此獲得長鏈組分的surfactin更具有實(shí)際意義。本研究通過碳源、氮源和無機(jī)鹽等營養(yǎng)物質(zhì)的單因素和正交實(shí)驗(yàn)，獲得了適合的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，不僅提高了B006菌株發(fā)酵液中surfactin產(chǎn)量，而且surfactin 同系物中C16、C17組分含量也明顯升高，該結(jié)果為芽胞桿菌產(chǎn)生表面活性素的代謝調(diào)控研究和surfactin的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 枯草芽胞桿菌B. subtilis B006，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所分離、保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基（NA）：葡萄糖10 g、蛋白胨10 g、酵母浸粉1 g、牛肉浸膏3 g、瓊脂粉20 g、水1 000 mL，pH7.0。種子液培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、蛋白胨10 g、酵母浸膏3 g、牛肉浸膏3 g、水1 000 mL，pH7.0。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液中表面活性素含量的測定方法 采用排油圈法［22］測定。取發(fā)酵液10 mL，10 000 r/min離心10 min，保留上清液。另取一直徑9 cm的培養(yǎng)皿，加30 mL蒸餾水，在水面上滴入4 mL經(jīng)蘇丹Ⅲ染色的液體石蠟，在油膜中央滴加20 μL發(fā)酵液，觀察是否有排油圈產(chǎn)生，游標(biāo)卡尺測量排油圈的直徑。重復(fù)測定3次，取平均值。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)條件對B006菌株產(chǎn)生表面活性素的影響

1.2.2.1 接種量對B006產(chǎn)表面活性素的影響 將B006菌株在NA培養(yǎng)基上活化24 h，挑取一環(huán)菌體接種到裝有100 mL種子液的500 mL三角瓶中，30℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)16 h；調(diào)整菌液濃度為108CFU/mL，作為下一步發(fā)酵用種子液。分別按照1%、2%、5%和10%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵液中（葡萄糖10 g、蛋白胨10 g、酵母浸膏3 g、牛肉浸膏3 g、水1 L），30℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，測定發(fā)酵液的排油圈直徑。

1.2.2.2 培養(yǎng)時(shí)間對B006產(chǎn)表面活性素的影響 接種方法和培養(yǎng)條件同1.2.2.1。在發(fā)酵72 h內(nèi)，從接種開始，每隔8 h取樣一次，測定不同生長時(shí)間時(shí)，發(fā)酵液的排油圈直徑。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，取平均值。

1.2.2.3 裝液量對B006產(chǎn)表面活性素的影響 在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，測定裝液量（供氧量）對B006菌株產(chǎn)生表面活性素的影響。在250 mL 三角瓶中分別加入60、80、100、120和140 mL的培養(yǎng)液，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，30℃、180 r/min 震蕩培養(yǎng)64 h，測定發(fā)酵液的排油圈直徑，取平均值。

1.2.2.4 初始pH值對B006產(chǎn)表面活性素的影響 在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，使用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值到6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，測定不同pH 值對B006菌株產(chǎn)生表面活性素的影響，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)條件和表面活性素的測定方法同1.2.2.3。

1.2.3 營養(yǎng)物質(zhì)對B006菌株產(chǎn)表面活性素的影響 通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)，測定搖瓶培養(yǎng)條件下，不同營養(yǎng)物質(zhì)對B006菌株產(chǎn)生表面活性素的影響。接種量為10%（V/V），裝液量為100 mL/500 mL，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)64 h。

1.2.3.1 有機(jī)氮源對B006產(chǎn)表面活性素的影響 以5 g/L葡萄糖和10 g/L玉米淀粉為固定碳源，分別測定10 g/L蛋白胨、牛肉膏、豆餅粉、酵母浸粉、玉米漿干粉、棉籽餅粉、花生餅粉等有機(jī)氮源對B006產(chǎn)生表面活性素的影響。

1.2.3.2 碳源對B006產(chǎn)表面活性素的影響 以10 g/L牛肉膏為固定氮源，分別測定15 g/L葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、玉米粉、糖蜜等碳源對B006產(chǎn)生表面活性素的影響。

1.2.3.3 無機(jī)氮源對B006產(chǎn)表面活性素的影響 以15 g/L玉米粉為固定碳源，以10 g/L牛肉膏為固定氮源，分別測定5 g/L硝酸銨、氯化銨、硫酸銨和硝酸鈉等無機(jī)氮源對菌株B006產(chǎn)生表面活性素的影響。

1.2.3.4 無機(jī)鹽對B006產(chǎn)表面活性素的影響 在上述研究基礎(chǔ)上，分別添加3 g/L 氯化鈉、3 g/L 磷酸二氫鉀、3 g/L 碳酸鈣、0.2 g/L 硫酸鎂、0.2 g/L 硫酸錳等無機(jī)鹽［23-25］，測定不同無機(jī)鹽對B006產(chǎn)生表面活性素的影響。

1.2.3.5 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 根據(jù)1.2.3.1-1.2.3.4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇玉米粉為碳源，牛肉膏和硝酸銨為氮源，氯化鈉為無機(jī)鹽設(shè)計(jì)四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，如表1。測定不同因素對B006產(chǎn)生表面活性素的影響。

表1 因素水平表

1.2.4 發(fā)酵液中表面活性素含量和組分的HPLCESI-MS分析

1.2.4.1 粗提物的制備 將 B006菌株接種到裝有80 mL篩選培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，每處理3次重復(fù)。30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng) 72 h，離心獲得發(fā)酵液，以優(yōu)化前的培養(yǎng)基為對照。用HCl調(diào)節(jié)pH到2.0后放入4℃冰箱，酸沉淀。再次離心收集沉淀物。冷凍干燥得到粗提物。

1.2.4.2 HPLC-ESI-MS分析方法 將粗提物干物質(zhì)用色譜級甲醇溶解，過0.22 μm濾膜，用Waters液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行檢測，MassLynx軟件分析檢測結(jié)果。檢測條件參照楊琦瑤等［18］的方法，流動(dòng)相中三氟乙酸的含量為0.01%，檢測波長為214 nm。

1.2.4.3 數(shù)據(jù)處理和分析 以1 mg/mL的表面活性素surfactin標(biāo)準(zhǔn)品為參照，根據(jù)出峰時(shí)間和MS圖譜數(shù)據(jù)，采用MasslynxV4.1軟件對發(fā)酵液中surfactin各組分的峰面積進(jìn)行積分，計(jì)算B006菌株產(chǎn)生的surfactin 各組分含量及總量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)條件對B006菌株產(chǎn)生表面活性素的影響

2.1.1 接種量對B006產(chǎn)表面活性素的影響 接種量的大小明顯影響B(tài)006發(fā)酵終點(diǎn)表面活性素的含量（圖1）。接種量為1%時(shí)，發(fā)酵液的排油圈直徑較小，僅為23.70±0.57 mm。隨著接種量的增加，排油圈直徑逐步增大。當(dāng)接種量增加到10%時(shí)，排油圈直徑達(dá)到59.20±2.17 mm。

圖1 接種量對B006發(fā)酵液中表面活性素含量的影響

2.1.2 培養(yǎng)時(shí)間對B006產(chǎn)表面活性素的影響 隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵液的排油圈直徑逐漸增大（圖2），發(fā)酵培養(yǎng)至64 h時(shí)，排油圈直徑達(dá)最大，為58.66±2.08 mm。此后，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，排油圈直徑不再增大。因此最佳發(fā)酵時(shí)間為64 h。

圖2 培養(yǎng)時(shí)間對菌株B006產(chǎn)表面活性素的影響

2.1.3 裝液量對B006產(chǎn)表面活性素的影響 搖瓶裝量對菌株B006產(chǎn)表面活性素有顯著的影響。結(jié)果（圖3）表明，減少裝液量有利于發(fā)酵液中表面活性素的產(chǎn)生。當(dāng)裝液量為60 mL/500 mL時(shí)，發(fā)酵液排油圈直徑最大，為66.67±1.53 mm。隨著裝液量增多，排油圈直徑變小，當(dāng)裝液量增大到140 mL/500 mL時(shí)，發(fā)酵液排油圈直徑為47.00±1.73 mm。

圖3 搖瓶裝液量對菌株B006產(chǎn)表面活性素的影響

2.1.4 初始pH值對B006產(chǎn)表面活性素的影響 培養(yǎng)基初始pH明顯影響B(tài)006菌株的表面活性素產(chǎn)量。結(jié)果（圖4）表明，中性和微堿性條件有利于菌株B006表面活性劑的產(chǎn)生，適宜的初始pH值為7.0-7.5。pH為7.0時(shí)其發(fā)酵液的排油圈直徑最大，為67.33±1.15 mm。

圖4 初始pH值對菌株B006產(chǎn)表面活性素的影響

2.2 營養(yǎng)物質(zhì)對B006菌株產(chǎn)生表面活性素的影響

2.2.1 有機(jī)氮源對B006產(chǎn)表面活性素的影響 不同有機(jī)氮源對菌株B006產(chǎn)生表面活性素有明顯的影響。添加有機(jī)氮源牛肉膏、豆餅粉、酵母浸粉和花生餅粉可以明顯促進(jìn)表面活性素的產(chǎn)生，添加牛肉膏時(shí)表面活性素產(chǎn)量最高，排油圈直徑為60.67±3.06 mm（圖5）。

2.2.2 碳源對B006產(chǎn)表面活性素的影響 不同碳源對菌株B006產(chǎn)表面活性素有顯著的影響（圖6），以玉米淀粉和玉米粉為有機(jī)碳源，有利于菌株B006產(chǎn)生表面活性素；其中玉米粉作為碳源時(shí)，排油圈直徑最大，為56.67±2.08 mm，表明以玉米粉為碳源時(shí)產(chǎn)生的表面活性素的量最高。

圖5 有機(jī)氮源對B006產(chǎn)生表面活性素的影響

圖6 碳源對B006產(chǎn)生表面活性素的影響

2.2.3 無機(jī)氮源對B006產(chǎn)表面活性素的影響 從不同無機(jī)氮源對菌株B006產(chǎn)表面活性素的影響結(jié)果（圖7）可以看出，添加5 g/L的無機(jī)氮源對B006產(chǎn)表面活性素有顯著影響，添加硝酸銨和硝酸鈉可明顯促進(jìn)表面活性素的產(chǎn)生。

圖7 無機(jī)氮源對B006產(chǎn)表面活性素的影響

2.2.4 無機(jī)鹽對B006產(chǎn)表面活性素的影響 添加無機(jī)鹽對菌株B006產(chǎn)表面活性素有明顯影響（圖8）。添加3 g/L 氯化鈉明顯促進(jìn)表面活性素的產(chǎn)生，排油圈直徑最大，為62.00±0.56 mm；而添加硫酸鎂、碳酸鈣、磷酸二氫鉀和硫酸錳明顯抑制了表面活性素的產(chǎn)生，其中添加硫酸錳時(shí)的抑制作用最明顯。2.2.5 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 碳、氮源及無機(jī)鹽正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果如表2和表3。從表3的方差分析結(jié)果可以看出，牛肉膏、玉米粉、硝酸銨和氯化鈉這4個(gè)因素對芽胞桿菌B006產(chǎn)表面活性素的影響都極為顯著（P＜0.05），但其影響程度的大小有較大的差異。這四個(gè)因素對芽胞桿菌B006產(chǎn)表面活性素的影響作用的大小依次為：C＞A＞D＞B，即硝酸銨＞牛肉膏＞氯化鈉＞玉米粉。

圖8 無機(jī)鹽對B006產(chǎn)表面活性素的影響

表2 四因素三水平碳氮源正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)方差分析及統(tǒng)計(jì)分析考察A、B、C和D四因素在3個(gè)水平上的變化，得到芽胞桿菌B006產(chǎn)表面活性素的最佳培養(yǎng)基為：A2B2C1D2，即牛肉膏10 g/L、玉米粉15 g/L、硝酸銨3 g/L 和氯化鈉3 g/L。

由于優(yōu)選的最佳培養(yǎng)基組成未包括在正交設(shè)計(jì)表的9次試驗(yàn)中，故對其進(jìn)行驗(yàn)證。按A2B2C1D2配方進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，排油圈直徑為77.00±1.73 mm。可見，該優(yōu)化培養(yǎng)基產(chǎn)表面活性素量最高，可作為芽胞桿菌B006產(chǎn)表面活性素的最佳培養(yǎng)基。

表3 方差分析結(jié)果

2.3 培養(yǎng)基優(yōu)化前后發(fā)酵液中表面活性素的含量和組分

采用HPLC-MS方法對培養(yǎng)基配方優(yōu)化前后發(fā)酵液中表面活性素surfactin的含量進(jìn)行了測定，優(yōu)化前后surfactin的相對出峰時(shí)間分別為14.23-16.43 min和14.87-18.03 min（圖9），對其峰面積進(jìn)行積分，并與標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積進(jìn)行比較，可知培養(yǎng)基組分優(yōu)化后發(fā)酵液中surfactin的平均含量約為314.73 mg/L，比優(yōu)化前產(chǎn)量提高了74.88%（表4）；對質(zhì)譜圖中m/z分別為994、1008、1022、1036、1050和1064的surfactin各單一組分（C12-C17）所對應(yīng)的HPLC色譜圖中的峰面積進(jìn)行積分，計(jì)算各組分相對含量，用excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和作圖。結(jié)果（圖10）表明，surfactin同系物的組分構(gòu)成發(fā)生了變化，C14和C15組分減少，而C16和C17含量增加，C16和C17含量為優(yōu)化前的1.64倍和8.34倍。

3 討論

培養(yǎng)條件、營養(yǎng)物質(zhì)供給對芽胞桿菌表面活性素的產(chǎn)生具有明顯影響，但不同學(xué)者對不同菌株的研究結(jié)果不同［11-13］。獲得適合生防芽胞桿菌B006高產(chǎn)表面活性素的發(fā)酵條件和營養(yǎng)物質(zhì)配比對提高其表面活性素產(chǎn)量具有重要實(shí)際意義。表面活性素surfactin由多種同系物組成，組分中碳鏈越長，與細(xì)胞脂雙層膜的結(jié)合能力越強(qiáng)，抗菌作用也更強(qiáng)［26］。而且surfactin C16組分比例升高后，在10 μmol/L時(shí)對芽胞桿菌生物膜形成的促進(jìn)作用與50 μmol/L 正常組分比例的surfactin的促進(jìn)作用相當(dāng)［21］。通過優(yōu)化培養(yǎng)基，獲得長鏈surfactin組分具有更重要的意義。

圖9 Surfactin標(biāo)準(zhǔn)品（A）和優(yōu)化前后（B、C）發(fā)酵液提取物的HPLC圖譜

表4 培養(yǎng)基組分優(yōu)化前后發(fā)酵液中surfactin的含量

圖10 培養(yǎng)基組分優(yōu)化前后發(fā)酵液中surfactin各組分含量

本研究通過碳源、氮源和無機(jī)鹽等營養(yǎng)物質(zhì)的單因素和正交篩選實(shí)驗(yàn)，獲得適合芽胞桿菌B006搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生表面活性素的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。HPLC-MS分析發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基優(yōu)化后，不僅surfactin的產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了74.88%，而且surfactin C16和C17組分比例明顯提高。Surfactin含量和長鏈組分含量的增加不僅增強(qiáng)了其表面活性張力，使排油圈直徑增大，而且可能有利于促進(jìn)芽胞桿菌生物膜的形成和芽胞桿菌的定殖［21，26］，對提高芽胞桿菌防病效果具有重要意義。關(guān)于碳源、氮源對surfactin組分含量的影響，前人研究報(bào)道，琥珀酸可提高surfactin C12、C14和C16 組分的比例［18，21］，而氨基酸對surfactin的組分構(gòu)成也有一定影響［16，27］。本研究發(fā)現(xiàn)添加玉米粉并提高牛肉膏的含量利于surfactin C16 和C17組分的產(chǎn)生，推測與玉米粉分解后糖類以及牛肉膏分解后氨基酸含量有關(guān)，相關(guān)影響機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

關(guān)于無機(jī)氮源對芽胞桿菌表面活性素產(chǎn)生的影響，本研究所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果基本一致，都發(fā)現(xiàn)硝酸鈉［11］和硝酸銨［13］為氮源時(shí)，芽胞桿菌產(chǎn)生表面活性素的量較高。硝酸銨相對于其他無機(jī)氮源更有利于脂肽類表面活性素的產(chǎn)生的原因，可能是由于培養(yǎng)環(huán)境缺氧時(shí)，菌體利用硝酸鹽，通過其他途徑合成surfactin［13］，有效延長了菌體合成脂肽類生物表面活性素的時(shí)間，從而增加了表面活性素的產(chǎn)量。

Deshpande等［29］發(fā)現(xiàn)Mn2+是生物體內(nèi)同化無機(jī)氮最關(guān)鍵的一種酶——谷氨酰胺合成酶最主要的輔因子，能夠與Mg2+協(xié)同作用，提高Bacillus subtilis胞內(nèi)谷氨酰胺合成酶的活性，促進(jìn)微生物對氮源的利用，進(jìn)而影響脂肽的產(chǎn)量。但不同學(xué)者關(guān)于無機(jī)鹽對芽胞桿菌表面活性素產(chǎn)生的影響的研究結(jié)果不盡相同。朱玲燕等［16］在研究培養(yǎng)基組分對枯草芽胞桿菌BS-37產(chǎn)表面活性素的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)添加Mg2+能促進(jìn)表面活性素總產(chǎn)量，而添加Ca2+和Mn2+會抑制表面活性素surfactin的產(chǎn)生；但也有其他研究報(bào)道添加硫酸錳能明顯促進(jìn)表面活性素的產(chǎn)生［14，28］。本研究中NaCl明顯促進(jìn)表面活性素的產(chǎn)生，碳酸鈣和硫酸錳抑制表面活性素的產(chǎn)生，與朱玲燕研究結(jié)果一致，而與Wei等［14］和Huang等［28］研究結(jié)果相反；關(guān)于硫酸鎂的研究結(jié)果與朱玲燕研究結(jié)果相反。研究結(jié)果的差異可能與菌株本身特性以及培養(yǎng)基組分中無機(jī)氮源的種類和含量有關(guān)，有關(guān)硫酸鎂和硫酸錳對不同菌株產(chǎn)生表面活性素的影響差異機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究獲得了適合芽胞桿菌B006菌株在搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生表面活性素的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，并發(fā)現(xiàn)玉米粉和牛肉膏可促進(jìn)surfactin C16和C17組分的產(chǎn)生，為提高菌株B006表面活性素的產(chǎn)量以及開展芽胞桿菌B006產(chǎn)生表面活性素的代謝調(diào)控研究提供了基礎(chǔ)，對指導(dǎo)工業(yè)化生產(chǎn)具有更高抗菌活性的surfactin具有重要實(shí)際意義。

4 結(jié)論

表面活性素surfactin 是由芽胞桿菌產(chǎn)生的重要的環(huán)脂肽類生物表面活性劑，牛肉膏、玉米粉、硝酸銨、氯化鈉以及裝液量明顯促進(jìn)芽胞桿菌B006表面活性素surfactin的產(chǎn)生，提高surfactin產(chǎn)量和長鏈組分C16和C17的含量。

［1］Das P, Mukherjee S, Sen R. Antimicrobial potential of a lipopeptide biosurfactant derived from a marine Bacillus circulans［J］. Journal of Applied Microbiology, 2008, 104（6）：1675-1684.

［2］Lee JH, Nam SH, Seo WT, et al. The production of surfactin during the fermentation of eheonggukjang by potential probiotic Bacillus subtilis CSYl91 and the resultant growth suppression of MCF-7 human breast cancer cells［J］. Food Chemistry, 2012, 131（4）：1347-1354.

［3］Ongena M, Jourdan E, Adam A, et al. Surfactin and fengycin lipopeptides of Bacillus subtilis as elicitors of induced systemic resistance in plants［J］. Environmental Microbiology, 2007, 9（4）：1084-1090.

［4］Deravel J, Lemiere S, Coutte F, et al. Mycosubtilin and surfactin are efficient, low ecotoxicity molecules for the biocontrol of lettuce downy mildew［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98（14）：6255-6264.

［5］Yeh MS, Wei YH, Chang JS. Bioreactor design for enhanced carrierassisted surfactin production with Bacillus subtilis［J］. Process Biochem, 2006, 41：1799-1805.

［6］Sameh F, Krasimir D, Frederique G, et al. Impact of energy supply and oxygen transfer on selective lipopeptide production by Bacillus subtilis BBG21［J］. Bioresource Technol, 2012, 126：1-6.

［7］羅星榮, 陳小龍. Surfactin發(fā)酵生產(chǎn)及應(yīng)用研究進(jìn)展［J］. 發(fā)酵科技通訊, 2014, 43（8）：14-18.

［8］Ohno A, Aao T, Shoda M. Effect of temperature on production of lipopeptide antibiotics, iturin A and surfactin by a dual producer, Bacillus subtilis RB14, in solid-state fermentation［J］. Journal of Fermentation and Bioengineering, 1995, 80：517-519.

［9］Yeh MS, Wei YH, Chang JS. Enhanced production of surfactin from Bacillus subtilis by addition of solid carriers［J］. Biotechnology Progress, 2005, 21（4）：1329-1334.

［10］孫力軍, 陸兆新, 別小妹, 等. 培養(yǎng)基對解淀粉芽孢桿菌ES-2菌株產(chǎn)抗菌脂肽的影響［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 41（10）：3389-3398.

［11］貢國鴻, 劉清梅, 袁成凌, 等. 生物表面活性劑surfactin菌株選育及發(fā)酵調(diào)控. 中國工程院化工冶金與材料工程學(xué)部第六屆學(xué)術(shù)會議［A］. 2007, 311-319.

［12］劉桂萍, 劉巍巍, 劉文杰, 等. 生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化［J］. 環(huán)境保護(hù)科學(xué), 2011, 37（6）：12-15.

［13］Davis DA, Lynch HC, Varley J. The production of surfactin in batch culture by Bacillus subtilis ATCC 21332 is strongly influenced by the conditions of nitrogen metabolism［J］. Enzyme and Microbial Technology, 1999, 25（3）, 322-329.

［14］Wei YH, Chu IM. Mn2+improves surfactin production by Bacillus subtilis［J］. Biotechnology Letters, 2002, 24（6）：479-482.

［15］Wei YH, Wang LF, Chang J S. Optimizing iron supplement strategies for enhanced surfactin production with Bacillus subtilis［J］. Biotechnol Progess, 2004, 20（3）：979-983.

［16］朱玲燕, 劉強(qiáng), 劉洋, 等. 培養(yǎng)基組分對枯草芽胞桿菌產(chǎn)表面活性素的影響［J］. 生物加工過程, 2015, 13（5）：8-13.

［17］張卉, 郝國良, 徐俊斌. 生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化［J］. 沈陽師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2011, 29（2）：293-296.

［18］Nihorimbere V, Cawoy H, Seyer A, et al. Impact of rhizosphere factors on cyclic lipopeptide signature from the plant beneficial strain Bacillus amyloliquefaciens S499［J］. FEMS Microbiology Ecology, 2012, 79：176-191.

［19］楊琦瑤, 索雅麗, 郭榮君, 等. 枯草芽孢桿菌B006對黃瓜枯萎病菌和辣椒疫霉病菌的抑制作用及其抗菌組分分析［J］.中國生物防治學(xué)報(bào), 2012, 02：235-242.

［20］賈珂, 李世東, 劉桂君, 等. 枯草芽孢桿菌B006產(chǎn)surfactin突變株特性及其對黃瓜枯萎病的抑制能力［J］. 中國生物防治學(xué)報(bào), 2013, 04：538-546.

［21］高毓晗. 產(chǎn)surfactin枯草芽胞桿菌B168重組菌株構(gòu)建及其對黃瓜枯萎病的控制作用［D］. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院, 2015.

［22］張凡, 佘躍惠. 排油圈法對生物表面活性劑的定性與定量［J］.化學(xué)工程師, 2005, 19（1）：14-15.

［23］洪鵬, 安國棟, 胡美英, 等. 解淀粉芽孢桿菌HF-01發(fā)酵條件優(yōu)化［J］. 中國生物防治學(xué)報(bào), 2013, 04：569-578.

［24］ 張麗霞. 枯草芽孢桿菌B908發(fā)酵工藝優(yōu)化研究［D］. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

［25］尹望, 杜志琳. 豬源枯草芽孢桿菌HEW-B113的鑒定及發(fā)酵工藝優(yōu)化［J］. 飼料研究, 2014, 23：20-24, 36.

［26］Henry G, Deleu M, Jourdan E, et al. The bacterial lipopeptide surfactin targets the lipid fraction of the plant plasma membrane to trigger immune-related defence responses［J］. Cellular Microbiology, 2011, 13（11）：1824-1837.

［27］Liu JF, Yang J, Yang SZ, et al. Effects of different amino acids in culture media on surfactin variants produced by Bacillus subtilis TD7［J］. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2012, 166（8）：2091-2100.

［28］Huang XF, Liu JN, Wang YH, et al. The positive effects of Mn2+on nitrogen use and surfactin production by Bacillus subtilis ATCC 21332［J］. Biotechnology and Biotechnological Equipment, 2015, 29（2）：381-389.

［29］Deshpande KL, Katze J, Kane J F. Effect of glutamine on enzymes of nitrogen metabolism in Bacillus subtilis［J］. Journal of Bacteriology, 1981, 145（2）：768-774.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Optimization of Culture Conditions for the Enhancement of Surfactin Production from Bacillus substilis B006

WANG Jun-qiang1，2WANG Lian-guo1GUO Rong-jun2MA Gui-zhen1LI Shi-dong2
（1. School of Chemical Engineering，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005；2. Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193）

Bio-surfactin produced by Bacillus spp. is one kind of cyclic lipopetide with important antibiotic and biofilm-promoting functions，and the amount and component constitution affect its functions. In order to improve its production from Bacillus strain B006，the liquid culture medium and fermentation conditions were optimized by single-factor experiment and orthogonal experiment，and the effects of carbon source，nitrogen source，inorganic salts，and other nutrients，as well as inoculation，incubation time，liquid volume and initial pH value on surfactin production of Bacillus B006 in shake flask were investigated. The surfactin amount in fermentation broth was determined by the oil dispersing activity in the optimal tests，and its amount as well as component constitution were finally analyzed and determined by HPLC-MS method. Results showed that，the optimized culture mediums of surfactin production were as follows：beef extract 10 g/L，corn flour 15 g/L，NH4N033 g/L，and NaCl 3 g/L. The optimized fermentation conditions for surfactin production in shaking flask were as follows：initial pH7.0，the inoculation ratio 10%，volume in shake flask 60 mL/500 mL，and culture time 64 h. Under the optimal culture medium and fermentation conditions，the surfactin amount reached 314.73 mg /L，with an improvement of 74.88%，and the amount of surfactin components C16 and C17 increased obviously，raised by 1.64 and 8.34 times，in comparison with no optimization. In a conclusion，under optimized medium components and culture conditions，the surfactin production from Bacillus strain B006 is improved and its component constitution change. All the above results lay a foundation for surfactin production in large scale and further research in metabolic and regulation of surfactin produced by strain B006.

Bacillus substilis；surfactin amount；orthogonal experiment；oil dispersing activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.028

2016-11-4

國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目（CARS-25-B-02），作物根腐病綜合治理技術(shù)方案（201503112），江蘇省農(nóng)業(yè)廳現(xiàn)代農(nóng)業(yè)項(xiàng)目（BE2016335）

王軍強(qiáng)，男，碩士研究生；E-mail：wangjq0726@163.com

，郭榮君，女，副研究員，研究方向：生物防治病害；E-mail：guorj20150620@126.com